PEDV के रीकॉम्बिनेंट लैक्टोबैसिलस कैसी वैक्सीन का निर्माण और चूहों में इसकी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएँ

अमूर्त

पृष्ठभूमि: पोर्सिन महामारी डायरिया (पीईडी) एक संक्रामक आंत रोग है जो पोर्सिन महामारी डायरिया वायरस (पीईडीवी) के कारण होता है, जिसमें उल्टी, दस्त, एनोरेक्सिया और निर्जलीकरण होता है, जिससे दुनिया भर में भारी आर्थिक नुकसान हुआ है। वर्तमान में, पीईडी के प्रसार को नियंत्रित करने के लिए वैक्सीन प्रतिरक्षा अभी भी सबसे प्रभावी तरीका है। इस अध्ययन में, हमने एक नवीन पुनः संयोजक एल. केसी-ओएमपी16-पीईडीवीएस स्ट्रेन का निर्माण किया है जो पीईडीवी के पीईडीवीएस प्रोटीन और ब्रुसेला एबॉर्टस स्ट्रेन के ओएमपी16 प्रोटीन को व्यक्त करता है। पुनः संयोजक एल. केसी-ओएमपी{{4}पीईडीवीएस उम्मीदवार टीके की प्रतिरक्षाजन्यता जानने के लिए, इसकी तुलना बीएल{{5}ओएमपी{{6}पीईडीवीएस-एफ, बीएल{{8}ओएमपी{{) से की गई। 9}} PEDVS, और BL21-PEDVS पुनः संयोजक प्रोटीन।

परिणाम: परिणामों से पता चला कि हम सीरम में आईजीजी, न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी, आईएल {0}}, आईएल -10 और आईएनएफ- और एल केसी-ओएमपी 16- के मल में आईजीए के उच्च स्तर का पता लगा सकते हैं। पीईडीवीएस ने चूहों को प्रतिरक्षित किया, जिससे संकेत मिला कि एल. केसी-ओएमपी16-पीईडीवीएस उम्मीदवार टीका उच्च स्तर की ह्यूमरल प्रतिरक्षा, सेलुलर प्रतिरक्षा और म्यूकोसल प्रतिरक्षा को प्रेरित कर सकता है।

निष्कर्ष: इसलिए, एल. केसी-ओएमपी16-पीईडीवीएस पीईडीवी संक्रमण की रोकथाम के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार टीका है।

कीवर्ड: PEDV, लैक्टोबैसिलस कैसी वैक्सीन, PEDV S प्रोटीन, OMP16, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएँ

पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

परिचय

पोर्सिन महामारी डायरिया (पीईडी) पोर्सिन महामारी डायरिया वायरस (पीईडीवी) के कारण होता है, जिसमें दस्त, उल्टी, एनोरेक्सिया, निर्जलीकरण और पिगलेट में वजन घटाने जैसे लक्षण होते हैं [1, 2]। सभी उम्र के सूअर अलग-अलग लक्षणों से संक्रमित हो सकते हैं और सूअर के बच्चों में मृत्यु दर 100% तक होती है [3], जिससे दुनिया भर में भारी आर्थिक नुकसान हुआ है। पीईडीवी के प्रसार को नियंत्रित करने के लिए, अधिकांश प्रकार के टीकों का निर्माण किया जाता है, जैसे एल्यूमीनियम हाइड्रॉक्साइड-सहायक निष्क्रिय टीका, द्विसंयोजक निष्क्रिय वोट ट्रांसमिसिबल गैस्ट्रोएंटेरिटिस वायरस (टीजीईवी), और पीईडीवी टीका, और क्षीण पीईडीवी टीका [4]। हालाँकि ये टीके पीईडी को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, लेकिन इन सभी में अपनी खामियाँ हैं। निष्क्रिय टीके सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सक्रिय नहीं कर सकते हैं, क्षीण टीके बहुत सुरक्षित नहीं हैं, और वे म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के वायरस-विशिष्ट आईजीए एंटीबॉडी के पर्याप्त उत्पादन को प्रेरित नहीं कर सकते हैं। इसलिए, पीईडी को नियंत्रित करने के लिए एक नया टीका विकसित करना आवश्यक और तत्काल है।

