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स्पाइक और एनएसपी6 SARS-CoV के प्रमुख निर्धारक हैं -2 ओमीक्रॉन BA.1 क्षीणन

Dec 18, 2023

SARS-CoV-2 अब तक पहचाने गए अन्य प्रमुख वायरल वेरिएंट की तुलना में ओमिक्रॉन वैरिएंट अधिक प्रतिरक्षा प्रतिरोधी और कम विषैला है। ओमिक्रॉन स्पाइक (एस) प्रोटीन, जिसमें असामान्य रूप से बड़ी संख्या में उत्परिवर्तन होते हैं, को इन फेनोटाइप का मुख्य चालक माना जाता है। यहां हमने पैतृक SARS-CoV -2 आइसोलेट की रीढ़ की हड्डी में ओमिक्रॉन (BA.1 वंश) के एस जीन को एन्कोडिंग करके काइमेरिक रीकॉम्बिनेंट SARS-CoV -2 उत्पन्न किया, और इस वायरस की तुलना प्राकृतिक रूप से प्रसारित ओमिक्रॉन से की। वैरिएंट. ओमिक्रॉन एस-बेयरिंग वायरस वैक्सीन-प्रेरित ह्यूमरल इम्युनिटी से मजबूती से बच गया, मुख्य रूप से रिसेप्टर-बाइंडिंग मोटिफ में उत्परिवर्तन के कारण; हालाँकि, प्राकृतिक रूप से पाए जाने वाले ओमीक्रॉन के विपरीत, यह कोशिका रेखाओं और प्राथमिक-जैसे डिस्टल फेफड़ों की कोशिकाओं में कुशलता से दोहराया गया। इसी तरह, K18-hACE2 चूहों में, हालांकि वायरस युक्त ओमिक्रॉन एस ने पैतृक वायरस की तुलना में कम गंभीर बीमारी पैदा की, लेकिन इसकी विषाक्तता ओमिक्रॉन के स्तर तक कम नहीं हुई। आगे की जांच से पता चला कि एस प्रोटीन के अलावा गैर-संरचनात्मक प्रोटीन 6 (एनएसपी 6) को बदलना ओमिक्रॉन के क्षीण फेनोटाइप को दोबारा बनाने के लिए पर्याप्त था। यह इंगित करता है कि यद्यपि ओमिक्रॉन का टीका एस में उत्परिवर्तन द्वारा संचालित होता है, ओमिक्रॉन की रोगजनकता एस प्रोटीन के अंदर और बाहर दोनों उत्परिवर्तन द्वारा निर्धारित होती है।

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सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

दिसंबर 2022 तक, कोविड महामारी की क्रमिक लहरें पांच प्रमुख SARS-CoV वेरिएंट द्वारा संचालित हैं, जिन्हें चिंता के वेरिएंट (वीओसी) के रूप में जाना जाता है: अल्फा (बी.1.1.7) , बीटा (बी.1.351), गामा (पी.1), डेल्टा (बी.1.617.2 और एवाई वंश) और ओमीक्रॉन (बीए वंश)13। ओमीक्रॉन सबसे हाल ही में मान्यता प्राप्त वीओसी है, और इसे पहली बार दक्षिण अफ्रीका, बोत्सवाना में और नवंबर 2021 में हांगकांग में दक्षिण अफ्रीका के एक यात्री द्वारा प्रलेखित किया गया था (जीआईएसएआईडी आईडी: ईपीआई _ आईएसएल _7605742)14, 15. यह तेजी से दुनिया भर में फैल गया, पहले से प्रभावी डेल्टा संस्करण को कुछ ही हफ्तों में विस्थापित कर दिया और जनवरी 2022 तक अधिकांश नए SARS-CoV -2 संक्रमणों का कारण बना (संदर्भ 16-18)। अब तक ओमिक्रॉन की कम से कम पांच वंशावली की पहचान की गई है: BA.1, BA.2, BA.3, BA.4, और BA.5। BA.1 (इसके बाद ओमीक्रॉन के रूप में संदर्भित) संक्रमण और वैक्सीन-प्रेरित ह्यूमरल इम्युनिटी3,19 से उल्लेखनीय बचाव दर्शाता है। इसके अलावा, यह मनुष्यों और संक्रमण के विवो मॉडल4,5,7,11,12,20 में अन्य वीओसी की तुलना में कम विषैला है। ओमिक्रॉन प्रोटोटाइप SARS-CoV-2 आइसोलेट, वुहान-हू-1 से 59 अमीनो एसिड से भिन्न है; इनमें से 37 परिवर्तन एस प्रोटीन में हैं, जिससे यह संभावना बढ़ जाती है कि एस ओमिक्रॉन के रोगजनक और एंटीजेनिक व्यवहार के केंद्र में है।

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सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

एस उत्परिवर्तन कोशिका संवर्धन में ओमिक्रॉन प्रतिकृति को प्रभावित करते हैं

ओमिक्रॉन एस प्रोटीन में वुहान-हू की तुलना में लंबाई में 3 अमीनो एसिड प्रतिस्थापन, 6 विलोपन और 3 अमीनो एसिड का एक सम्मिलन होता है (विस्तारित डेटा चित्र 1)। इनमें से पच्चीस परिवर्तन अन्य वीओसी के सापेक्ष ओमिक्रॉन के लिए अद्वितीय हैं, हालांकि उनमें से कुछ अपशिष्ट जल और मामूली SARS-CoV -2 वेरिएंट21,22 में रिपोर्ट किए गए हैं। ओमिक्रॉन फेनोटाइप में एस प्रोटीन की भूमिका का परीक्षण करने के लिए, हमने एक काइमेरिक पुनः संयोजक वायरस उत्पन्न किया जिसमें ओमिक्रॉन का एस जीन (यूएसए-एलएच01/2021) और पैतृक SARS-CoV के अन्य सभी जीन शामिल थे। {16}}आईएसएल_2732373)23 (विस्तारित डेटा चित्र 2ए)। ओमी-एस नाम का यह काइमेरिक वायरस सर्कुलर पोलीमरेज़ एक्सटेंशन रिएक्शन (सीपीईआर) 24 (विस्तारित डेटा चित्र 2 बी) के एक संशोधित रूप का उपयोग करके बनाया गया था, जिसमें 0.5 × 106 -5 × 106 प्लाक बनाने वाले अत्यधिक केंद्रित वायरस स्टॉक प्राप्त हुए थे। ट्रांसफ़ेक्शन के दो दिनों के भीतर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से इकाइयाँ (पीएफयू) प्रति एमएल, (विस्तारित डेटा छवि 2 सी, डी), जिससे आगे वायरल प्रवर्धन की आवश्यकता समाप्त हो जाती है।

Fig. 1 | Effect of S on the in vitro growth kinetics of Omicron. a Schematic of viruses. S, spike; N, nucleocapsid. b–e, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 cells (b,d) and Vero E6 cells (c,e) were infected at an MOI of 0.01, and the percentage of N-positive cells (n = 6 replicates) (b,c) and the release of infectious particles (n = 3 replicates) (d,e) were determined by flow cytometry and by plaque assay, respectively. f, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 cells were infected with virus mixtures at a 1:1 ratio to obtain the final MOI of 0.005 for each virus. The cells were fixed at the indicated times and subjected to flow cytometry. Left, representative dot plot; right, percentage of uninfected, Omi-S/mCherry-infected, Omicron/ mNeoGreen (Omicron/mNG)-infected and doubly infected cells. Singly infected cells were used for compensation. Error bars, mean ± s.d. (n = 3 replicates). g, Plaque sizes. Left, representative images of plaques on ACE2/TMPRSS2/ Caco-2 cells. Right, the diameter of plaques is plotted as the mean ± s.d. of 20 plaques per virus. h, Human iAT2 epithelial cells were infected at an MOI of 2.5 for 48 h or 96 h. The apical side of cells was washed with 1× phosphate-buffered saline (PBS) and the levels of infectious virus particles were measured by plaque assay. Error bars, mean ± s.d. (n = 4 replicates). Experiments were repeated twice, with each experimental repeat containing 3 (b–g) or 4 (h) replicates. P values were calculated by a two-tailed, unpaired t-test with Welch's correction. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 and ****P < 0.0001; NS, not significant. The gating strategy for flow cytometry is shown in Supplementary Fig. 1.


