कैटेचिन के साथ लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज ए को लक्षित करना SNU620/5FU गैस्ट्रिक कैंसर कोशिकाओं को 5-फ्लूरोरासिल भाग 2 के प्रति संवेदनशील बनाता है

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2.5. सीए और 5फू सह उपचार माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस-आश्रित एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है

चूंकि एलडीएचए निषेध सीधे माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस को बढ़ाता है और इसकी झिल्ली क्षमता का नुकसान होता है, बाद में एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है [16,29], माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस-मध्यस्थता एपोप्टोसिस से संबंधित कारकों की जांच की गई। सीए या 5एफयू एकल उपचार एसएनयू620/5एफयू कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल रोसलेवल को थोड़ा बढ़ा देता है जब मिटोसॉक्स का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापा जाता है। हालांकि, सीए और 5 एफयू के साथ सह-उपचार ने माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस उत्पादन में काफी वृद्धि की। यह बढ़ा हुआ आरओएस उत्पादन मिटो-टेम्पो, एक माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित एंटीऑक्सीडेंट (चित्रा 5ए-सी) द्वारा उलट दिया गया था। सीए और 5एफयू के साथ उपचार के बाद विकास अवरोध भी एसएनयू620/5एफयू कोशिकाओं (चित्रा 5डी) में मिटो-टेम्पो उपचार पर बरामद किया गया था। इसके अलावा, एपोप्टोसिस का मूल्यांकन एसएनयू 620/5 एफयू कोशिकाओं में एनेक्सिन वी-एफआईटीसी / पीआई धुंधला के माध्यम से किया गया था। CA और 5FU के साथ सह-उपचार ने SNU620/5FU कोशिकाओं (चित्र 6A, B) के बीच एपोप्टोटिक कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि की। अपोप्टोसिस के दौरान परमाणु आकारिकी विखंडन प्रकट होता है, और इसे 4',6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) धुंधला [30,31] द्वारा देखा जा सकता है। नियंत्रण समूह (चित्रा 6C) की तुलना में डीएनए विखंडन को उपचार समूह में काफी वृद्धि हुई पाया गया। अंत में, Bcl-2, Bax, Caspase-9, Caspase-3, और PARP सहित एपोप्टोसिस के बायोमार्कर की जांच की गई। प्रॉपोपोटिक कैस्केड सीए और 5एफयू के साथ एसएनयू620/5एफयू कोशिकाओं (चित्रा 6डी) में सह-उपचार के बाद बढ़ गया। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि CA और 5FU के साथ सह-उपचार SNU620/5FU कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है।

चित्रा 5. कैटेचिन (सीए) और 5- फ्लोराउरासिल (5 एफयू) के साथ सह-उपचार से माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस का उत्पादन बढ़ जाता है: (ए) एसएनयू 620/5 एफयू कोशिकाओं को सीए, 5 एफयू -10 μ एम）, और मिटो के संकेतित सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। -TEMPO（20 μM） 48 घंटे के लिए। कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस को एफएसीएस विश्लेषण के माध्यम से माइटोसॉक्सटीएम रेड का उपयोग करके मापा गया था; (बी) बार ग्राफ उन कोशिकाओं की दर को दर्शाता है जो मिटोसॉक्स धुंधला के लिए सकारात्मक थे; (सी) एसएनयू 620 / 5 एफयू कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियां (एक्स 100) मिटोसॉक्स के साथ दागी गईं प्रस्तुत किए गए; (डी) कोशिकाओं की व्यवहार्यता को एमटीटी परख के माध्यम से मापा गया। परिणाम माध्य ± SEM के रूप में दिखाए जाते हैं।*p<><0.001, and=""><0.001, compared="" to="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

चित्रा 6. कैटेचिन (सीए) और 5-फ्लूरोरासिल (5एफयू) सह उपचार द्वारा एपोप्टोसिस की वृद्धि; SNU620/5FU कोशिकाओं को CA 10 uM） और / या 5FU 10 μM） के साथ 48 h∶（A） के साथ इलाज किया गया था, एपोप्टोटिक कोशिकाओं की संख्या का विश्लेषण FACSanalysis के माध्यम से PI-Annexin V धुंधला का उपयोग करके किया गया था; (B) बार ग्राफ इंगित करता है प्रारंभिक और देर से एपोप्टोटिक चरणों में कोशिकाओं का प्रतिशत। परिणाम माध्य ± SEM के रूप में दिखाए जाते हैं।**p<0.001, compared="" to="" the="" control;(c)="" the="" nuclei="" of="" the="" cells="" were="" stained="" with="" dapl,="" and="" fluorescence="" microscopic="" images="" were="" taken="" (x200).="" the="" white="" arrowhead="" indicates="" apoptotic="" cells.="" scale="" bar,="" 10="" um;="" (d)the="" expression="" levels="" of="" proteins="" related="" to="" the="" apoptotic="" pathway="" were="" measured="" by="" western="" blot="" analysis.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