लैक्टोबैसिलस कैसी को अक्सर मौखिक टीकाकरण में एंटीजन की लक्षित डिलीवरी के लिए एक प्रकार की सुरक्षित वेक्टर प्रणाली माना जाता है, जिसका मनुष्यों और जानवरों के स्वास्थ्य पर लाभकारी प्रभाव पड़ता है [5]। इस बीच, इसका उपयोग टी-हेल्पर सेल प्रतिक्रिया को विनियमित करने और म्यूकोसल प्रतिरक्षा के लिए विशिष्ट आईजीए के स्राव को उत्तेजित करने के लिए एक वितरण प्रणाली के रूप में किया जा सकता है [6]। दूसरी ओर, लैक्टोबैसिलस कैसी रीकॉम्बिनेंट टीका लगाना आसान है, अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया की संभावना कम है, और पारंपरिक टीकों की तुलना में अधिक लागत प्रभावी है। रिपोर्टों के आधार पर, लैक्टोबैसिलस कैसी रीकॉम्बिनेंट टीकों का उपयोग मानव पेपिलोमावायरस, स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया और एस्चेरिचिया कोली [7-9] की रोकथाम और नियंत्रण में सफलतापूर्वक किया गया है। पीईडी टीकों को डिजाइन करने में भी कुछ इसी तरह के प्रयास किए जा रहे हैं। शोधकर्ताओं ने पाया कि एक पुनः संयोजक लैक्टोकोकस लैक्टिस स्ट्रेन जो एक प्रकार के पोर्सिन महामारी डायरिया वायरस एस 1 जीन को व्यक्त करता है, प्रतिरक्षित चूहों में आईएल -4 और आईएफएन- के उच्च स्तर को प्रेरित कर सकता है [10]। लैक्टोबैसिलस कैसी-आधारित एंटी-पीईडीवी वैक्सीन माइक्रोफोल्ड सेल-टारगेटिंग पेप्टाइड सीओ1 को पीईडीवी के सीओई एंटीजन के साथ जोड़कर एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकती है [11]। PEDV वैक्सीन की प्रभावशीलता में सुधार करने के लिए। इस अध्ययन में, हम PED के एक नए लैक्टोबैसिलस कैसी रीकॉम्बिनेंट वैक्सीन का निर्माण करते हैं, जो मौखिक प्रशासन के माध्यम से PEDV संक्रमण के खिलाफ मजबूत म्यूकोसल, ह्यूमोरल और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उत्तेजित कर सकता है। पीईडीवी, कोरोनाविरिडे परिवार का एक सदस्य है, जिसमें चार संरचनात्मक प्रोटीन होते हैं जिनमें 150-220 केडीए ग्लाइकोसिलेटेड स्पाइक (एस) प्रोटीन, 20-30 केडीए झिल्ली (एम) प्रोटीन, 7 केडीए लिफाफा (ई) प्रोटीन, 58 केडीए होते हैं। न्यूक्लियोकैप्सिड (एन) प्रोटीन [12]। वहां, एस प्रोटीन को एस1 (1-735 अमीनो एसिड) और एस2 (अंतिम अमीनो एसिड) डोमेन [13] में विभाजित किया जा सकता है, और एस1 प्रोटीन में रिसेप्टर-बाइंडिंग क्षेत्र और मुख्य न्यूट्रलाइजिंग एपिटोप्स शामिल हैं [ 14]. वैक्सीन सहायक एक इम्युनोमोड्यूलेटर के रूप में कार्य करता है और सह-प्रदत्त एंटीजन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित और बढ़ा सकता है। ब्रुसेला एबॉर्टस स्ट्रेन के OMP16 प्रोटीन को विवो में डेंड्राइटिक कोशिकाओं को सक्रिय करने, th1 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए सत्यापित किया गया था, और यह एक आशाजनक स्व-सहायक टीका था [15-17]। इसलिए, हमारे अध्ययन में ओएमपी16 प्रोटीन को लैक्टो बैसिलस केस रीकॉम्बिनेंट वैक्सीन में डाला गया था। अब तक, PEDV के लैक्टोबैसिलस कैसी री रीकॉम्बिनेंट वैक्सीन के बारे में कुछ अध्ययन सामने आए हैं। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य एक नवीन लैक्टोबैसिलस कैसी कैंडिडेट मौखिक टीका का निर्माण करना है, जो पीईडी के प्रसार को रोकने के लिए बेहतर ह्यूमरल प्रतिरक्षा, सेलुलर प्रतिरक्षा और म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रदान कर सकता है।

चीनी जड़ी बूटी सिस्टैंच पौधा-एंटीट्यूमर

सामग्री और तरीके

बैक्टीरियल स्ट्रेन, वायरस, कल्चर स्थितियां, प्लास्मिड और प्राइमर

सिस्टैंच पाउडर

इस अध्ययन में उपयोग किए गए जीवाणु उपभेद, प्लास्मिड और प्राइमर तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं। लैक्टोबैसिलस केसी एटीसीसी 393 के मानक संदर्भ तनाव को डी मैन रोगोसा और शार्प (एमआरएस) शोरबा में 37 डिग्री [18] पर संवर्धित किया गया था। बीएल21 (डीई3) और डीएच5 को लुरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम में 37 डिग्री [19] पर संवर्धित किया गया। पुनः संयोजक लैक्टोबैसिल लुस केसी, बीएल 21 (डीई 3), और डीएच 5 उपभेदों को क्रमशः उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ संबंधित माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था। ब्रुसेला एबॉर्टस को ट्राइप्टिक सोया ब्रोथ (टीएसबी) या ट्राइप्टिक सोया एगर (टीएसए) माध्यम (डिफ्को लेबोरेटरीज, डेट्रॉइट, एमआई, यूएसए) में 37 डिग्री पर उगाया गया था। PEDV उपभेदों से संक्रमित वेरो कोशिकाओं को 10 ug/mL ट्रिप्सिन (गिब्को, लैंगली, VA, यूएसए) के पूरक के साथ DMEM (गिब्को, लैंगली, VA, यूएसए) में संवर्धित किया गया था [20]। pVE5523 और pET28a (+) प्लास्मिड क्रमशः लैक्टोबैसिलस केसी और एस्चेरिचिया कोली के अभिव्यक्ति वैक्टर थे।

तालिका 1 इस अध्ययन में प्रयुक्त जीवाणु उपभेदों, प्लास्मिड और प्राइमरों की विशेषताएं