चित्र 1|ओमिक्रॉन के इन विट्रो ग्रोथ कैनेटीक्स पर एस का प्रभाव। वायरस की एक योजना. एस, स्पाइक; एन, न्यूक्लियोकैप्सिड। b–e, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 कोशिकाएँ (b,d) और वेरो E6 कोशिकाएँ (c,e) 0 के MOI पर संक्रमित हुईं। एन-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत (एन=6 प्रतिकृति) (बी,सी) और संक्रामक कणों की रिहाई (एन=3 प्रतिकृति) (डी,ई) प्रवाह साइटोमेट्री और प्लाक परख द्वारा निर्धारित किया गया था, क्रमश। f, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 कोशिकाओं को अंतिम MOI प्राप्त करने के लिए 1:1 के अनुपात में वायरस मिश्रण से संक्रमित किया गया था। 0। प्रत्येक वायरस के लिए 5। . कोशिकाओं को संकेतित समय पर तय किया गया और प्रवाह साइटोमेट्री के अधीन किया गया। बाएँ, प्रतिनिधि बिंदु प्लॉट; सही, असंक्रमित, ओमी-एस/एमचेरी-संक्रमित, ओमीक्रॉन/एमनियोग्रीन (ओमाइक्रोन/एमएनजी)-संक्रमित और दोगुनी संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत। क्षतिपूर्ति के लिए एकल संक्रमित कोशिकाओं का उपयोग किया गया। त्रुटि पट्टियाँ, माध्य ± sd (n {{20}} प्रतिकृति)। जी, पट्टिका आकार। बाएँ, ACE2/TMPRSS2/ Caco-2 कोशिकाओं पर प्लाक की प्रतिनिधि छवियां। ठीक है, प्लाक का व्यास प्रति वायरस 20 प्लाक के माध्य ± एसडी के रूप में प्लॉट किया गया है। एच, मानव आईएटी2 उपकला कोशिकाएं 48 घंटे या 96 घंटे के लिए 2.5 के एमओआई पर संक्रमित थीं। कोशिकाओं के शीर्ष भाग को 1× फॉस्फेट-बफ़र्ड सलाइन (पीबीएस) से धोया गया था और संक्रामक वायरस कणों के स्तर को प्लाक परख द्वारा मापा गया था। त्रुटि पट्टियाँ, माध्य ± sd (n=4 प्रतिकृति)। प्रयोगों को दो बार दोहराया गया, प्रत्येक प्रयोगात्मक दोहराव में 3 (बी-जी) या 4 (एच) प्रतिकृति शामिल थीं। पी मानों की गणना वेल्च के सुधार के साथ दो-पूंछ वाले, अयुग्मित टी-परीक्षण द्वारा की गई थी। *पी <0.05, **पी <0.01, ***पी <0.001 और ****पी <0.0001; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं. फ्लो साइटोमेट्री के लिए गेटिंग रणनीति को पूरक चित्र 1 में दिखाया गया है।

हमने सबसे पहले ओमी-एस की संक्रमण दक्षता की तुलना पैतृक D614G-युक्त वायरस (GISAID EPI_ISL_2732373; CPER द्वारा उत्पन्न; इसके बाद वाइल्ड टाइप (WT) के रूप में संदर्भित) और एक ओमीक्रॉन आइसोलेट के साथ की। (यूएसए-एलएच01/2021) सेल कल्चर में (चित्र 1ए)। इसके लिए, हमने एसीई 2- और टीएमपीआरएसएस {{10} को कैको व्यक्त करके -2 (इसके बाद, एसीई 2/टीएमपीआरएसएस 2/कैको -2) और वेरो ई6 कोशिकाओं को ओमी-एस, डब्ल्यूटी और से संक्रमित किया। 0.01 की संक्रमण बहुलता (एमओआई) पर ओमिक्रॉन, और फ्लो साइटोमेट्री और प्लाक गठन परख द्वारा वायरल प्रसार की निगरानी की गई। WT वायरस और ओमी-एस ACE2/TMPRSS2/Caco-2 कोशिकाओं में तेजी से फैलते हैं, जिससे संक्रमण के 24 घंटे बाद (HPI) (चित्र 1बी) क्रमशः 89% और 80% संक्रमित कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं। इसके विपरीत, ओमिक्रॉन ने अधिक धीरे-धीरे प्रतिकृति बनाई, जिससे 24 एचपीआई पर 48% संक्रमित कोशिकाएं हो गईं। वेरो ई6 कोशिकाओं में एक समान पैटर्न देखा गया, जिसमें 48 एचपीआई पर क्रमशः 60% और 41% कोशिकाएं डब्ल्यूटी और ओमी-एस के लिए सकारात्मक थीं, जबकि ओमिक्रॉन के लिए 10% (छवि 1 सी) के विपरीत। प्लाक परख से पता चला कि यद्यपि ओमी-एस और ओमीक्रॉन दोनों ने डब्ल्यूटी की तुलना में संक्रामक वायरस कणों के निम्न स्तर का उत्पादन किया, ओमी-एस का वायरल टिटर ओमीक्रॉन की तुलना में काफी अधिक था। ACE2/TMPRSS2/Caco-2 कोशिकाओं में, ओमी-एस ने 5.1-फ़ोल्ड (P=0.0006) और 5.5-फ़ोल्ड (P {{49}) का उत्पादन किया। }.0312) क्रमशः 12 एचपीआई और 24 एचपीआई पर ओमिक्रॉन की तुलना में अधिक संक्रामक कण हैं (चित्र 1डी)। इसी प्रकार, वेरो ई6 कोशिकाओं में, ओमी-एस के संक्रामक वायरस टाइटर्स 17-गुना (पी=0.0080) और 11-गुना (पी=0.0078) अधिक थे। क्रमशः 24 एचपीआई और 48 एचपीआई पर ओमिक्रॉन की तुलना में (चित्र 1ई)। ओमिक्रॉन की तुलना में ओमी-एस के कारण होने वाली उच्च साइटोटॉक्सिसिटी के कारण बाद के समय में वायरस के बीच अंतर कम स्पष्ट हो गया (विस्तारित डेटा चित्र 3 ए)। ओमिक्रॉन के सापेक्ष ओमी-एस की बढ़ी हुई प्रतिकृति दक्षता को अलग-अलग एमओआई (विस्तारित डेटा छवि 3 बी) पर परीक्षण करने पर संरक्षित किया गया था। हमने प्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धा परीक्षण द्वारा ओमीक्रॉन पर ओमी-एस के फिटनेस लाभ की पुष्टि की। इसके लिए, हमने सबसे पहले पुनः संयोजक ओमिक्रॉन (माइक्रोन) उत्पन्न किया, जो, हमारे सेल कल्चर परीक्षण में, प्राकृतिक ओमिक्रॉन (विस्तारित डेटा चित्र 4) की प्रतिकृति कैनेटीक्स की नकल करता है। इसके बाद, हमने mCherry-युक्त ओमी-एस और mNeonGreen-युक्त ओमीक्रॉन बनाया, और इन वायरस को 1:1 के अनुपात में मिश्रित करके ACE2/TMPRSS2/Caco-2 कोशिकाओं को टीका लगाया। संक्रमण के विभिन्न समयों में संक्रमित कोशिकाओं के फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण से पता चला कि प्रतिकृति के मामले में ओमी-एस/एमचेरी स्पष्ट रूप से ओमीक्रॉन/एमनियॉनग्रीन से बेहतर था (चित्र 1एफ)। अंत में, ओमी-एस की उच्च संक्रमण दक्षता भी प्लाक के आकार में परिलक्षित हुई; हालाँकि WT वायरस ने सबसे बड़ी सजीले टुकड़े (लगभग 4.1 मिमी) का उत्पादन किया, ओमी-एस सजीले टुकड़े (लगभग 2.2 मिमी) का आकार ओमिक्रॉन सजीले टुकड़े (लगभग 1.1 मिमी) की तुलना में दोगुना (पी <0.0001) बड़ा था (छवि 1 जी)। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि यद्यपि एस प्रोटीन में उत्परिवर्तन ओमिक्रॉन की संक्रमण दक्षता को प्रभावित करते हैं, लेकिन वे ओमिक्रॉन फेनोटाइप को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं करते हैं।