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3. चर्चा

इस अध्ययन में, 5FU के लिए रसायन विज्ञान की विशेषता और मूल्यांकन करने के लिए, हमने SNU620/5FU कोशिकाओं का उपयोग किया, जो कि दवा एकाग्रता [32] के क्रमिक वृद्धि के साथ 5FU के दीर्घकालिक जोखिम द्वारा स्थापित किए गए थे। पैतृक SNU620 कोशिकाओं को एक्सॉन 5 [33] में एक समयुग्मजी विलोपन के साथ एक p53 उत्परिवर्ती को परेशान करने की सूचना मिली है। डीएनए माइक्रोएरे के आधार पर, थाइमिडाइलेट सिंथेटेज़, क्षति-विशिष्ट डीएनए बाइंडिंग प्रोटीन 2, क्लस्टरिन और मिडकाइन सहित रसायन विज्ञान में शामिल कई जीन, SNU620/5FU कोशिकाओं [32] में उन्नत होते हैं। पिछले कई अध्ययनों ने एंटी-माइटोसिस, एएमपीके सक्रियण, और कैनाबिनोइड रिसेप्टर सिग्नलिंग [34-36] के माध्यम से 5FU के प्रतिरोध के खिलाफ दवाओं की इन विट्रो प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक मॉडल के रूप में SNU620/5FUcell लाइन का उपयोग किया है। हालाँकि, SNU620/5FU कोशिकाओं में चयापचय संबंधी जीनों की चयापचय विशेषताओं और अभिव्यक्ति के स्तर और रसायन विज्ञान में उनकी भूमिकाओं की बड़े पैमाने पर जांच नहीं की गई है।

यहां, हमने दिखाया कि SNU620/5FU कोशिकाओं में उन्नत ग्लाइकोलाइटिक फेनोटाइप हैं, जिनमें उन्नत लैक्टेट उत्पादन और पाइरूवेट से लैक्टेट के रूपांतरण से संबंधित एंजाइमों की अभिव्यक्ति शामिल है, जैसे LDHA। PDHA1 का फॉस्फोराइलेशन, उन्नत PDK2 और PDK3 द्वारा कम PDH गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है, SNU620 / 5FU-प्रतिरोधी कोशिकाओं में भी SNU620 मूल कोशिकाओं की तुलना में वृद्धि हुई है। हालांकि, प्रतिरोधी कोशिकाओं में ओसीआर में उल्लेखनीय कमी नहीं आई। इस विसंगति के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण टीसीए चक्र के लिए कैंसर कोशिकाओं की पोषक प्लास्टिसिटी है, अर्थात, अमीनो एसिड या फैटी एसिड-व्युत्पन्न एसिटाइल-सीओए, न केवल ग्लूकोज-व्युत्पन्न एसिटाइल-सीओए, टीसीए चक्र को सब्सट्रेट की आपूर्ति कर सकता है [37 इसके साथ सहसंबंध में, 5FU-प्रतिरोधी गैस्ट्रिक कैंसर कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल फैटी एसिड ऑक्सीकरण [38] के माध्यम से स्टेमनेस को बढ़ावा देती हैं। इसके अलावा, 5FU-प्रतिरोध बढ़े हुए माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान और गतिविधि से संबंधित है, जिसमें इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ETC) एंजाइम की अभिव्यक्ति और ऑक्सीजन की खपत [39,40] शामिल है। इस प्रकार, हमने 5FU-प्रतिरोध को फिर से संवेदनशील बनाने के लिए LDHA के मॉड्यूलेशन पर ध्यान केंद्रित किया। हमारे परिणामों के आधार पर, ऑक्सामेट या सीए के साथ एलडीएचए गतिविधि के निषेध ने प्रतिरोधी एसएनयू 620/5 एफयू कोशिकाओं के विकास को सफलतापूर्वक दबा दिया और उन्हें 5 एफयू उपचार के लिए फिर से संवेदनशील बनाया। इन निष्कर्षों ने पिछले अध्ययनों के साथ एक अच्छा संबंध दिखाया, जिसमें बताया गया कि एलडीएचए के आनुवंशिक या औषधीय निषेध ने कीमोथेरेपी के प्रतिरोध को सफलतापूर्वक कम कर दिया, जिसमें 5FU [19,41,42] शामिल हैं। इस प्रकार, हमने मान लिया कि SNU620/5FU कोशिकाओं में 5FU के खिलाफ प्रतिरोध को दबाने के लिए LDHA का निषेध पर्याप्त हो सकता है।

सिस्टैन्च इम्युनिटी में सुधार कर सकता है

कई सिंथेटिक अणु, जैसे कि ऑक्सामेट, एफएक्स11, पीएसटीएमबी, और जीएनई-140 को छोटे-अणु एलडीएचए अवरोधक [11,43] के रूप में स्थापित किया गया है। इनमें से, FX11 को प्रतिरोधी ट्यूमर कोशिकाओं [44] में कीमोथेरेपी के लिए एक संवेदनशील के रूप में सूचित किया गया है। हालांकि, हालांकि कई एलडीएचए अवरोधक उपन्यास एंटीकैंसर दवाओं के रूप में अनुमोदन के लिए जांच के अधीन हैं, उनमें से किसी को भी अभी तक अनुमोदित नहीं किया गया है। इस प्रकार, नए एलडीएचए अवरोधक [45] उत्पन्न करने के लिए अधिक दवा जैसे उम्मीदवारों की आवश्यकता होती है। प्राकृतिक यौगिकों को एंटीकैंसर दवाओं के लिए संभावित संसाधनों के रूप में माना गया है, विशेष रूप से संयोजन चिकित्सा के रूप में रसायन विज्ञान पर काबू पाने में [46,47]। इसलिए, कैंसर चयापचय को लक्षित करना, विशेष रूप से पौधों से प्राप्त प्राकृतिक उत्पादों के साथ ग्लूकोज चयापचय उपन्यास कैंसर चिकित्सा विज्ञान [48] के विकास के लिए एक उभरती हुई शोध प्रवृत्ति है।