पुनः संयोजक लैक्टोबैसिलस कैसी और बीएल21 उपभेदों का निर्माण

पुनः संयोजक अभिव्यक्ति प्लास्मिड का निर्माण तालिका 1 में प्लास्मिड और प्राइमर के आधार पर किया गया था। सबसे पहले, PEDV S जीन का आंशिक अनुक्रम (493-708 अमीनो एसिड), PEDV S' जीन का आंशिक अनुक्रम (493-708 अमीनो एसिड), और ब्रुसेला एबॉर्टस OMP16 जीन (26-168 अमीनो एसिड) के आंशिक अनुक्रम को क्रमशः प्राइमर जोड़े PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2, और OMP16-F/R का उपयोग करके बढ़ाया गया था। इसके बाद, बीच में फंसे लिंकर पॉलीपेप्टाइड (GGGGSGGGGGGGGGS) के साथ एक नया टुकड़ा OMP 16- PEDVS बनाने के लिए OMP16 और PEDVS के टुकड़ों में ओवरलैप एक्सटेंशन विधि का उपयोग किया गया था। फिर, पुनः संयोजक प्लास्मिड pET28a-PEDVS उत्पन्न करने के लिए टुकड़े PEDVS को EcoRI/XbaI प्रतिबंध एंजाइमों के साथ pET28a प्लास्मिड में डाला गया, और नए टुकड़े OMP16-PEDVS को EcoRI/XbaI और SalI/EcoRV के साथ pET28a और pVE5523 प्लास्मिड में डाला गया। क्रमशः पुनः संयोजक प्लास्मिड pET28a-OMP{{25}PEDVS और pVE{26}}OMP16-PEDVS उत्पन्न करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम। पुनर्योगज प्लास्मिड (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS, और pVE5523-OMP16-PEDVS) को परिवर्तन या इलेक्ट्रोपोरेशन के आधार पर BL21 (DE3) या लैक्टोबैसिलस कैसी ATCC393 में बदल दिया गया। रिपोर्ट किया गया पेपर [21]।

वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण

BL21-pET28a-PEDVS, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS, और L. केसी-पीवीई{{8}OMP16- PEDVS उपभेदों की प्रोटीन अभिव्यक्ति थी कुछ संशोधन के साथ रिपोर्ट की गई विधि के आधार पर पता लगाया गया [21-23]। पुनः संयोजक उपभेदों BL{{12}pET28a-PEDVS और BL21-pET28a OMP16-PEDVS को LB शोरबा में संवर्धित किया गया और IPTG का उपयोग pET28a-PEDVS और pET28a-OMP की कटाई के लिए किया गया। } PEDVS प्रोटीन। रिक्त वेक्टर का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। कोशिका विश्लेषण और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला और तलछट एकत्र किया गया। फिर, पिछले अध्ययन के आधार पर निकेल एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी कॉलम का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन को शुद्ध किया गया था [24]। इस बीच, पुनः संयोजक एल. केसी पीवीई{{24}ओएमपी16-पीईडीवीएस स्ट्रेन के सांस्कृतिक सतह पर तैरनेवाला को भी 4 डिग्री पर 10 मिनट के लिए 9000×जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया था। इसके बाद, सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) लोडिंग बफर के साथ नमूनों को 10 मिनट तक उबाला गया। प्रोटीन को 12% सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रो-फोरेसिस (एसडीएस-पेज) द्वारा अलग किया गया और फिर पीवीडीएफ झिल्ली (मिलिपोर, मिसिसॉगा, ओएन, कनाडा) में स्थानांतरित किया गया। मेम ब्रैन्स को 37 डिग्री पर 2 घंटे के लिए 5% स्किम्ड दूध के साथ अवरुद्ध किया गया और फिर 4 डिग्री पर रात भर एस प्रोटीन के म्यूरिन मोनोक्लोनल एंटी-बॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया और एचआरपी संयुग्मित बकरी एंटी-माउस आईजीजी (एबीक्लोनल, वुहान, चीन) के साथ 2 घंटे के लिए रखा गया। 37 डिग्री. प्रोटीन बैंड की कल्पना क्लैरिटी™ वेस्टर्न ईसीएल ब्लॉटिंग सबस्ट्रेट (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके की गई थी।

टीकाकरण और नमूना संग्रह

पुनः संयोजक लैक्टोबैसिलस कैसी वैक्सीन की इम्युनोजेनेसिटी का मूल्यांकन छह सप्ताह की महिला विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ) BALB/c चूहों [10, 18] का उपयोग करके किया गया था, जिन्हें शेडोंग कृषि विश्वविद्यालय पशु केंद्र से खरीदा गया था। कुल 50 चूहों को यादृच्छिक रूप से 5 समूहों में विभाजित किया गया था और प्रत्येक समूह में 10 चूहे थे। चूहों को क्रमशः पुनः संयोजक लैक्टोबैसिलस कैसी वैक्सीन और शुद्ध प्रोटीन (pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+फ़्रायंड का पूर्ण सहायक) से प्रतिरक्षित किया गया। टीकाकरण प्रोटोकॉल तालिका 2 के आधार पर किया गया था और 13 दिनों के बाद एक बूस्टर टीकाकरण दिया गया था। सीरोलॉजिकल अध्ययन के लिए, टीकाकरण के 0, 14 और 28 दिनों के बाद टेल वेन पंचिंग के माध्यम से सीरम एकत्र किया गया और उपयोग किए जाने तक -20 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। टीकाकरण से 1 दिन पहले और प्रत्येक बूस्टिंग समय पर मल एकत्र किया गया था। आईजीए का पता लगाने के लिए, मल को एकत्र करने के तुरंत बाद 1:4 अनुपात पर 0.05 एम सोडियम ईडीटीए के साथ पतला (डब्ल्यू/वी) किया गया और उचित मिश्रण के बाद 4 डिग्री पर 14 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। सतह पर तैरनेवाला 12, 000×g सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया था और उपयोग होने तक - 20 डिग्री पर संरक्षित किया गया था। 28वें डीपीआई पर; पहले वर्णित लेखक के अनुसार प्रत्येक समूह से तीन चूहों की बलि दी गई और आईजीए का पता लगाने के लिए आंत को संसाधित किया गया [10, 18, 23]।