सबूतों की कई पंक्तियों से संकेत मिलता है कि ओमी-एस में शामिल एस प्रोटीन प्राकृतिक ओमीक्रॉन की तरह ही व्यवहार करता है। उदाहरण के लिए, जैसा कि पहले 20,25 में वर्णित है, ओमिक्रॉन एस डब्ल्यूटी एस की तुलना में खराब रूप से विभाजित था; जबकि डब्ल्यूटी विषाणुओं में एस का 71% विच्छेदित रूप में था, ओमी-एस और ओमिक्रॉन में क्रमशः केवल 45% और 47% विखंडित था (विस्तारित डेटा चित्र 5ए)। एस क्लीवेज का समान पैटर्न वायरस से संक्रमित कोशिकाओं (डब्ल्यूटी, 63% क्लीव्ड; ओमी-एस, 33% क्लीव्ड; ओमीक्रॉन, 42% क्लीव्ड) (विस्तारित डेटा चित्र 5 बी) में स्पष्ट था। इन प्रयोगों से यह भी पता चला कि ओमिक्रॉन एस को डब्ल्यूटी एस (एस से न्यूक्लियोकैप्सिड (एन) अनुपात: डब्ल्यूटी वायरस के लिए 3.40, ओमी-एस के लिए 1.91 और ओमिक्रॉन के लिए 2.04) की तुलना में वायरस कणों में अक्षम रूप से शामिल किया गया था (विस्तारित डेटा चित्र 5 ए)। इसी तरह, ओमी-एस और ओमिक्रॉन दोनों ने डब्ल्यूटी वायरस की तुलना में छोटे सिन्सिटिया का उत्पादन किया, एक अवलोकन जो पहले ओमीक्रॉन20,26 (विस्तारित डेटा चित्र 5सी) के लिए रिपोर्ट किया गया है। अंत में, प्रकाशित साहित्य25 के अनुरूप, ओमी-एस और ओमीक्रॉन ने कैथेप्सिनमीडिएटेड प्रविष्टि के लिए प्राथमिकता दिखाई, जैसा कि कैथेप्सिन अवरोधक ई64डी (विस्तारित डेटा चित्र 6) के प्रति उनकी उच्च संवेदनशीलता से परिलक्षित होता है। हमने अगली बार फेफड़े के उपकला कोशिकाओं में डब्ल्यूटी, ओमी-एस और ओमीक्रॉन की प्रतिकृति कैनेटीक्स की तुलना की, जो कि सीओवीआईडी ​​​​के रोगियों में एक प्रमुख वायरल प्रतिकृति साइट बनाते हैं (संदर्भ 27,28)। तदनुसार, हमने मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम (आईपीएस)-सेल-व्युत्पन्न फेफड़े के वायुकोशीय प्रकार 2 एपिथेलियल (आईएटी2) कोशिकाओं का उपयोग किया। AT2 कोशिकाएं डिस्टल फेफड़े में एक आवश्यक कोशिका आबादी का प्रतिनिधित्व करती हैं और SARS-CoV -2 संक्रमण28,29 के प्राथमिक लक्ष्यों में से एक का गठन करती हैं। हमने 2.5 के एमओआई पर एयर-लिक्विड इंटरफेस (एएलआई) संस्कृति के रूप में विकसित आईएटी2 कोशिकाओं को संक्रमित किया और 48 एचपीआई और 96 एचपी पर कोशिकाओं के शीर्ष पक्ष पर वायरल संतान के स्राव की निगरानी की। सेल लाइनों से प्राप्त परिणामों के अनुरूप, डब्ल्यूटी वायरस ने उच्चतम स्तर के संक्रामक वायरस कणों का उत्पादन किया (चित्र 1एच)। ओमी-एस और ओमीक्रॉन में, पहले वाले ने 48 एचपी पर लगभग पांच गुना (पी {{50%).0008) अधिक संक्रामक वायरल टिटर उत्पन्न किया। संक्रमण के साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) के कारण डब्ल्यूटी और ओमी-एस के लिए वायरल टाइटर्स 48 एचपी की तुलना में 96 डीपीआई पर कम हो गए। हालाँकि, ओमिक्रॉन के लिए कोई सीपीई नहीं देखा गया, जिससे संक्रामक विषाणुओं का निरंतर उत्पादन होता रहा। कुल मिलाकर, ये परिणाम इस निष्कर्ष की पुष्टि करते हैं कि एस में उत्परिवर्तन सेल संस्कृति में ओमिक्रॉन की क्षीण प्रतिकृति क्षमता के लिए पूरी तरह से जिम्मेदार नहीं है।

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चूहों में ओमीक्रॉन रोगजनन में एस की न्यूनतम भूमिका

यह जांचने के लिए कि क्या ओमी-एस, ओमीक्रॉन की तुलना में विवो में बेहतर फिटनेस प्रदर्शित करता है, हमने डब्ल्यूटी SARS-CoV-2 और ओमीक्रॉन के सापेक्ष ओमी-एस के संक्रमण परिणाम की जांच K18-hACE2 चूहों में की। प्रकाशित साहित्य4,5 के अनुसार, ओमीक्रॉन (104 पीएफयू प्रति चूहा) के साथ चूहों (12-20 सप्ताह की आयु) के इंट्रानैसल टीकाकरण से कोई महत्वपूर्ण वजन कम नहीं हुआ, जबकि डब्ल्यूटी वायरस के टीकाकरण से सभी चूहों के शरीर के वजन में तेजी से कमी आई। संक्रमण के 8 दिन बाद (डीपीआई) अपने शुरुआती शरीर के वजन का 20% से अधिक कम करना (चित्र 2ए)। विशेष रूप से, ओमी-एस से संक्रमित 80% चूहों के शरीर का वजन 9 डीपीआई (चित्र 2ए और विस्तारित डेटा चित्र 7ए) तक 20% से अधिक कम हो गया। क्लिनिकल स्कोर के मूल्यांकन (वजन घटाने, असामान्य श्वसन, असामान्य उपस्थिति, कम प्रतिक्रियाशीलता और परिवर्तित व्यवहार का एक संचयी माप) ने भी एक समान पैटर्न का खुलासा किया; जबकि ओमीक्रॉन-संक्रमित चूहों में नैदानिक ​​​​बीमारी के बहुत कम या कोई लक्षण नहीं दिखे, डब्ल्यूटी और ओमी-एस से संक्रमित चूहों का स्वास्थ्य तेजी से बिगड़ गया, डब्ल्यूटी वायरस एक अधिक गंभीर बीमारी का कारण बन गया (पी=0.0102) (चित्र)। 2बी और विस्तारित डेटा चित्र 7बी)। चूँकि SARS-CoV-2 K{{29}hACE2 चूहों4 में घातक संक्रमण का कारण बनता है, इसलिए हमने वायरल संक्रमण के बाद चूहों के जीवित रहने की तुलना की। शरीर के वजन में कमी और क्लिनिकल स्कोर के परिणामों से सहमत होकर, डब्ल्यूटी और ओमी-एस के कारण मृत्यु दर क्रमशः 100% (6/6) और 80% (8/10) हो गई। इसके विपरीत, ओमिक्रॉन से संक्रमित सभी चूहे बच गए (चित्र 2सी)। ये निष्कर्ष, जो एक हालिया प्रकाशन30 के अनुरूप हैं, संकेत देते हैं कि एस प्रोटीन K{42}}hACE2 चूहों में ओमिक्रॉन की रोगज़नक़ी का विशेष निर्धारक नहीं है।