इसके अलावा, कई रिपोर्टों ने सुझाव दिया है कि प्राकृतिक उत्पाद, जैसे गॉसिपोल, गैलोफ्लेविन, क्रोसेटिन, मशीन ए, और ईजीसीजी, शक्तिशाली एलडीएचए अवरोधक हैं [43,49,50]। हालांकि इनमें से, गॉसिपोल का LDHA (IC50=9.8 uM) पर सबसे शक्तिशाली निरोधात्मक प्रभाव है, यह LDHB की गतिविधि को भी रोकता है, जो लैक्टेट को पाइरूवेट में परिवर्तित करता है [51]। हमारे परिणामों ने प्रदर्शित किया कि ईजीसीजी, एक स्थापित एलडीएचए अवरोधक और 5एफयू कीमोथेरेपी [22-25] के प्रति संवेदनशील है, एलडीएचए और एलडीएचबी गतिविधियों दोनों पर निरोधात्मक प्रभाव डालता है। एलडीएचए-विशिष्ट निरोधात्मक गतिविधियों को दर्शाने वाले प्राकृतिक उत्पाद-व्युत्पन्न एलडीएचए अवरोधकों में, जैसे मशीन ए(आईसी50 =84 μM）, क्रोसेटिन IC50 =54.9 μM）, और CA （IC{{13} }.69 μM）【49,50】, CA ने ICsn मान के संबंध में LDHA गतिविधि पर सबसे अच्छा दमनात्मक प्रभाव दिखाया। हालाँकि CA और EGCG की रासायनिक संरचनाएँ अतिरिक्त गैलिक एसिड की मात्रा को छोड़कर बहुत समान हैं, उनकी निरोधात्मक चयनात्मकताएँ थीं समान नहीं। इसके अलावा, सीए अपने डेरिवेटिव की तुलना में सबसे सरल यौगिक होने के बावजूद, इसने लैक्टेट उत्पादन और एलडीएचए गतिविधि दोनों पर सबसे अच्छा निरोधात्मक कार्रवाई दिखाई। इस प्रकार, सीए को एक के रूप में प्रदर्शित करने के लिए एक व्यापक संरचना-गतिविधि संबंध अध्ययन आयोजित किया जाना चाहिए। विशिष्ट और शक्तिशाली एलडीएचए अवरोधकों के विकास के लिए संभावित उपन्यास रीढ़।

ईजीसीजी को एनएडीपीएच के प्रतिस्पर्धी अवरोधक के रूप में जाना जाता है। इसके अलावा, ईजीसीजी एनएडीपीएच ऑक्सीडेज के स्थानान्तरण और प्रजनन [52-54] को रोकता है। हालांकि, आणविक मॉडलिंग परिणामों के अनुसार, सीए और ईजीसीजी संरचनात्मक रूप से विभिन्न स्थानों (चित्रा 3ए, बी) में स्थित हैं। इसके अलावा, उन्होंने एलडीएचए और एलडीएचबी गतिविधि के निषेध में विशिष्टता में सहसंबंध नहीं दिखाया, जो एनएडीएच का उपयोग करते हैं। और एनएडी प्लस क्रमशः एक कॉफ़ेक्टर के रूप में। इन आंकड़ों से, हमने माना कि एनएडी (पी) एच के साथ प्रतिस्पर्धा करने के तंत्र में सीए का ईजीसीजी के साथ कोई सीधा संबंध नहीं है। वैसे, कई अवरोधकों, जैसे कि FX11, GSK 2837808A, NCI-737, और NCI-006 द्वारा LDHA का निषेध, NADt उत्पादन को कम करता है और NADH संचय को बढ़ाता है, जिससे NAD प्लस का अनुपात कम हो जाता है। /एनएडीएच [16,17,55]। P53/NAD-निर्भर डीएनए क्षति मार्ग से प्रेरित अपोप्टोसिस भी LDHA निषेध द्वारा siRNA या रासायनिक अवरोधक, NH-2 [56] का उपयोग करके उठाया जाता है। GCN2-ATF4 सिग्नलिंग मार्ग को LDHA अवरोधक, GSK 2837808A [17] द्वारा प्रेरित एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु के लिए जिम्मेदार एक अन्य तंत्र के रूप में भी सूचित किया गया था। चूंकि एनएडी/एनएडीएच अनुपात रेडॉक्स होमियोस्टेसिस और सेल प्रसार [5758] में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, सीए एक एलडीएचए अवरोधक के रूप में एनएडी प्लस / एनएडीएच अनुपात के मॉड्यूलेशन के माध्यम से 5एफयू-प्रतिरोधी कैंसर कोशिकाओं को प्रभावित कर सकता है।