एंटीबॉडी स्तरों का निर्धारण विश्लेषण

सीरा में आईजीजी और मल में आईजीए के स्तर को कुछ संशोधनों के साथ एलिसा विधियों द्वारा मापा गया था [18, 23]। विधियाँ इस प्रकार थीं: पॉलीस्टाइरीन माइक्रोटिटर प्लेटों को 100 μL 10 ug/mL PEDVS प्रोटीन, OMP{5}}PEDVS प्रोटीन, या 100 μL पुनः संयोजक L. केसी-OMP16-PEDVS स्ट्रेन के साथ 4 डिग्री पर रात भर लेपित किया गया। . 5% स्किम्ड दूध के साथ अवरुद्ध करने के बाद, एकत्र किए गए नमूनों को पीबीएस में क्रमिक रूप से पतला किया गया, तीन प्रतियों में जोड़ा गया, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया। फिर, एक एचआरपी-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी या आईजीए एंटीबॉडी (इनवी ट्रोजन, यूएसए) को प्रत्येक कुएं (1:5000) में जोड़ा गया और 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। प्रत्येक चरण के दौरान पॉलीस्टाइरीन माइक्रोटिटर प्लेटों को 5 बार धोया गया। अंत में, प्रत्येक कुएं में 100 μL TMB सब्सट्रेट (टेट्रामेथिलबेन्ज़िडाइन और H2O2) जोड़ा गया और 10 मिनट के बाद 50 μL स्टॉप सॉल्यूशन जोड़ा गया। 630 एनएम पर OD मान मल्टीमोड प्लेट रीडर (EnVision) का उपयोग करके मापा गया था।

वायरस निराकरण परीक्षण

सीरा में पीईडीवी के निष्क्रिय एंटीबॉडी टाइटर्स की जांच कुछ संशोधनों के साथ तरीकों के अनुसार की गई थी [25, 26]। संक्षेप में, म्यूरिन सीरम को गर्मी-निष्क्रिय किया गया (30 मिनट के लिए 56 डिग्री) और फिर प्रत्येक नमूने के तीन प्रतियों के साथ 96 वेल प्लेट्स (कॉर्निंग, यूएसए) में क्रमिक रूप से दो गुना पतला किया गया। फिर, 200 TCID50 / 50 μL PEDV उपभेदों की एक समान मात्रा को 96 वेल प्लेटों में जोड़ा गया और 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। मिश्रण को वेरो सेल मोनोलेयर्स से लेपित नई 96 वेल प्लेटों में जोड़ा गया और 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर कोशिकाओं को धोया गया और 5% CO2 में 37 डिग्री पर रखरखाव माध्यम में ऊष्मायन किया गया। 2 दिनों के बाद, एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) देखा गया, और तटस्थ आकार की एकाग्रता को सीरम में एंटीबॉडी की सबसे कम एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया था।

तालिका 2 BALB/c चूहों का प्रतिरक्षा प्रोटोकॉल

साइटोकाइन का पता लगाना

साइटोकिन्स के स्राव का पता लगाने के लिए, प्रयोगशाला चूहों (0, 14, और 28 दिन) से सतह पर तैरनेवाला प्राप्त किया गया था। स्रावित आईएल -4, आईएल -10, और आईएफएन- के स्तर क्रमशः निर्माता निर्माता की सिफारिशों के अनुसार वाणिज्यिक एलिसा किट (एलाबसाइंस बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड, वुहान) का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे। साइटोकाइन को क्रमशः किटों द्वारा प्रदान किए गए मानक अभिकर्मकों से तैयार किए गए विभिन्न मानक वक्रों से मात्राबद्ध किया गया था और मल्टीमोड प्लेट रीडर (एनविज़न) [23, 27] का उपयोग करके प्रत्येक प्लेट से 450 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) मान का पता लगाया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त किए गए थे, और परिणाम ± मानक विचलन (एसडी) के साधन के रूप में प्रस्तुत किए गए थे। सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफ पैड प्रिज्म 7.0 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक., यूएसए) में दो-पूंछ वाले टी-परीक्षणों और एक-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था। महत्वपूर्ण अंतर को ∗p < 0.05 के रूप में परिभाषित किया गया था, और महत्वपूर्ण अंतर की विभिन्न डिग्री को ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗ और p < के रूप में नामित किया गया था। क्रमशः 0.001.