इसके बाद, हमने K18-hACE2 चूहों के फेफड़ों और नाक टर्बाइनेट्स में ओमी-एस के प्रसार की तुलना ओमीक्रॉन और WT SARS-CoV-2 से की। चूहों (12-20 सप्ताह पुराने) को 104 पीएफयू (प्रति वायरस सात चूहे) के साथ आंतरिक रूप से चुनौती दी गई थी, और चूहों के फेफड़ों में वायरल टाइटर्स को 2 और 4 डीपीआई पर मापा गया था। इन विट्रो निष्कर्षों के अनुरूप, डब्ल्यूटी-संक्रमित चूहों के फेफड़ों में संक्रामक वायरस टिटर अन्य दो वायरस से संक्रमित चूहों में पाए गए की तुलना में अधिक था (चित्र 2 डी)। उल्लेखनीय रूप से, हालांकि, ओमी-एस-संक्रमित चूहों ने 2 डीपीआई पर ओमीक्रॉन-संक्रमित चूहों की तुलना में 30-गुना (पी=0.0286) अधिक संक्रामक वायरस कण उत्पन्न किए। डब्ल्यूटी- और ओमी-एस-संक्रमित चूहों के लिए टिटर 4 डीपीआई में कम हो गया, लेकिन इसने ओमिक्रॉन-संक्रमित चूहों के लिए बढ़ती प्रवृत्ति दिखाई, जो K{24}}hACE2 चूहों में ओमिक्रॉन द्वारा हल्के लेकिन लगातार संक्रमण की संभावना की ओर इशारा करता है। चूहों के फेफड़ों से बरामद किए गए सभी तीन वेरिएंट ने मूल इनोकुलम के समान प्लाक आकार के फेनोटाइप को बनाए रखा, जो दर्शाता है कि चूहों में प्रतिकृति का इन वायरस के जीनोटाइप पर कोई पता लगाने योग्य प्रभाव नहीं था (डेटा नहीं दिखाया गया है)।

K18-hACE2 चूहों के फेफड़ों और नाक टर्बाइनेट्स में वायरल रोगजनकता का मूल्यांकन करने के लिए, हमने 2 डीपीआई पर इन ऊतकों का हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण किया। जैसा कि पहले बताया गया है4,31, डब्ल्यूटी वायरस से संक्रमित चूहों के फेफड़ों के एल्वियोली में SARS-CoV -2 एन प्रोटीन की एक व्यापक निकट-विस्तारित प्रतिरक्षा सक्रियता का पता चला था (चित्र 2e)। इसके विपरीत, ओमी-एस और ओमीक्रॉन संक्रमण ने ओमी-एस की तुलना में ओमीक्रॉन के लिए कम फॉसी के साथ वायुकोशीय धुंधलापन का स्थानीयकृत फॉसी उत्पन्न किया। सबसे चिह्नित फेनोटाइप ब्रोन्किओलर एपिथेलियम में देखा गया था, जिसमें ओमी-एस ने स्पष्ट, नियमित रूप से परिधीय संक्रमण का कारण बना, लगभग 10-15% ब्रोन्किओल्स 2 डीपीआई पर वायरल एन प्रोटीन के लिए सकारात्मक थे, जबकि केवल 3-5% ब्रोन्किओल्स एन थे। -ओमिक्रॉन के लिए सकारात्मक (चित्र 2एफ)। डब्ल्यूटी वायरस ने लगभग 1% ब्रोन्किओल्स को संक्रमित किया और सभी मामलों में प्रति ब्रोन्किओल्स में केवल एक पृथक उपकला कोशिका शामिल थी। इसके अलावा, ब्रोन्किओलर संक्रमण ओमी-एस-संक्रमित चूहों में उपकला परिगलन से जुड़ा था, जैसा कि सीरियल हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) अनुभाग विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित किया गया था, जबकि ओमीक्रॉन- या डब्ल्यूटी-संक्रमित चूहों में वायुमार्ग की चोट का कोई हिस्टोलॉजिकल सबूत नहीं देखा गया था (विस्तारित डेटा) चित्र 8ए,बी)। डब्ल्यूटी और ओमी-एस वायरस से टीका लगाए गए चूहों के नाक के टर्बाइनेट्स में प्रचुर मात्रा में SARS-CoV पॉजिटिव कोशिकाएं मौजूद थीं, जो प्रत्यक्ष साइटोपैथिक प्रभाव से जुड़ी थीं, जबकि ओमिक्रॉन ने दुर्लभ, छिटपुट सकारात्मक कोशिकाएं उत्पन्न कीं, जिनमें उपकला के कोई स्पष्ट संकेत नहीं थे। चोट (विस्तारित डेटा चित्र 8सी)। कुल मिलाकर, इन निष्कर्षों से पता चलता है कि चूहों के श्वसन पथ में ओमीक्रॉन की प्रतिकृति ओमी-एस की तुलना में काफी हद तक क्षीण हो गई है, जो हमारे निष्कर्ष का समर्थन करती है कि एस में उत्परिवर्तन केवल ओमीक्रॉन की क्षीण रोगजनकता के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार हैं।

S और nsp6 में उत्परिवर्तन ओमिक्रॉन क्षीणन को परिभाषित करते हैं

एस प्रोटीन के अलावा, डब्ल्यूटी वायरस की तुलना में ओमिक्रॉन में गैर-संरचनात्मक प्रोटीन 3 (एनएसपी 3), एनएसपी 4, एनएसपी 5, एनएसपी 6, एनएसपी 14, लिफाफा (ई), झिल्ली (एम), और एन प्रोटीन में अमीनो एसिड परिवर्तन होते हैं। (विस्तारित डेटा चित्र 9ए)। ओमिक्रॉन क्षीणन में शामिल गैर-स्पाइक प्रोटीन की पहचान करने के लिए, हमने फ्लोरोसेंटली लेबल वाले काइमेरिक वायरस का एक बड़ा पैनल तैयार किया, प्रत्येक में ओमिक्रॉन के एक गैर-स्पाइक प्रोटीन के साथ संयोजन में ओमिक्रॉन एस शामिल था, शेष प्रोटीन डब्ल्यूटी वायरस (विस्तारित डेटा) से आए थे। चित्र 9बी)। जब हमने ओमिक्रॉन एस को ओमिक्रॉन एनएसपी6 (ओमी-एस/एनएसपी6) के साथ जोड़ा, तो हमने वायरल प्रतिकृति में भारी कमी देखी, जिसमें संक्रमण कैनेटीक्स सेल कल्चर में ओमिक्रॉन की नकल कर रहा था (चित्र 3ए-डी); अन्य काइमेरिक वायरस के लिए ऐसी कोई कमी नहीं देखी गई। ओमी-एस/एनएसपी6 की खराब प्रतिकृति दक्षता की पुष्टि हमारे इस निष्कर्ष से भी हुई कि ओमी-एस/एनएसपी6 और ओमीक्रॉन दोनों को सीपीईआर द्वारा पुनर्प्राप्त करने में लगभग पांच से छह दिन लगे, जबकि अन्य सभी वेरिएंट दो दिनों में पुनर्प्राप्त किए गए (डेटा नहीं दिखाया गया)। अंत में, ओमिक्रॉन की तरह, ओमी-एस/एनएसपी6 को सीधे प्रतिस्पर्धा परख में ओमी-एस द्वारा स्पष्ट रूप से मात दी गई (चित्र 3ई)।

Fig. 2 | Role of S in Omicron pathogenicity. a–c, Male and female K18-hACE2 mice (aged 12–20 weeks) were intranasally inoculated with 1 × 104 PFU of WT (n = 6 mice), Omi-S (n = 10 mice) or Omicron (n = 10 mice) virus. Two independently generated virus stocks were used in this experiment. Body weight (a), clinical score (b), and survival (c) were monitored daily for 14 days. Mice that lost 20% of their initial body weight were euthanized. d,e, K18-hACE2 mice were intranasally inoculated with 1 × 104 PFU of WT (n = 14 mice), Omi-S (n = 14 mice) and Omicron (n = 14 mice). Lung samples of the infected mice were collected at 2 or 4 dpi to determine the viral titer (n = 4 mice) (d) or for immunohistochemistry (IHC) detection of the N protein (n = 3 mice) (e). In e, representative IHC images showing SARS-CoV-2 N (brown color) in alveoli (arrows) and bronchioles (arrowheads) in mice lungs at 2 dpi are presented. Scale bars, 100 µm. f, Percentage of N-positive bronchioles in the lungs of infected mice (n = 3 mice) at 2 dpi. Each dot represents an infected mouse. Statistical significance was determined using a two-tailed, unpaired t-test with Welch's correction (a,b,d,f) and log-rank (Mantel-Cox) test (c). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 and ****P < 0.0001; NS, not significant.