माता-पिता SNU620 और 5FU-प्रतिरोधी SNU620/5FU कोशिकाओं दोनों में CA ने कोशिका मृत्यु को प्रेरित किया। हालाँकि, CA- प्रेरित कोशिका मृत्यु SNU620/5FU कोशिकाओं में shRNA की कमी के माध्यम से LDHA पर निर्भर थी। इसके अलावा, CA और 5FU के सह-उपचार ने 5FU-प्रतिरोधी कोशिकाओं पर अतिरिक्त कैंसर-रोधी प्रभाव दिखाया। जैसा कि पहले बताया गया था [16,59], एलडीएचए का निषेध आरओएस को बढ़ाता है और फलस्वरूप कैंसर कोशिकाओं के विकास को दबा देता है। जब एलडीएचए को बाधित किया गया था, ऊर्जा चयापचय को ग्लाइकोलाइसिस से टीसीए चक्र और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण [60] में परिवर्तित कर दिया गया था। इस प्रकार, कैंसर कोशिकाएं अधिक आरओएस उत्पादन करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली और माइटोकॉन्ड्रियल-प्रेरित एपोप्टोसिस [61,62] को नुकसान होता है। पिछले अध्ययनों के साथ अच्छे समझौते में, सीए माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस-निर्भर मार्ग के माध्यम से एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है। बढ़ी हुई आरओएस-रक्षा क्षमता और कम एपोप्टोटिक संकेत रसायन प्रतिरोधी कैंसर कोशिकाओं के सामान्य गुण हैं, विशेष रूप से 5FU-प्रतिरोधी कोशिकाओं में 3,63]। इसके अलावा, कैंसर चयापचय में परिवर्तन, विशेष रूप से ग्लूकोज चयापचय में, सेलुलर गतिविधियों के परिवर्तन के माध्यम से कीमोथेरेपी के प्रतिरोध का कारण बनता है, जैसे कि असामान्य डीएनए की मरम्मत, बढ़ी हुई ऑटोफैगी, एपोप्टोसिस को कम करना, आरओएस के खिलाफ रक्षा, और एक्सोसोम के स्राव में वृद्धि [9,64,651] . इस प्रकार, सीए के साथ एलडीएचए सहित ग्लाइकोलाइटिक एंजाइमों को लक्षित करना रसायन विज्ञान पर काबू पाने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति हो सकती है, विशेष रूप से 5 एफयू-प्रतिरोधी गैस्ट्रिक कैंसर में। आम तौर पर, तेजी से विभाजित होने वाले घातक ट्यूमर सामान्य ऊतक की तुलना में 5FU सहित डीएनए संश्लेषण अवरोधकों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं। हालांकि, कुछ कैंसर कोशिकाएं कई तंत्रों के माध्यम से उपचार के लिए प्रतिरोध विकसित कर सकती हैं, जैसा कि पहले बताया गया है [34-36]। प्रतिरोध के विकास को धीमा करने पर, एकल यौगिक की तुलना में बायोएक्टिव यौगिकों और पारंपरिक कीमोथेरेपी के सह-उपचार का अधिक प्रभाव पड़ता है। इसलिए, कैंसर चयापचय और माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों सहित कैंसर कोशिकाओं में सिग्नलिंग मार्ग की एक विस्तृत श्रृंखला को लक्षित करने के लिए पारंपरिक कीमोथेरेपी के साथ सिद्ध साइटोटोक्सिक प्रभावों के साथ विशिष्ट फाइटोकेमिकल्स के जैविक प्रभाव, कैंसर प्रबंधन में एकल यौगिकों से बेहतर होना चाहिए क्योंकि वे देरी कर सकते हैं प्रतिरोध का विकास [67]। इस अध्ययन में, सीए और 5एफयू के संयोजन ने एकल उपचार की तुलना में सेल व्यवहार्यता पर एक उच्च अवरोध दिखाया। इसके अलावा, हमने दिखाया कि एलडीएचए गतिविधि का निषेध और बाद में माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस-मध्यस्थ एपोप्टोसिस 5FU-प्रतिरोधी कोशिकाओं (चित्रा 7) पर सीए के संवेदीकरण प्रभाव को अंतर्निहित तंत्र हो सकता है।

LDHA निषेध की क्षमता और विशिष्टता के अलावा, CA पहले से स्थापित प्राकृतिक उत्पाद-व्युत्पन्न LDH अवरोधकों की तुलना में अधिक सुरक्षित है। इसके अलावा, सीए ग्रीन टी का एक प्रसिद्ध रासायनिक घटक है, और इसकी सुरक्षा और फार्माकोडायनामिक गुणों की पुष्टि पिछले अध्ययनों [68-70] में की गई है। हालाँकि, CA और 5FU के सह-प्रशासन का सटीक विषाक्तता मूल्यांकन अभी तक नहीं किया गया है। इसके अलावा, इस अध्ययन में 5FU प्रतिरोधी कैंसर कोशिकाओं में सीए की विवो प्रभावकारिता की जांच नहीं की गई थी। हालांकि, मानव गैस्ट्रिक और पेट के कैंसर [71-77] में 5FU-प्रतिरोध सहित, रसायन विज्ञान को दूर करने के लिए सीए और इसके डेरिवेटिव के विवो एंटीकैंसर प्रभावकारिता पर पिछले अध्ययनों की रिपोर्ट है। इस अध्ययन में, हमने 5FU के प्रतिरोध पर काबू पाने के लिए CA के एक प्रमुख आणविक तंत्र के रूप में LDHA निषेध पर ध्यान केंद्रित किया। इसलिए, सीए को केमोरेसिस्टेंट कैंसर कोशिकाओं के लिए एक उपन्यास सहायक के रूप में विकसित करने के लिए, विवो प्रभावकारिता और सीए और 5 एफयू कॉट्रीटमेंट की सुरक्षा का मूल्यांकन व्यापक पशु अध्ययनों के माध्यम से किया जाना चाहिए, जिसमें ज़ेनोग्राफ़्ट मॉडल और अच्छे प्रयोगशाला विषाक्तता आकलन शामिल हैं।