परिणाम

पुनः संयोजक लैक्टोबैसिलस कैसी और बीएल21 उपभेदों का सत्यापन

निर्मित पुनः संयोजक प्लास्मिड को सत्यापित करने के लिए, पुनः संयोजक अभिव्यक्ति प्लास्मिड pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS, और pVE{5}}OMP16-PEDVS को NcoI/XhoI प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करके पचाया गया, और एंजाइम पाचन परिणाम चित्र 1 में दिखाए गए थे। इलेक्ट्रोफोरेटोग्राम में लक्ष्य बैंड के आकार अपेक्षित परिणाम के समान थे और अनुक्रमण परिणामों ने संकेत दिया कि पुनः संयोजक अभिव्यक्ति प्लास्मिड ने कोई उत्परिवर्तन प्रदर्शित नहीं किया। इन परिणामों ने pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, और pVE5523-OMP16-PEDVS पुनः संयोजक प्लास्मिड के सफल निर्माण का संकेत दिया। पश्चिमी धब्बा के परिणामों से पता चला कि पुनः संयोजक प्रोटीन pET28a-OMP{{16}PEDVS और pET28a-PEDVS BL21-pET28a OMP16-PEDVS और BL21- के सतह पर तैरनेवाला में व्यक्त किए गए थे। क्रमशः pET28a-PEDVS उपभेद। पीवीई 5523-ओएमपी16-पीईडीवीएस प्रोटीन को एल. केसी-पीवीई5523- ओएमपी16-पीईडीवीएस स्ट्रेन के सांस्कृतिक सतह पर तैरनेवाला में भी सत्यापित किया गया था। चित्र 2 के विशिष्ट बैंडों से पता चला कि पुनः संयोजक प्रोटीन pET28a-OMP16- PEDVS, pVE{34}}OMP16-PEDVS, और pET28a-PEDVS सभी सफलतापूर्वक एकत्र किए गए थे (चित्र 2)।

चित्र 1 पुनः संयोजक प्लास्मिड के एंजाइम पाचन परिणाम। ए: पीवीई{{1}ओएमपी{{2}पीईडीवीएस प्लास्मिड के एंजाइम पाचन परिणाम। एम: डी8000 डीएनए लैडर मार्कर; 1: पीवीई{{5}ओएमपी16-पीईडीवीएस प्लास्मिड। बी: pet28a-OMP16-PEDVS और pET28a-PEDVS प्लास्मिड के एंजाइम पाचन परिणाम। एम: डी8000 डीएनए लैडर मार्कर; 1: pet28a-OMP16-PEDVS प्लास्मिड; 2: pET28a-PEDVS प्लास्मिड

उम्मीदवार टीकों से प्रतिरक्षित चूहों के सीरम में आईजीजी एंटीबॉडी का स्तर

उत्पन्न वैक्सीन उम्मीदवारों की विशिष्ट इम्युनोजेनेसिटी का मूल्यांकन करने के लिए, BALB/c चूहों का चयन किया गया और उन्हें 5 समूहों में विभाजित किया गया। फिर, सीरम में आईजीजी और मल में आईजीए के स्तर को वाणिज्यिक एलिसा किट से मापा गया। परिणामों से पता चला कि टीका लगाए गए समूहों के बीच आईजीजी स्तर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था और टीकाकरण से पहले सभी चूहों में लगभग कोई आईजीजी एंटीबॉडी नहीं पाया गया था। हालाँकि, पहले टीकाकरण के बाद पर्याप्त अंतर पाया गया और 28 दिनों में सीरम में आईजीजी एंटीबॉडी का स्तर 14 दिनों की तुलना में अधिक था। समूह के 5 चूहों में से, एल. केसी-ओएमपी16- पीईडीवीएस और बीएल{6}ओएमपी16-पीईडीवीएस-एफ से प्रतिरक्षित चूहों ने समान और उच्चतम इम्युनोजेनेसिटी दिखाई। इसलिए, एल. केसी-ओएमपी16- पीईडीवीएस और बीएल{{11}ओएमपी16-पीईडीवीएस-एफ उच्चतम इम्युनोजेनेसिटी पैदा कर सकता है, इसके बाद बीएल{{14}ओएमपी16- पीईडीवीएस है। और बीएल21-पीईडीवीएस (चित्र 3)।

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उम्मीदवार टीकों से प्रतिरक्षित चूहों के मल में IgA एंटीबॉडी का स्तर

उत्पन्न वैक्सीन उम्मीदवारों की विशिष्ट इम्युनोजेनेसिटी का मूल्यांकन करने के लिए, चूहों के मल में आईजीए एंटीबॉडी के स्तर का भी मूल्यांकन किया गया था। परिणामों से पता चला कि टीकाकरण से पहले कोई विशेष एंटी-पीईडीवीएस आईजीए एंटीबॉडी मौजूद नहीं थी। हालाँकि, एल. केसी-ओएमपी{{2}पीईडीवीएस प्रतिरक्षित चूहों बीएल{{3}ओएमपी{{4}पीईडीवीएस-एफ, बीएल{{6}ओएमपी{{7}) के मल में आईजीए एंटीबॉडी की बड़ी मात्रा }PEDVS, और BL21-PEDVS टीकाकरण के 14 दिन बाद चूहों का समूह बनाते हैं। टीकाकरण के 28 दिनों के बाद, एल. केसी-ओएमपी16-पीईडीवीएस प्रतिरक्षित चूहों का आईजीए एंटीबॉडी स्तर अपने उच्चतम स्तर पर पहुंच गया। इस बीच, अन्य तीन समूहों में आईजीए एंटीबॉडी स्तर में कोई स्पष्ट वृद्धि नहीं देखी गई। इसलिए, उम्मीदवार टीका एल. केसी ओएमपी{{13}पीईडीवीएस बीएल21- ओएमपी{{15}पीईडीवीएस-एफ, बीएल{{17}ओएमपी{ की तुलना में प्रतिरक्षित चूहों में एंटीबॉडी के उच्च स्तर को उत्तेजित कर सकता है। {18}}PEDVS, और BL21- PEDVS प्रतिरक्षित चूहे (चित्र 4)।