चित्र 2|ओमिक्रॉन रोगजन्यता में एस की भूमिका। ए-सी, नर और मादा K18-hACE2 चूहों (आयु 12-2{36}} सप्ताह) को इंट्रानेज़ली 1 × 104 PFU ऑफ WT (n {{7%) का टीका लगाया गया। चूहे), ओमी-एस (एन=10 चूहे) या ओमीक्रॉन (एन {{1{40}} चूहे) वायरस। इस प्रयोग में दो स्वतंत्र रूप से उत्पन्न वायरस स्टॉक का उपयोग किया गया था। शरीर के वजन (ए), क्लिनिकल स्कोर (बी), और उत्तरजीविता (सी) की 14 दिनों तक प्रतिदिन निगरानी की गई। जिन चूहों ने अपने शुरुआती शरीर का वजन 20% कम कर लिया, उन्हें इच्छामृत्यु दे दी गई। d,e, K18-hACE2 चूहों को आंतरिक रूप से 1 × 104 PFU WT (n=14 चूहों), ओमी-एस (n=14 चूहों) और ओमीक्रॉन (n {{) के साथ टीका लगाया गया था। 20}} चूहे)। वायरल टिटर (एन=4 चूहों) (डी) या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा एन प्रोटीन (एन=3 चूहों) का पता लगाने के लिए संक्रमित चूहों के फेफड़ों के नमूने 2 या 4 डीपीआई पर एकत्र किए गए थे। (इ)। ई में, 2 डीपीआई पर चूहों के फेफड़ों में एल्वियोली (तीर) और ब्रोन्किओल्स (एरोहेड्स) में SARS-CoV -2 N (भूरा रंग) दिखाने वाली प्रतिनिधि IHC छवियां प्रस्तुत की गई हैं। स्केल बार, 100 µm. एफ, संक्रमित चूहों के फेफड़ों में एन-पॉजिटिव ब्रोन्किओल्स का प्रतिशत (एन {{30%) चूहे) 2 डीपीआई पर। प्रत्येक बिंदु एक संक्रमित चूहे का प्रतिनिधित्व करता है। वेल्च के सुधार (ए, बी, डी, एफ) और लॉग-रैंक (मेंटल-कॉक्स) परीक्षण (सी) के साथ दो-पूंछ, अयुग्मित टी-परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व निर्धारित किया गया था। *पी <0.05, **पी <0.01, ***पी <0.001 और ****पी <0.0001; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं.

K{0}}hACE2 चूहों के फेफड़ों में, जबकि ओमी-एस ने व्यापक ब्रोन्किओलर संक्रमण और चोट का कारण बना, ओमीक्रॉन और ओमी-एस/एनएसपी6 दोनों में उपकला क्षति का कोई सबूत नहीं होने के साथ संक्रमण में कमी देखी गई (चित्र 3एफ)। इन निष्कर्षों के अनुरूप, ओमी-एस/एनएसपी6-संक्रमित चूहों के फेफड़ों ने आरओमाइक्रोन और ओमिक्रॉन आइसोलेट (चित्र 3जी) के लिए देखे गए वायरल टाइटर्स के बराबर वायरल टाइटर्स का उत्पादन किया। अंत में, ओमी-एस/एनएसपी6 से संक्रमित 71% चूहे बच गए (चित्र 3एच) - इसके विपरीत केवल 20% की जीवित रहने की दर ओमी-एस (चित्र 2सी) से संक्रमित चूहों में देखी गई थी। कुल मिलाकर, ये परिणाम दर्शाते हैं कि एस और एनएसपी6 में उत्परिवर्तन ओमिक्रॉन के क्षीण विषाणु को परिभाषित करने के लिए पर्याप्त हैं। ये अवलोकन पिछले अध्ययन के निष्कर्षों का समर्थन करते हैं और उन्हें आगे बढ़ाते हैं, जिसमें दिखाया गया है कि 5′-UTR-nsp12 क्षेत्र में उत्परिवर्तन, जिसमें nsp6 रहता है, K{22}}hACE2 चूहों30 में ओमिक्रॉन के क्षीणन में योगदान देता है।

Fig. 3 | Mutations in S and nsp6 drive Omicron pathogenicity.a–d, Replication kinetics of indicated mNeonGreen reporter viruses in ACE2/TMPRSS2/Caco-2 cells (MOI = 0.01) determined by flow cytometry (n = 3 replicates) (a,c) and plaque assay (n = 3 replicates) (b,d). Experiments were repeated twice. e, ACE2/ TMPRSS2/Caco-2 cells were infected with virus mixtures at a 1:1 ratio to obtain the final MOI of 0.005 for each virus. The cells were fixed at the indicated times and analyzed by flow cytometry. Percentage of uninfected, singly infected, and doubly infected cells is shown. Singly infected cells were used for compensation. Individual data points are plotted along with the mean ± s.d. (n = 3 replicates). The experiment was repeated twice. f–h, K18-hACE2 mice were intranasally inoculated with 1 × 104 PFU of viruses. Lung samples of infected mice were collected at 2 dpi for IHC detection of the N protein (n = 3 mice) (f) or for the determination of viral titers (n = 4 mice) (g). In f, representative images of H&E staining of N-positive bronchioles are shown in insets. Bronchiolar epithelial necrosis is indicated with arrows. No evidence of necrosis was seen in the bronchioles of mice infected with Omicron or Omi-S/nsp6. Scale bar, 100 µm. The right graph in f shows the percentage of N-positive bronchioles in the lungs of infected mice. Each dot represents an infected mouse. h, Survival of infected mice monitored daily for 14 days. Mice that lost 20% of their initial body weight were euthanized. Statistical significance was determined using a two-tailed, unpaired t-test with Welch's correction (a–g) and log-rank (Mantel-Cox) test (h). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 and ****P < 0.0001; NS, not significant.


चित्र 3|एस और एनएसपी6 में उत्परिवर्तन ओमिक्रॉन पैथोजेनिसिटी.ए-डी को संचालित करते हैं, एसीई2/टीएमपीआरएसएस2/सीएको-2 कोशिकाओं (एमओआई=0.01) में संकेतित एमनियॉनग्रीन रिपोर्टर वायरस की प्रतिकृति कैनेटीक्स प्रवाह द्वारा निर्धारित की जाती है। साइटोमेट्री (n=3 प्रतिकृति) (ए,सी) और प्लाक परख (एन {{8%) प्रतिकृति) (बी,डी)। प्रयोग दो बार दोहराए गए। ई, ACE2/ TMPRSS2/Caco-2 कोशिकाओं को अंतिम MOI प्राप्त करने के लिए 1:1 अनुपात में वायरस मिश्रण से संक्रमित किया गया था। 0। प्रत्येक वायरस के लिए 5। . कोशिकाओं को संकेतित समय पर तय किया गया और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया। असंक्रमित, एकल संक्रमित और दोगुनी संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाया गया है। क्षतिपूर्ति के लिए एकल संक्रमित कोशिकाओं का उपयोग किया गया। अलग-अलग डेटा बिंदुओं को माध्य ± एसडी (एन=3 प्रतिकृति) के साथ प्लॉट किया जाता है। प्रयोग दो बार दोहराया गया. f–h, K18-hACE2 चूहों को आंतरिक रूप से 1 × 104 PFU वायरस का टीका लगाया गया। एन प्रोटीन (एन=3 चूहों) (एफ) के आईएचसी का पता लगाने या वायरल टाइटर्स (एन {{23%) चूहों) (जी) के निर्धारण के लिए संक्रमित चूहों के फेफड़ों के नमूने 2 डीपीआई पर एकत्र किए गए थे। एफ में, एन-पॉजिटिव ब्रोन्किओल्स के एच एंड ई धुंधलापन की प्रतिनिधि छवियां इनसेट में दिखाई गई हैं। ब्रोंकियोलर एपिथेलियल नेक्रोसिस को तीरों से दर्शाया गया है। ओमीक्रॉन या ओमी-एस/एनएसपी6 से संक्रमित चूहों के ब्रोन्किओल्स में नेक्रोसिस का कोई सबूत नहीं देखा गया। स्केल बार, 100 µm. एफ में सही ग्राफ संक्रमित चूहों के फेफड़ों में एन-पॉजिटिव ब्रोन्किओल्स का प्रतिशत दर्शाता है। प्रत्येक बिंदु एक संक्रमित चूहे का प्रतिनिधित्व करता है। एच, संक्रमित चूहों के जीवित रहने की 14 दिनों तक प्रतिदिन निगरानी की गई। जिन चूहों ने अपने शुरुआती शरीर का वजन 20% कम कर लिया, उन्हें इच्छामृत्यु दे दी गई। वेल्च के सुधार (ए-जी) और लॉग-रैंक (मेंटल-कॉक्स) परीक्षण (एच) के साथ दो-पूंछ, अयुग्मित टी-परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व निर्धारित किया गया था। *पी <0.05, **पी <0.01, ***पी <0.001 और ****पी <0.0001; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं.