4. सामग्री और तरीके

4.1. सामग्री

सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए, यूएसए) से पॉली (एडीपी-राइबोज) पोलीमरेज़, कैस्पेज़ -3, और कैस्पेज़ -9 के खिलाफ एंटीबॉडी खरीदे गए थे। LDHA, ग्लिसराल्डिहाइड 3- फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH), और PDHA1 के खिलाफ एंटीबॉडी सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, सांता क्रूज़, सीए, यूएसए) से खरीदे गए थे, और फॉस्फोर-पीडीएचए 1 और पीडीके 3 के खिलाफ एबकैम से खरीदे गए थे। एबकैम, कैम्ब्रिज, एमए, यूएसए)। इसके अलावा, PDK2 और PDK4 के खिलाफ एंटीबॉडी सिग्नलवे एंटीबॉडी (सिग्नलवे एंटीबॉडी, डलास, TX, यूएसए) से खरीदे गए थे, PDK1 के खिलाफ जो एंज़ो लाइफ साइंसेज (एंज़ो लाइफ साइंसेज, फार्मिंगडेल, एनवाई, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे, और जो बी-सेल के खिलाफ थे। लिम्फोमा -2 (बीसीएल -2) और बीसीएल -2- जुड़े एक्स प्रोटीन नोवस बायोलॉजिकल (नोवस बायोलॉजिकल, लिटलटन, सीओ, यूएसए) से खरीदे गए थे। MitoSOX को Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) से खरीदा गया था। 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT),4',{{22} सहित रसायन और अभिकर्मक }डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोल, ऑक्सामेट, निकोटीनैमाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड, सीए, और सीए डेरिवेटिव (ईसी जीसी, ईजीसी, और ईजीसीजी) मर्क (मर्क, डार्मस्टैड, जर्मनी) से खरीदे गए थे। -निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (ऑक्सीडाइज्ड फॉर्म) टोक्यो केमिकल इंडस्ट्री (टोक्यो केमिकल इंडस्ट्री, टोक्यो, जापान) से खरीदा गया था।

4.2. सेल कल्चर

मानव गैस्ट्रिक कैंसर SNU620, SNU620/5FU, और AGS, अग्नाशयी कैंसर पैनिक -1 और MIA PaCa -2, और कोलन कैंसर LS174T और RKO सेल कोरियाई सेल लाइन बैंक (KCLB, सियोल, कोरिया) से प्राप्त किए गए थे। .SNU620, SNU620/5FU, AGS, और LS174T कोशिकाओं को रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट माध्यम 1640 (RPMI -1640) (वेलजीन, डेगू, कोरिया) में संवर्धित किया गया, 10 प्रतिशत गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक। ) (गिब्को, न्यूयॉर्क, एनवाई, यूएसए) और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (इनविट्रोजन), और पैन -1, एमआईए पाका -2, और आरकेओ कोशिकाओं को डल्बेको के संशोधित ईगल के माध्यम (वेल्जीन) में सुसंस्कृत किया गया था। ) जिसमें 10 प्रतिशत ऊष्मा-निष्क्रिय FBS और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन हो। सभी कोशिकाओं को एक आर्द्र सीओ, इनक्यूबेटर में 37 डिग्री और 5 प्रतिशत सीओ 2 में सुसंस्कृत किया गया था।

4.3. सेल व्यवहार्यता परख

SNU620 और SNU620/5FUcells में CA और 5FU के साइटोटोक्सिसिटी स्तर को MTT परख का उपयोग करके मापा गया। कोशिकाओं को 24-वेल प्लेट्स (2×104 सेल/वेल) में सीए और 5FU के संकेतित दिन के लिए सुसंस्कृत किया गया था। एमटीटी समाधान (2.0 मिलीग्राम/एमएल) को तब प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया, उसके बाद 37 डिग्री पर ऊष्मायन के 3-4 घंटे और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 5 प्रतिशत सीओ। बाद में संस्कृति माध्यम को हटा दिया गया, और जीवित कोशिकाओं से फॉर्मेज़ान क्रिस्टल का अवशोषण किया गया। डीएमएसओ को फॉर्मेज़ान क्रिस्टल को भंग करने के लिए जोड़ा गया था, और इसे स्पेक्ट्रामैक्स एम 2 माइक्रोप्लेट रीडर (आणविक उपकरण, सनीवेल, सीए, यूएसए) का उपयोग करके 540 एनएम पर मापा गया था।

4.4. एक्स्ट्रासेल्युलर अम्लीकरण दर (ईसीएआर) और ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर)