चित्र 2 पुनः संयोजक अभिव्यक्ति प्रोटीन का सत्यापन। एम: प्रोटीन मार्कर; 1: स्रावी प्रोटीन प्रपत्र पुनः संयोजक एल. केसी पीवीई5523-ओएमपी16-पीईडीवीएस स्ट्रेन; 2: BL21- pET28a-OMP16-PEDVS स्ट्रेन से शुद्ध प्रोटीन; 3: BL21-pET28a-PEDVS स्ट्रेन से शुद्ध प्रोटीन

प्रतिरक्षित चूहों में सीरम के निष्क्रिय करने वाले एंटीबॉडी स्तर

एल. केसी-ओएमपी{{1}पीईडीवीएस, बीएल21-ओएमपी16-पीईडीवीएस-एफ, बीएल21- ओएमपी16-पीईडीवीएस के उम्मीदवार टीकों के सुरक्षात्मक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए , और चूहों में बीएल 21- पीईडीवीएस, निष्क्रिय करने वाले एंटीबॉडी स्तर को मापा गया। परिणामों से पता चला कि टीकाकरण से पहले कोई निष्क्रिय एंटीबॉडी का पता नहीं चला था। टीकाकरण के 14 दिन बाद निष्क्रिय एंटीबॉडी का पता चला और बूस्टर टीकाकरण के 14 दिन बाद यह बढ़ गया। जिन चूहों को एल. केसी-ओएमपी16-पीईडीवीएस प्राप्त हुआ, उनमें एंटीबॉडी प्रतिक्रिया में बीएल के साथ मौखिक रूप से प्रशासित चूहों की तुलना में अधिक मजबूत एंटी-पीईडीवी निष्क्रिय गतिविधि थी। {{16}ओएमपी16-पीईडीवीएस, और बीएल21-पीईडीवीएस। इसलिए, उम्मीदवार टीका एल. केसी ओएमपी{{19}पीईडीवीएस उच्चतम तटस्थ एंटीबॉडी स्तर को उत्तेजित कर सकता है, इसके बाद बीएल{{20}ओएमपी16-पीईडीवीएस-एफ, बीएल21- ओएमपी{{ 24}}पीईडीवीएस, और बीएल21-पीईडीवीएस (चित्र 5)।

साइटोकाइन स्तर

एल. केसी-ओएमपी{{1}पीईडीवीएस, बीएल21-ओएमपी16-पीईडीवीएस-एफ, बीएल21- ओएमपी{{6}पीईडीवीएस, के सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया स्तर की तुलना करने के लिए, और बीएल 21- पीईडीवीएस प्रतिरक्षित चूहों, आईएल - 4, आईएल -10, और आईएफएन- क्रमशः निर्धारित किए गए थे। परिणामों से पता चला कि चूहों के सीरा में साइटोकिन्स आईएल {{11 }}, आईएल {{12 }}, और आईएफएन- का स्तर बहुत कम था और टीकाकरण से पहले उनमें कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। जबकि, IL-4, IL-10, और IFN- के नतीजों में भी इसी तरह के बदलाव देखे गए। टीकाकरण के 14 दिनों के बाद, एल. केसी-ओएमपी16-पीईडीवीएस प्रतिरक्षित चूहों में आईएल-4, आईएल-10, और आईएफएन- का स्तर बीएल21- से अधिक था। OMP{{24}PEDVS F, BL21-OMP{{26}PEDVS, और BL{27}}PEDVS चूहों को प्रतिरक्षित किया गया। बूस्टर टीकाकरण के 14 दिनों के बाद, अन्य की तुलना में एल. केसी-ओएमपी 16- पीईडीवीएस प्रतिरक्षित चूहों में एक उच्च आईएल {{29 }}, आईएल {{30 }}, और आईएफएन- स्तर का पता चला। तीन समूह. इसलिए, उम्मीदवार टीका एल. केसी-ओएमपी{{35}पीईडीवीएस उच्चतम आईएल-4, आईएल{37}} और आईएफएन-स्तर को उत्तेजित कर सकता है, इसके बाद बीएल{{39}ओएमपी{{ 40}} पीईडीवीएस-एफ, बीएल21-ओएमपी16-पीईडीवीएस, और बीएल21-पीईडीवीएस (चित्र 6)।

चित्र 3 प्रतिरक्षित चूहों के सीरम में उम्मीदवार टीकों का आईजीजी एंटीबॉडी स्तर। वाणिज्यिक एलिसा किट के माध्यम से जांच किए गए टीकाकरण से पहले या बाद में सीरम को दिन 0, 14, और 28 दिन पर एकत्र किया गया था, और 45 0 एनएम के अवशोषण पर मापा गया था। बार्स तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। * p < 0.05, ** p < 0.01, और **** p < 0.0001 क्रमशः महत्वपूर्ण अंतर की बढ़ती डिग्री का प्रतिनिधित्व करते हैं, और ns का मतलब कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है