एस प्रोटीन आरबीएम ओमिक्रॉन के टीके को भागने में मदद करता है

साहित्य के एक बड़े समूह ने वैक्सीन-प्रेरित ह्यूमरल इम्युनिटी14,19 से ओमिक्रॉन के व्यापक बचाव का प्रमाण प्रदान किया है। एस क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए जो ओमिक्रॉन के प्रतिरक्षा-पलायन फेनोटाइप से जुड़े हैं, हमने सबसे पहले डब्ल्यूटी SARS-CoV -2 (यूएसए-डब्ल्यूए 1/2 {{23%) के खिलाफ टीका लगाए गए व्यक्तियों से सीरा की इन विट्रो न्यूट्रलाइजेशन गतिविधि की तुलना की। 20), ओमी-एस, और ओमीक्रॉन। सेरा को एमआरएनए की दूसरी खुराक के दो महीने के भीतर एकत्र किया गया था (मॉडर्ना एमआरएनए वैक्सीन; एन=12) या बीएनटी 162 बी 2 (फाइजर-बायोएनटेक एमआरएनए वैक्सीन; एन=12) वैक्सीन शामिल थी (विस्तारित डेटा) तालिका नंबर एक)। हमने एक सेटिंग का उपयोग करके एक मल्टीसाइकल न्यूट्रलाइज़ेशन परख की, जिसमें वायरस और न्यूट्रलाइज़िंग सीरा हर समय मौजूद थे, एक सेरोपॉज़िटिव व्यक्ति की स्थिति की नकल करते हुए। सभी सीरा ने ओमीक्रॉन को 11.1-फ़ोल्ड (रेंज: 4.4-फ़ोल्ड से 81.2-फ़ोल्ड; पी <0.0001) निचले आधे-अधिकतम न्यूट्रलाइज़िंग कमजोर पड़ने (एनडी50) के साथ खराब तरीके से बेअसर कर दिया। ओमिक्रॉन के लिए WA1 (चित्र 4a,b) के साथ तुलना की गई। वास्तव में, लगभग 80% नमूनों ने उच्चतम परीक्षणित सांद्रता पर ओमिक्रॉन को पूरी तरह से बेअसर नहीं किया (विस्तारित डेटा चित्र 10)। विशेष रूप से, ओमी-एस ने ओमिक्रॉन के समान एनडी50 मान प्रदर्शित किए (डब्ल्यूए1 की तुलना में 11.{{34%) गुना कम; पी <0.0001) (चित्र 4ए,बी), यह सुझाव देते हुए कि ओमिक्रॉन एस प्रोटीन, जब डब्ल्यूटी में शामिल किया जाता है वायरस, वैसा ही व्यवहार करता है जैसा वह ओमीक्रॉन में करता है।

Fig. 4 | Role of S in the immune resistance of Omicron. ND50 values for WA1, Omi-S, and Omicron in sera from individuals who received two shots of Moderna (donors 1–12) or Pfizer (donors 13–24) vaccine (further details of sera are provided in Extended Data Table 1; individual curves are shown in Extended Data Fig. 10). b, Trajectories of ND50 values against WA1, Omi-S and Omicron (the data from a are plotted). The fold change in ND50 values is indicated (n = 24 serum samples). c–f, Schematic of the chimeric (left; c,d) and mutant (left; e,f) viruses. The amino acid numbering for WA1 mutants in e is based on the WA1 S sequence, whereas the numbering for Omicron mutants in f is based on the Omicron S sequence. Six of the 24 sera (3 from Moderna and 3 from Pfizer) were tested. Each serum sample is represented by a dot of a specific color. The data are plotted as the fold change of the parental virus. Statistical significance was determined using a two-tailed, unpaired t-test with Welch's correction. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 and ****P < 0.0001; NS, not significant.


चित्र 4|ओमिक्रॉन की प्रतिरक्षा प्रतिरोध में एस की भूमिका। उन व्यक्तियों के सीरा में WA1, ओमी-एस और ओमीक्रॉन के लिए ND50 मान, जिन्हें मॉडर्ना (दानकर्ता 1-12) या फाइजर (दानकर्ता 13-24) वैक्सीन के दो शॉट मिले हैं (सीरा का अधिक विवरण विस्तारित में प्रदान किया गया है) डेटा तालिका 1; अलग-अलग वक्र विस्तारित डेटा चित्र 1 में दिखाए गए हैं। बी, WA1, ओमी-एस और ओमीक्रॉन के विरुद्ध ND50 मानों के प्रक्षेप पथ (ए से डेटा प्लॉट किया गया है)। ND50 मानों में गुना परिवर्तन दर्शाया गया है (n=24 सीरम नमूने)। सी-एफ, काइमेरिक (बाएं; सी, डी) और उत्परिवर्ती (बाएं; ई, एफ) वायरस का योजनाबद्ध। ई में WA1 म्यूटेंट के लिए अमीनो एसिड नंबरिंग WA1 S अनुक्रम पर आधारित है, जबकि f में ओमिक्रॉन म्यूटेंट के लिए नंबरिंग ओमिक्रॉन एस अनुक्रम पर आधारित है। 24 सीरा में से छह (3 मॉडर्ना से और 3 फाइजर से) का परीक्षण किया गया। प्रत्येक सीरम नमूने को एक विशिष्ट रंग के बिंदु द्वारा दर्शाया जाता है। डेटा को पैरेंटल वायरस के गुना परिवर्तन के रूप में प्लॉट किया जाता है। वेल्च के सुधार के साथ दो-पूंछ वाले, अयुग्मित टी-परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व निर्धारित किया गया था। *पी <0.05, **पी <0.01, ***पी <0.001 और ****पी <0.0001; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं.