ईसीएआर और ओसीआर, क्रमशः ग्लाइकोलाइसिस और ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण की सेलुलर दरों को इंगित करते हुए, सीहोरसे एक्सएफ विश्लेषक (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए, यूएसए) के साथ निगरानी की गई थी, जैसा कि पहले वर्णित है [78,79]। संक्षेप में, 6 0, 000 SNU620 या SNU620/5FU कोशिकाओं को प्रति कुएं में सीहोरसे XF सिक्स-वेल प्लेट्स में RPMI माध्यम में 1 प्रतिशत पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया गया था। 30 मिनट के ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक कुएं के माध्यम को 80 uL प्रीवार्म्ड सीरम-मुक्त माध्यम के साथ 5 mM ऑक्सामेट, एक मानक LDH अवरोधक [11] के साथ बदल दिया गया था। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था। ऊष्मायन के बाद, ECAR और OCR को मापने के लिए प्रत्येक कुएं के माध्यम को 180 μL प्रीवार्म्ड XFbase माध्यम (10 मिमी ग्लूकोज, 2 मिमी ग्लूटामाइन, और 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट; पीएच 7.4) से बदल दिया गया था। वेव 2.6.0.31 सॉफ्टवेयर (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण किया गया।

4.5. क्वांटिटैटिओ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर)

रिबोएक्स टोटल आरएनए एक्सट्रैक्शन किट (जीनऑल बायोटेक्नोलॉजी, सियोल, कोरिया) का उपयोग करके कुल आरएनए को निकाला गया था, और सीडीएनए को एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस किट (पेमरेगा, मैडिसन, डब्ल्यूआई, यूएसए）) का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन में, कुल आरएनए का 1 कुरूप इस्तेमाल किया गया था। , और संश्लेषित सीडीएनए की कुल मात्रा 20 μL है। निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रत्येक किट का उपयोग किया गया था। क्वांटिटेटिव पीसीआर को स्टेपऑनटीएम रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके रियल हेलिक्सजीपीसीआर के साथ किया गया था। किट (नैनोहेलिक्स, डेजॉन, कोरिया), 40 चक्रों के लिए 95 डिग्री पर 15 एस और 60 डिग्री पर 1 मिनट। सापेक्ष एमआरएनए स्तरों को 18एस राइबोसोमल आरएनए के स्तर के लिए सामान्यीकृत किया गया था, जो एक अंतर्जात नियंत्रण के रूप में कार्य करता था। प्राइमरों के अनुक्रम qRT-PCR के लिए प्रयुक्त तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।

4.6.Wester" धब्बा विश्लेषण

कोशिकाओं को 1 × पीबीएस से धोया गया था, और कुल प्रोटीन को RIPA बफर और 1 प्रतिशत NP -40 lysis बफर युक्त प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल टैबलेट (Roche, Basel, Switzerland) का उपयोग करके कोशिकाओं से निकाला गया था। बायो-रेड प्रोटीन परख का उपयोग करके प्रत्येक प्रोटीन सांद्रता को मापा गया। प्रत्येक नमूने से समान मात्रा में प्रोटीन को 8-15 प्रतिशत एसडीएस-पेज के माध्यम से विभाजित किया गया था, और फिर प्रोटीन को वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली (जीई हेल्थकेयर, म्यूनिख, जर्मनी) में स्थानांतरित कर दिया गया था। 5 प्रतिशत नॉनफैट सूखे दूध का उपयोग करके 1 घंटे के लिए झिल्ली को कमरे के तापमान (20-25 डिग्री) पर अवरुद्ध कर दिया गया था और रातोंरात 4 डिग्री पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था। इसके बाद, इन झिल्लियों को 10 मिनट के लिए 1 × ट्रिस-बफर खारा से तीन बार धोया गया। प्रोटीन के विशिष्ट बैंड को एक रसायनयुक्त इमेजिंग सिस्टम (ImageQuant LAS 4000; GE हेल्थकेयर) के साथ मापा गया था। प्रोटीन की अभिव्यक्ति को GAPDH द्वारा समायोजित किया गया था। 4.7.लैक्टेट उत्पादन परख

लैक्टेट उत्पादन को SNU620, SNU620/5FU, AGS, Panc-1, MIA PaCa-2, LS174T, और RKO कोशिकाओं के कल्चर मीडिया में मापा गया। इन कोशिकाओं को 37 डिग्री पर 1d के लिए ऊष्मायन किया गया था, और संस्कृति मीडिया को बाद में फिनोल लाल-मुक्त माध्यम से बदल दिया गया था, इसके बाद 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। प्रत्येक कोशिका के माध्यम का मूल्यांकन तब एक वाणिज्यिक लैक्टेट फ्लोरोमेट्रिक परख किट (बायोविज़न, मिलपिटास, सीए, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था।