बहस

अक्टूबर 2010 में PEDV वेरिएंट के कारण PED का बड़े पैमाने पर प्रकोप हुआ, जिसके परिणामस्वरूप चीन और दुनिया भर में जबरदस्त आर्थिक नुकसान हुआ [1]। हालाँकि, सभी पारंपरिक टीके CV777 क्लासिकल स्ट्रेन के आधार पर डिज़ाइन किए गए हैं जो PEDV वेरिएंट को पर्याप्त सुरक्षा प्रदान नहीं कर सकते हैं [4]। PEDV के प्रसार को नियंत्रित करने और आर्थिक नुकसान को कम करने के लिए, PEDV प्रकार के उपभेदों के नए टीके भी डिज़ाइन किए गए हैं। वर्तमान में, PEDV निष्क्रिय वैक्सीन और PEDV वैरिएंट उपभेदों के क्षीण टीके सभी चीनी सरकार द्वारा अनुमोदित हैं और PED को नियंत्रित करने में सभी आशाजनक संभावनाएं प्रदर्शित कर रहे हैं। लेकिन दो तरह के नए टीकों में खामियां भी मौजूद हैं। PEDV पाचन तंत्र के माध्यम से सूअर को संक्रमित करता है और इसमें आंतों के ऊतकों का ट्रॉपिज्म होता है। इसलिए, आंतों के उपकला कोशिकाओं में पीईडीवी के प्रवेश को रोकने में प्रणालीगत प्रतिरक्षा की तुलना में म्यूकोसल प्रतिरक्षा अधिक प्रभावी है, और टीकों को आंत्र पथ में म्यूकोसल सुरक्षा प्रभावी ढंग से प्रदान करनी चाहिए। इसलिए, इस अध्ययन में, हम एक नए प्रकार के टीके का निर्माण करते हैं जो मजबूत एंटी-पीईडीवी-विशिष्ट आईजीजी और आईजीए एंटीबॉडी को उत्तेजित कर सकता है। लैक्टोबैसिलस कैसी में वैक्सीन वितरण वाहन के रूप में संभावित प्रतिरक्षा-विनियामक गुण हैं और इस जीवाणु की कोशिका दीवार पर बायोएक्टिव यौगिकों की अभिव्यक्ति उचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उत्तेजित कर सकती है [28, 29]। इसका उपयोग व्यापक रूप से मानव पैपिलोमावायरस, स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया और एस्चेरिचिया कोली के कई हेटेरोल ओगस एंटीजन को पशु मॉडल में टीके के रूप में व्यक्त करने के लिए किया जाता है, जिनमें सभी ने उत्कृष्ट प्रतिरक्षाजनकता दिखाई है [7-9]। निष्क्रिय वैक्सीन और क्षीण वैक्सीन की तुलना में, लैक्टोबैसिलस कैसी वेक्टर वैक्सीन उच्च आईजीए स्तर और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को भी उत्तेजित कर सकती है। अध्ययनों से पता चला है कि आंत में आईजीए की रक्षा की पहली पंक्ति पिगलेट को पीईडीवी संक्रमण से बचाने में आईजीजी से बेहतर होगी [10, 30]। इसलिए, PED का एक प्रकार का लैक्टोबैसिलस कैसी वेक्टर वैक्सीन विकसित करना आशाजनक है। रिपोर्टों के आधार पर, PEDV के S प्रोटीन को S1 (1-735 अमीनो एसिड) और S2 (736-अंतिम अमीनो एसिड) डोमेन [13] में विभाजित किया जा सकता है, और S1 प्रोटीन में रिसेप्टर-बाइंडिंग क्षेत्र और शामिल हैं मुख्य निष्प्रभावी एपिटोप्स [14]। कोर न्यूट्रलाइजिंग एपिटोप (सीओई) पीईडीवी के खिलाफ मजबूत न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडीज को प्रेरित कर सकता है [31, 32]। एंटीजेनेसिटी विश्लेषण के साथ, पुनः संयोजक प्लास्मिड के निर्माण के लिए एस1 जीन (1477-2124 बीपी) का एक आंशिक अनुक्रम चुना गया था। यह साबित हुआ कि चयनित छोटे टुकड़े में न केवल अच्छी प्रतिरक्षा क्षमता है बल्कि यह लैक्टोबैसिलस केसी की स्रावित अभिव्यक्ति में भी योगदान देता है। दूसरी ओर, पास्केविच ने पाया कि ब्रुसेला एबॉर्टस बाहरी झिल्ली प्रोटीन 16 विवो में डेंड्राइटिक कोशिकाओं को सक्रिय कर सकता है, th1 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित कर सकता है, और प्रणालीगत और मौखिक रूप से प्राप्त ब्रुसेलोसिस के खिलाफ एक आशाजनक स्व-सहायक टीका था [15]। इसी तरह का शोध है कि ब्रूसेला एसपीपी से अनलिपिटेड बाहरी झिल्ली प्रोटीन ओएमपी16। नाक के सहायक के रूप में यह th1 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित कर सकता है और गाय के दूध के प्रोटीन के लिए th2 एलर्जी प्रतिक्रिया को नियंत्रित कर सकता है, यह भी साबित हुआ है [16]। इसलिए, हमारे अध्ययन में प्रतिरक्षा कार्य को बढ़ाने के लिए पुनः संयोजक प्लास्मिड के निर्माण के लिए omp16 जीन का एक आंशिक अनुक्रम चुना गया था। यह जानने के लिए कि क्या नवीन लैक्टोबैसिलस केसी अनुशंसित टीका ह्यूमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकता है, आईजीजी, आईजीए और न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी स्तर को मापा गया। एल. केसी-ओएमपी16- पीईडीवीएस रीकॉम्बिनेंट वैक्सीन प्रतिरक्षित चूहों के आईजीजी एंटीबॉडी स्तर का बीएल {{39}ओएमपी16-पीईडीवीएस-एफ रीकॉम्बिनेंट वैक्सीन प्रतिरक्षित चूहों से कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। हालाँकि, आईजीए और न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी का स्तर बीएल {{42}ओएमपी16-पीईडीवीएस-एफ, बीएल{{45}ओएमपी16-पीईडीवी एस, और बीएल{{47) की तुलना में अधिक था। }}PEDVS पुनः संयोजक वैक्सीन-इमाइज्ड चूहे। परिणामों से पता चला कि एल. केसी-ओएमपी16-पीईडीवीएस मजबूत हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, विशेष रूप से आईजीए एंटीबॉडी स्तरों को प्रेरित कर सकता है। अध्ययनों से पता चला है कि आईजीए आंत में रक्षा की पहली पंक्ति है और पिगलेट को पीईडीवी संक्रमण से बचाने में आईजीजी से बेहतर होगा [30]। शोध ने इस परिणाम को भी सत्यापित किया कि एल. केसी-ओएमपी16-पीईडीवीएस पुनः संयोजक टीका पीईडीवी को बेहतर प्रतिरक्षाविज्ञानी सुरक्षा प्रदान कर सकता है। पुनः संयोजक एल. केसी-ओएमपी{{55}पीईडीवीएस द्वारा प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रकार का पता लगाने के लिए, टी की गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए आईएल-4, आईएल{57}} और आईएफएन- के स्तर का पता लगाया गया। लिम्फोसाइट्स रिपोर्ट के आधार पर, IFN- जब रोगज़नक़ शरीर पर आक्रमण करते हैं, तब होने वाली सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, IL -4 हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और प्रतिरक्षा सहिष्णुता और म्यूकोसल प्रतिरक्षा को बढ़ावा देता है [33], IL -10 म्यूकोसल माइक्रोबियल संक्रमण से लड़ने और आंत के भीतर म्यूकोसल बाधा अखंडता को बनाए रखने में आवश्यक भूमिका निभाता है [34]। इस बीच, साइटोकिन का पता लगाने के परिणामों से पता चला कि चूहों को एल. केसी-ओएमपी 16- PEDVS पुनः संयोजक वैक्सीन से प्रतिरक्षित किया गया, जो IL {{66 }}, IL {{67 }}, और IFN- की मजबूत अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है, जो परिणामों का समर्थन किया कि एल. केसी-ओएमपी16-पीईडीवीएस पुनः संयोजक टीका क्रमशः मजबूत ह्यूमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, आईजीए एंटीबॉडी स्तर और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकता है।