SARS-CoV-2 S प्रोटीन में दो डोमेन शामिल हैं: S1 डोमेन, जो ACE2 रिसेप्टर के साथ इंटरैक्ट करता है, और S2 डोमेन, जो झिल्ली संलयन32 के लिए जिम्मेदार है। S1 डोमेन के भीतर एक N-टर्मिनल डोमेन (NTD) और एक रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (RBD) होता है, जिसमें रिसेप्टर-बाइंडिंग मोटिफ (RBM) होता है जो ACE2 रिसेप्टर33 के साथ सीधा संपर्क बनाता है। ओमिक्रॉन एस के एनटीडी में 11 अमीनो एसिड परिवर्तन होते हैं, जिनमें 6 विलोपन और एक {{14}अमीनो-एसिड-लंबा सम्मिलन शामिल है, जबकि आरबीडी में 15 उत्परिवर्तन होते हैं, जिनमें से 1{36}} आरबीएम (विस्तारित) में केंद्रित होते हैं। डेटा चित्र. 1). एनटीडी और आरबीडी दोनों ही न्यूट्रलाइजिंग एपिटोप्स34-37 की मेजबानी करते हैं, लेकिन आरबीडी इम्युनोडोमिनेंट है और न्यूट्रलाइजिंग गतिविधि के प्राथमिक लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है जो SARS-CoV प्रतिरक्षा सीरा37,38 में मौजूद है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ओमिक्रॉन का न्यूट्रलाइज़ेशन प्रतिरोध फेनोटाइप एस प्रोटीन के एक विशेष डोमेन में उत्परिवर्तन के कारण होता है, हमने काइमेरिक वायरस के दो समूह तैयार किए। पहले समूह में ओमीक्रॉन के एनटीडी, आरबीडी या आरबीएम को ले जाने वाला WA1 वायरस शामिल था (चित्र 4c), और दूसरे समूह में WA1 के NTD, RBD या RBM को ले जाने वाले ओमी-एस वायरस शामिल था (चित्र 4d)। न्यूट्रलाइज़ेशन परख से पता चला कि आरबीएम में उत्परिवर्तन वैक्सीन-प्रेरित ह्यूमरल प्रतिरक्षा के प्रति ओमिक्रॉन के प्रतिरोध का मुख्य कारण था: WA1 के आरबीएम को ओमिक्रॉन के साथ बदलने से ND50 में 5. 4-गुना (पी <0.0001) की कमी आई। और, इसके विपरीत, ओमी-एस के आरबीएम को WA1 के साथ प्रतिस्थापित करने से ND50 में 5.6-गुना (P=0.0003) की वृद्धि हुई (चित्र 4c,d)। तथ्य यह है कि किसी भी आरबीएम-स्वैप वायरस ने WA1 और ओमी-एस के बीच देखे गए लगभग 11- गुना का अंतर हासिल नहीं किया, यह बताता है कि एस के अन्य हिस्सों में उत्परिवर्तन भी वैक्सीन प्रतिरोध में योगदान करते हैं।

यह जांचने के लिए कि क्या ओमिक्रॉन आरबीएम में विशिष्ट उत्परिवर्तन वैक्सीन से बच निकलते हैं, हमने पुनः संयोजक वायरस के दो अतिरिक्त पैनल तैयार किए, एक WA1 एस के साथ ओमिक्रॉन आरबीएम उत्परिवर्तन ले रहा है, या तो अकेले या संयोजन में (छवि 4e), और दूसरे में ओमिक्रॉन एस में समान कमी है। उत्परिवर्तनों का सेट (चित्र 4f)। दो WA1 उत्परिवर्ती-उत्परिवर्ती 3 (E484A प्रतिस्थापन के साथ) और उत्परिवर्ती 4 (पांच प्रतिस्थापन Q493R, G496S, Q498R, N501Y और Y505H के क्लस्टर वाले) - ने 1 की मध्यम लेकिन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी प्रदर्शित की। WA1 (चित्र 4e) की तुलना में, ND50 मानों में क्रमशः P=0.0002) और 1.{19}} गुना (P=0.0003)। जब इन उत्परिवर्तनों को ओमिक्रॉन एस से हटा दिया गया तो विपरीत देखा गया; ओमिक्रॉन म्यूटेंट 3 (E484A प्रतिस्थापन की कमी) और म्यूटेंट 4 (Q493R, G496S, Q498R, N501Y और Y505H की कमी) में 1. ओमीक्रॉन (चित्र 4f) की तुलना में }}गुना (P {{39%).0025) उच्च ND50 मान। चूंकि किसी भी उत्परिवर्ती ने ओमिक्रॉन के समग्र फेनोटाइप पर कब्जा नहीं किया है, हम मानते हैं कि टीका से बचना एस प्रोटीन की लंबाई के साथ वितरित उत्परिवर्तन का संचयी प्रभाव है। यह संभव है कि उत्परिवर्तन ओमिक्रॉन एस की संरचना को इस तरह से बदल देते हैं कि अधिकांश इम्युनोडोमिनेंट न्यूट्रलाइजिंग एपिटोप्स बाधित हो जाते हैं और न्यूट्रलाइजेशन के लिए अनुपलब्ध हो जाते हैं।

Desert ginseng-Improve immunity (23)

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

बहस

यह अध्ययन उन वायरल प्रोटीनों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है जो SARS-CoV -2 रोगजनन में योगदान करते हैं। हम दिखाते हैं कि एस, ओमिक्रॉन में सबसे अधिक उत्परिवर्तित प्रोटीन, ओमिक्रॉन क्षीणन में एक अधूरी भूमिका है। कोशिका-आधारित संक्रमण परीक्षणों में, ओमी-एस वायरस पैतृक वायरस और ओमीक्रॉन के बीच एक मध्यवर्ती प्रतिकृति दक्षता प्रदर्शित करता है। इसी प्रकार, K18-hACE2 चूहों में, ओमी-एस गैर-घातक ओमीक्रॉन के विपरीत है और 80% मृत्यु दर का कारण बनता है; पैतृक वायरस इन चूहों में 100% मृत्यु का कारण बनता है। विशेष रूप से, जब हमने एस उत्परिवर्तन को एनएसपी 6 में उत्परिवर्तन के साथ जोड़ा, तो वायरस ने एक क्षीण फेनोटाइप प्रदर्शित किया जो काफी हद तक ओमिक्रॉन जैसा था, यह दर्शाता है कि ये दो प्रोटीन ओमिक्रॉन रोगजनकता के प्रमुख निर्धारक हैं। भविष्य के अध्ययन उस तंत्र को समझेंगे जिसके द्वारा एनएसपी6 उत्परिवर्तन वायरल प्रतिकृति को प्रभावित करते हैं।

हमारे अध्ययन की एक संभावित सीमा मानव के साथ अधिक समानता रखने वाले प्राइमेट मॉडल के बजाय रोगजनन अध्ययन के लिए K 18-hACE2 चूहों का उपयोग है। हालाँकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि K18-hACE2 चूहे SARS-CoV-24,31 के घातक फेनोटाइप की जांच के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल हैं। हालाँकि SARS-CoV संक्रमण के बाद इन चूहों में फेफड़ों की विकृति विकसित हो जाती है, मृत्यु दर वायरल न्यूरोइन्वेज़न और प्रसार31,40 के कारण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की भागीदारी से जुड़ी हुई है। तथ्य यह है कि ओमी-एस के साथ नहीं बल्कि ओमीक्रॉन के साथ नहीं, बल्कि के 18- एचएसीई2 चूहों के संक्रमण से न्यूरोलॉजिकल संकेत मिलते हैं (उदाहरण के लिए, झुकी हुई मुद्रा और प्रतिक्रिया की कमी) से पता चलता है कि ओमी-एस में न्यूरोइनवेज़न गुण संरक्षित है, संभवतः इसकी उच्च प्रतिकृति दक्षता के परिणामस्वरूप, और इस संपत्ति के निर्धारक एस प्रोटीन के बाहर हैं। ये निष्कर्ष पिछले अध्ययन के अनुरूप हैं, जिसमें दिखाया गया है कि ओमी-एस से संक्रमित हैम्स्टर्स ने ओमीक्रॉन से संक्रमित लोगों की तुलना में काफी अधिक वायरस बहाया और अधिक वजन कम किया, यह सुझाव देते हुए कि एस के बाहर उत्परिवर्तन ओमीक्रॉन41 की क्षीण रोगजनकता में योगदान करते हैं।