4.8. LDHA और LDHB गतिविधि परख

LDHA गतिविधि का पता लगाने के लिए, CA के संकेतित सांद्रता को 2 0 मिनट के लिए 2 मिमी पाइरूवेट, 20 μM NADH, और 20 मिमी HEPES-K प्लस pH7.2） युक्त बफर में ऊष्मायन किया गया था। एलडीएचबी गतिविधि के लिए, 1 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0), 25 मिमी एनएडी प्लस और 2 एम सोडियम एल-लैक्टेट युक्त बफर का उपयोग किया गया था। संक्षेप में, शुद्ध पुनः संयोजक LDHA और LDHB प्रोटीन में से प्रत्येक के 10 नैनोग्राम इन विट्रो LDHA और LDHB गतिविधि assays के लिए उपयोग किए गए थे। सेल lysates से कुल प्रोटीन का एक माइक्रोग्राम इंट्रासेल्युलर LDHA और LDHB गतिविधि assays के लिए एक एंजाइम स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया था। 340 एनएम के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर एनएडीएच की प्रतिदीप्ति और 460 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को एक स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर (स्पेक्ट्रामैक्स एम 2; आणविक उपकरण) का उपयोग करके पता लगाया गया था, जैसा कि पहले वर्णित [80] था। एलडीएचए गतिविधि को एनएडीएच की घटी हुई मात्रा से मापा गया था, जबकि एलडीएचआईबी गतिविधि का मूल्यांकन एनएडी प्लस से परिवर्तित एनएडीएच की मात्रा को मापकर किया गया था।

4.9.प्रोटीन-छोटे अणु इंटरैक्शन

पाइरेक्स कार्यक्रम का उपयोग करके प्रोटीन और छोटे अणुओं के बीच बातचीत की भविष्यवाणी की गई थी। LDHA (PDB ID: 1l10) अणु और NCBI PubChem कंपाउंड डेटाबेस से प्राप्त CA और EGCG की 2D संरचनाओं का उपयोग Pyrex में किया गया था। CA की ID 9064 थी और EGCG की 65064 थी। सतही आवेश के सापेक्ष वितरण को अम्लीय क्षेत्र को लाल, नीले रंग में मूल क्षेत्र और सफेद रंग में तटस्थ क्षेत्र के साथ दिखाया गया था। क्रमशः सीए या ईजीसीजी के साथ एलडीएचए परिसरों में हाइड्रोजन बांड, काली बिंदीदार रेखाओं के रूप में दिखाए गए थे। परिग्रहण संख्या P00338 (LDHA) के साथ UniProt (https://www.uniprot.org, 9 नवंबर 2020 को एक्सेस किया गया) से अनुक्रम प्राप्त किए गए थे।

4.10. शॉर्ट हेयरपिन आरएनए (shRNA) का ट्रांसफेक्शन

LDHA वेक्टर को लक्षित करने वाले pLKO.1 मॉक-वेक्टर और shRNA का उपयोग किया गया था, जैसा कि पहले बताया गया था [50]। कोशिकाओं को छह-अच्छी तरह से प्लेटों (2 × 10 डिग्री कोशिकाओं / कुएं) पर रखा गया और रात भर इनक्यूबेट किया गया। SNU620/5FU कोशिकाओं को पॉलीइथिलीनमाइन (PED) (पॉलीप्लस-ट्रांसफेक्शन, llkirch, फ्रांस), जीन और PEI अनुपात 1:3 का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। फिर, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को 1 सप्ताह के लिए 1 कुरूप / एमएल पौरोमाइसिन के साथ इलाज किया गया। एक तले हुए प्लास्मिड के साथ संक्रमण के बाद नियंत्रण कोशिका रेखा उत्पन्न हुई थी।

4.11.LDHA ओवरएक्प्रेशन

प्लास्मिड pDEST27-LDHA का निर्माण LDHA cDNA (कोरिया ह्यूमन जीन बैंक, डेजॉन, कोरिया से खरीदा गया) को pDEST27 (Invitrogen) वैक्टर में सबक्लोनिंग द्वारा किया गया था। LDHA के लिए सबक्लोन के दो सेट आयोजित किए गए। LDHA के पुनर्निर्माण के लिए, SNU620/5FU-shLDHA कोशिकाओं को pDEST27-LDHA और खाली pDEST27 प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। संक्षेप में, कोशिकाओं को 70 प्रतिशत संगम तक सुसंस्कृत किया गया था। फिर, कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए डीएनए के 3ug और लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 (Invitrogen) सहित मिश्रण के साथ इलाज किया गया। ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को 1 सप्ताह के लिए 200 ug/mL G418 के साथ चुना गया था। फिर, अभिकर्मक की प्रभावकारिता की पुष्टि करने के लिए, हमने पश्चिमी धब्बा परख का प्रदर्शन किया।

4.12.एपोप्टोसिस विश्लेषण

निर्माता के निर्देश के अनुसार, एनेक्सिन वी-एफआईटीसी एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट (बीडी बायोसाइंसेस, सैन जोस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके एपोप्टोटिक कोशिकाओं का पता लगाया गया था। संक्षेप में, कोशिकाओं को छह-अच्छी तरह से प्लेटों (2 × 10 डिग्री कोशिकाओं / कुएं) पर रखा गया था और 2 दिनों के लिए सीए और 5 एफयू के संकेतित सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। 2 दिनों के उपचार के बाद, सेल को 1 × पीबीएस से धोया गया। कोशिकाओं को बाध्यकारी बफर के 500 μL में निलंबित कर दिया गया था और एनेक्सिन वी-एफआईटीसी के 5 यूएल और प्रोपीडियम आयोडाइड 'सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए' के ​​5 μL के साथ इलाज किया गया था, इसके बाद कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था। अंधकार। BD FACS CANTO I (BD Biosciences) का उपयोग करके प्रतिदीप्ति तीव्रता की जांच की गई।