चित्र 5 प्रतिरक्षित चूहों के सीरम में उम्मीदवार टीकों के निष्क्रिय करने वाले एंटीबॉडी स्तर। टीकाकरण से पहले या बाद के दिनों 0, 14 और 28 दिनों में सीरम एकत्र किया गया और न्यूट्रलाइजेशन परीक्षण के माध्यम से जांच की गई। बार्स तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। * p < 0.05, ** p < 0.01, और **** p < 0.0001 क्रमशः महत्वपूर्ण अंतर की बढ़ती डिग्री का प्रतिनिधित्व करते हैं, और ns का मतलब कोई महत्वपूर्ण नहीं है अंतर

चित्र 6 प्रतिरक्षित चूहों के सीरम से साइटोकिन स्तर का पता लगाना। टीकाकरण से पहले या बाद के दिनों 0, 14 और 28 दिनों में सीरम एकत्र किया गया और वाणिज्यिक एलिसा किट के माध्यम से जांच की गई। अवशोषक मान को क्रमशः IL-4 (a), IL{6}} (b), और IFN- (c) के लिए 45{8}} एनएम के अवशोषक पर मापा गया था। बार्स तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। * p < {{10}}.05, ** p < 0.01, और **** p < 0.0001 क्रमशः महत्वपूर्ण अंतर की बढ़ती डिग्री का प्रतिनिधित्व करते हैं

निष्कर्ष

संक्षेप में, एल. केसी-ओएमपी{{1}पीईडीवीएस, बीएल{{2}ओएमपी16- पीईडीवीएस-एफ, बीएल{{5}ओएमपी{{6}पीईडीवीएस, और बीएल{{7) }}इस अध्ययन में PEDVS उम्मीदवार टीकों का निर्माण किया गया। इस बीच, चूहों में इन उम्मीदवार टीकों की हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया स्तर का मूल्यांकन किया गया। परिणामों से पता चला कि चूहों को एल. केसी-ओएमपी16-पीईडीवीएस से प्रतिरक्षित किया गया, जो कि तुलना में उच्च स्तर के आईजीजी, आईजीए, निष्क्रिय करने वाले एंटीबॉडी, आईएल{10}}, आईएल- 10 और आईएनएफ- का उत्पादन कर सकते हैं। चूहों को बीएल{{13}ओएमपी{{14}पीईडीवीएस-एफ, बीएल{{16}ओएमपी16-पीईडीवीएस, और बीएल21-पीईडीवीएस से प्रतिरक्षित किया गया। इसलिए, पुनः संयोजक एल. केसी ओएमपी 16- PEDVS उम्मीदवार टीका PEDV संक्रमण की रोकथाम के लिए एक सुरक्षित, प्रभावी और सुविधाजनक पुनः संयोजक म्यूकोसल वैक्सीन के विकास के लिए आधार तैयार कर सकता है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

संदर्भ

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