हमने पाया कि यद्यपि पैतृक वायरस मुख्य रूप से फेफड़े के एल्वियोली में प्रतिकृति बनाता है और K{0}}hACE2 चूहों में ब्रोन्किओल्स के केवल दुर्लभ संक्रमण का कारण बनता है, ओमी-एस और ओमिक्रॉन दोनों ब्रोन्किओलर एपिथेलियम में प्रतिकृति बनाने की बढ़ी हुई प्रवृत्ति प्रदर्शित करते हैं, जो दर्शाता है कि एस परिवर्तित उष्ण कटिबंध के लिए प्रोटीन जिम्मेदार है। इस स्विच के पीछे का तंत्र अज्ञात है, लेकिन यह संभव है कि कैथेप्सिन बी या कैथेप्सिन एल (संदर्भ 25,42,43) का उपयोग करने में ओमिक्रॉन एस डब्ल्यूटी एस की तुलना में अधिक कुशल है, जो ब्रोन्किओल्स और अन्य वायुमार्ग में एक सक्रिय वायरल प्रवेश मार्ग बनाता है। कोशिकाएं41. इसके विपरीत, वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं में SARS-CoV-2 का प्रवेश मुख्य रूप से TMPRSS2 (Refs. 28,44) द्वारा संचालित होता है, जिसका उपयोग करने में ओमीक्रॉन S की कमी है, जिससे इन कोशिकाओं का खराब संक्रमण होता है4,5 ,25,43. ये निष्कर्ष ओमिक्रॉन के कारण होने वाली क्षीण फेफड़ों की विकृति की व्याख्या कर सकते हैं।

Desert ginseng-Improve immunity (10)

सिस्तांचे के फायदे-प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत बनाना

ओमिक्रॉन एनएसपी6 में प्रोटोटाइप SARS CoV -2 वुहान-हू -1 आइसोलेट के सापेक्ष दो परिवर्तित साइटें हैं: एक तीन-अमीनो-एसिड विलोपन (एलएसजी, स्थिति 105-107) और एक I189V प्रतिस्थापन (विस्तारित डेटा चित्र) .9). कोरोना वायरस प्रतिकृति में एनएसपी6 के कई कार्यों का वर्णन किया गया है; उनमें से प्रमुख है डबल-मेम्ब्रेन वेसिकल्स (डीएमवी) का जैवजनन, जो वायरल आरएनए संश्लेषण46-50 की साइट का प्रतिनिधित्व करता है। पिछले अध्ययन से पता चला है कि SARS-CoV-2 DMV मुख्य रूप से तीन वायरल प्रोटीनों की ठोस कार्रवाई से उत्पन्न होते हैं: nsp3, nsp4, और nsp6; हालाँकि nsp3 और nsp4 DMV के निर्माण के लिए पर्याप्त हैं, nsp6 इन DMV को एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम से जोड़ता है और इन संरचनाओं के बीच आवश्यक संचार को चैनलाइज़ करता है। क्या ओमिक्रॉन एनएसपी6 में उत्परिवर्तन का समूह डीएमवी के गठन या कार्यों को प्रभावित करता है या नहीं, इसकी और जांच की जरूरत है। Nsp6, एक प्रमुख विषाणु कारक47 के रूप में कार्य करते हुए, COVID के रोगियों के फेफड़ों में NLR{25}}निर्भर साइटोकिन उत्पादन और पायरोप्टोसिस को भी सक्रिय करता है। ध्यान देने योग्य बात यह है कि, एक एनएसपी6 वैरिएंट जो स्पर्शोन्मुख सीओवीआईडी ​​​​से जुड़ा है -19 ने पायरोप्टोसिस47 को प्रेरित करने की कम क्षमता प्रदर्शित की है, जिससे अटकलें लगाई जा रही हैं कि ओमिक्रॉन एनएसपी6 में उत्परिवर्तन पायरोप्टोसिस को भी प्रभावित कर सकता है। एनएसपी6 के कार्यों पर ओमिक्रॉन उत्परिवर्तन के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए विस्तृत यंत्रवत अध्ययन की आवश्यकता होगी।

यह फिलहाल अज्ञात है कि क्या एस और एनएसपी6 में उत्परिवर्तन ओमिक्रॉन क्षीणन को चलाने के लिए एक-दूसरे के साथ मिलकर काम करते हैं। यह देखते हुए कि ओमिक्रॉन एस ने ब्रोन्किओल्स के प्रति अधिक झुकाव दिखाया, यह संभव है कि एस परिवर्तित वायरल ट्रॉपिज्म के लिए जिम्मेदार है, जबकि गैर-स्पाइक उत्परिवर्तन-जिनमें एनएसपी भी शामिल है, परिवर्तित ऊतक वातावरण के लिए मात्र अनुकूलन हैं। यह उल्लेखनीय है कि यद्यपि एनएसपी6 ओमिक्रॉन क्षीणन के पीछे प्रमुख गैर-स्पाइक प्रोटीन प्रतीत होता है, अन्य वायरल प्रोटीन के योगदान को पूरी तरह से खारिज नहीं किया जा सकता है। गैर-स्पाइक उत्परिवर्तनों की भूमिका की जांच करने वाले इन विट्रो प्रयोग सभी ACE2/TMPRSS2/Caco-2 कोशिकाओं में किए गए थे। अन्य, अधिक प्रतिरक्षा-सक्षम कोशिका प्रकारों का उपयोग करने से अन्य गैर-स्पाइक उत्परिवर्तनों के प्रभाव का भी पता चल सकता है। इसके अलावा, हमारे काइमेरिक वायरस में एक समय में केवल एक गैर-स्पाइक प्रोटीन के साथ ओमिक्रॉन एस जोड़ा गया था, जो कई वायरल प्रोटीन में उत्परिवर्तन के बीच लंबी दूरी की एपिस्टैटिक इंटरैक्शन को सीमित करता था।

Desert ginseng-Improve immunity (9)

पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

हमारे अध्ययन से पता चलता है कि ओमिक्रॉन एस के आरबीएम में उत्परिवर्तन, निष्क्रिय एंटीबॉडी से ओमिक्रॉन के बचने के मुख्य निर्धारक हैं, हालांकि एस के अन्य क्षेत्रों में उत्परिवर्तन भी योगदान करते हैं। आरबीएम के भीतर, हम उत्परिवर्तन के दो हॉटस्पॉट की पहचान करते हैं, जो ओमिक्रॉन एस को तटस्थता का विरोध करने की क्षमता देते हैं: एक में E484A प्रतिस्थापन होता है और दूसरे में पांच प्रतिस्थापनों का समूह होता है-Q493R, G496S, Q498R, N501Y और Y505H। E484ए प्रतिस्थापन को स्वस्थ्य सीरा51 द्वारा निष्प्रभावी होने से बचने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, संरचनात्मक मॉडलिंग से पता चलता है कि कुछ चिकित्सीय मोनोक्लोनल एंटीबॉडी E484 अवशेषों के साथ अत्यधिक स्थिर नमक पुल स्थापित करते हैं, जब इस अवशेष को A में बदल दिया जाता है या Q493K और Y505H परिवर्तन52 के बाद अपना बंधन पूरी तरह से खो देते हैं। इसी प्रकार, 49 ज्ञात न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडीज के साथ सीधे संपर्क करने वाले आरबीएम अवशेषों की मैपिंग से पता चला कि एन440, जी446, एस477, और टी478 कम-आवृत्ति इंटरैक्टर्स के रूप में, एन501, वाई505, और क्यू498 मध्यम-आवृत्ति इंटरैक्टर्स के रूप में, और ई484 और क्यू493 उच्च-आवृत्ति इंटरैक्टर्स53 के रूप में सामने आए। , हमारे तटस्थीकरण परख परिणामों के अनुरूप। विशेष रूप से, हालांकि ओमिक्रॉन एस की एंटीबॉडी-बाइंडिंग क्षमता क्षीण है54, इसकी रिसेप्टर-बाइंडिंग क्षमता बरकरार है। वास्तव में, ओमिक्रॉन आरबीडी में वुहान-हू -1 और डेल्टा आरबीडी25 की तुलना में एसीई2 के लिए अधिक आकर्षण है। यह इंगित करता है कि ओमिक्रॉन एस में उत्परिवर्तन इस तरह से विकसित हुए हैं कि वे एंटीबॉडी बंधन में बाधा डालते हैं लेकिन रिसेप्टर जुड़ाव को संरक्षित करते हैं। इससे एस के संरक्षित और संरचनात्मक रूप से बाधित क्षेत्रों को लक्षित करने की संभावना खुलती है जो कि सीओवीआईडी{36}} महामारी को नियंत्रित करने के लिए व्यापक स्पेक्ट्रम टीकों के डिजाइन के लिए एसीई2 मान्यता में शामिल हैं।

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

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