4.13. माइटोकॉन्ड्रियल रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजाति (आरओएस) डिटेक्शन परख

माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस उत्पादन का पता मिटोसॉक्स रेड माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड इंडिकेटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके लगाया गया था। कोशिकाओं को छह-अच्छी तरह से प्लेटों 2 × 10 डिग्री कोशिकाओं / अच्छी तरह से और मिटो-टेम्पो （20 μM पर रखा गया था; दवा उपचार से पहले 1 घंटे के लिए सिग्मा-एल्ड्रिच का ढोंग किया गया था। कोशिकाओं को 1 × फॉस्फेट-बफर खारा （PBS） के 1 एमएल में फिर से जोड़ा गया, जिसके बाद 5 μM MitoSOXwas जोड़ा गया। कोशिकाओं को तब 37 डिग्री पर 10 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था। प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण BD FACS CANTO II (BD Biosciences) का उपयोग करके किया गया था। प्रतिदीप्ति छवि का पता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (आवर्धन, 100 ×) (Axioimager M1 माइक्रोस्कोप, कार्ल ज़ीस, ओबेरोचेन, जर्मनी) द्वारा लगाया गया था।

4.14. डीएपीआई नाभिक का धुंधला होना

SNU620/5FU को एक 24-वेल प्लेट (5×104 सेल्स/वेल) में रखा गया था और 48 घंटे के लिए CA और 5FU के संकेतित सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। 1 × पीबीएस के साथ धोने के बाद, कोशिकाओं को 1- एमएल 1 × पीबीएस में फिर से जोड़ा गया। कोशिकाओं को तब कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 4ug / mL DAPI के साथ दाग दिया गया था और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (आवर्धन, 200 ×) (कार्ल जीस) के तहत जांच की गई थी।

4.15. सांख्यिकीय विश्लेषण

सेल व्यवहार्यता, लैक्टेट उत्पादन, ईसीएआर, ओसीआर, क्यूआरटी-पीसीआर, एलडीएचए, एलडीएचबी गतिविधियों, एपोप्टोसिस और माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस के परिणाम मूल्यों को नियंत्रित करने के सापेक्ष इंगित किए गए थे और तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य की मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त किए गए थे। प्रत्येक समूह के औसत मूल्य से ऊपर के अंतरों का विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट द्वारा किया गया था, जबकि समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म (संस्करण 5। 0, ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, सैन का उपयोग करके तुकी के पोस्ट हॉक टेस्ट के साथ विचरण के एकतरफा विश्लेषण द्वारा किया गया था। डिएगो, सीए, यूएसए)।

5। निष्कर्ष

एक साथ लिया गया, प्रतिरोधी गैस्ट्रिक कैंसर SNU620/5FU कोशिकाओं में ग्लाइकोलाइटिक फेनोटाइप होते हैं, जिनमें माता-पिता SNU620 कोशिकाओं की तुलना में ऊंचा लैक्टेट उत्पादन और उच्च LDHA अभिव्यक्ति शामिल है। एलडीएचए-विशिष्ट अवरोधक के रूप में सीए के साथ ग्लाइकोलाइसिस को प्रतिबंधित करना, एसएनयू620/5एफयू कोशिकाओं को 5एफयू के प्रति संवेदनशील बनाता है। इसके अतिरिक्त, CA और 5FU के साथ सह-उपचार ने 5FU-प्रतिरोधी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस और एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु में वृद्धि की। हमारे निष्कर्ष बताते हैं कि सीए एक सहायक दवा के विकास के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार हो सकता है जो एलडीएचए गतिविधि को प्रतिबंधित करके 5FU-आधारित कीमोथेरेपी के प्रतिरोध को कम करता है।

पूरक सामग्री: निम्नलिखित https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22105406/s1, चित्र S1 पर ऑनलाइन उपलब्ध हैं: SNU620/5FU वर्ग की व्यवहार्यता पर 5FU का प्रभाव, चित्र S2: SNU620 की वृद्धि और SNU620/5FU कोशिकाओं को सेल गिनती द्वारा मापा जाता है, चित्र S3: SNU620 और SNU620/5FU कोशिकाओं के लैक्टेट उत्पादन स्तर, चित्र S4: SNU620 और SNU620/5FU कोशिकाओं में PDK आइसोटाइप की अभिव्यक्तियाँ, चित्र S5: SNU620 की व्यवहार्यता पर ऑक्सामेट का प्रभाव और SNU620/5FU कोशिकाएं, चित्र S6: LDHA और LDHB गतिविधियों पर EGCG का प्रभाव, चित्र S7: p-PDHA1, PDHA1, और PDKs प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तरों पर catechin (CA) का प्रभाव, चित्र S8: इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (ITC) विश्लेषण LDHA और CA का, चित्र S9: SNU620/5FU कोशिकाओं में LDHA अभिव्यक्ति shLDHA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट, चित्र S10: विभिन्न कैंसर कोशिकाओं में ग्लाइकोलाइटिक फेनोटाइप और सेल व्यवहार्यता का मापन, चित्र S11: पश्चिमी धब्बा परख का कच्चा डेटा।

यह लेख Int से निकाला गया है। जे. मोल. विज्ञान। 2021, 22, 5406। https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms