बैक्टीरियल वेसिकल्स टीएलआर के माध्यम से मैक्रोफेज में वायरल प्रतिकृति को रोकते हैं।

अमूर्त

ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया स्वाभाविक रूप से नैनो-आकार के बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (ओएमवी) का स्राव करते हैं, जो संचार और रोगजनन के महत्वपूर्ण मध्यस्थ हैं। मेजबान कोशिकाओं द्वारा ओएमवी ग्रहण परिवहनित पीएएमपी के माध्यम से टीएलआर सिग्नलिंग को सक्रिय करता है। महत्वपूर्ण निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में, वायुकोशीय मैक्रोफेज वायु-ऊतक इंटरफ़ेस पर स्थित होते हैं जहां वे साँस के सूक्ष्मजीवों और कणों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति बनाते हैं। आज तक, वायुकोशीय मैक्रोफेज और रोगजनक बैक्टीरिया से ओएमवी के बीच परस्पर क्रिया के बारे में बहुत कम जानकारी है। ओएमवी और अंतर्निहित तंत्र के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया अभी भी मायावी है। यहां, हमने बैक्टीरियल वेसिकल्स (लीजियोनेला न्यूमोफिला, क्लेबसिएला न्यूमोनिया, एस्चेरिचिया कोली, साल्मोनेला एंटरिका, स्ट्रेप्टोकोकस न्यूमोनिया) के लिए प्राथमिक मानव मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया की जांच की और सभी परीक्षण किए गए वेसिकल्स में तुलनीय एनएफ-κबी सक्रियण देखा। इसके विपरीत, हम लंबे समय तक STAT1 फॉस्फोराइलेशन और मजबूत Mx1 प्रेरण के साथ एक अंतर प्रकार I IFN सिग्नलिंग का वर्णन करते हैं, जो केवल क्लेबसिएला, ई.कोली और साल्मोनेला ओएमवी के लिए इन्फ्लूएंजा ए वायरस प्रतिकृति को अवरुद्ध करता है। एंडोटॉक्सिन मुक्त क्लियर कोली ओएमवी और पॉलीमीक्सिन-उपचारित ओएमवी के लिए ओएमवी-प्रेरित एंटीवायरल प्रभाव कम स्पष्ट थे। एलपीएस उत्तेजना इस एंटीवायरल स्थिति की नकल नहीं कर सकी, जबकि टीआरआईएफ नॉकआउट ने इसे निरस्त कर दिया। महत्वपूर्ण रूप से, ओएमवी-उपचारित मैक्रोफेज से सतह पर तैरनेवाला ने वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं (एईसी) में एक एंटीवायरल प्रतिक्रिया प्रेरित की, जो ओएमवी-प्रेरित अंतरकोशिकीय संचार का सुझाव देता है। अंत में, परिणामों को प्राथमिक मानव फेफड़े के ऊतकों के साथ एक पूर्व विवो संक्रमण मॉडल में मान्य किया गया। निष्कर्ष में, क्लेबसिएला, ई.कोली और साल्मोनेला ओएमवी मैक्रोफेज, एईसी और फेफड़ों के ऊतकों में वायरल प्रतिकृति को कम करने के लिए टीएलआर 4- टीआरआईएफ-सिग्नलिंग के माध्यम से मैक्रोफेज में एंटीवायरल प्रतिरक्षा उत्पन्न करते हैं। ये ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया ओएमवी के माध्यम से फेफड़ों में एंटीवायरल प्रतिरक्षा उत्पन्न करते हैं, जिससे बैक्टीरिया और वायरल संयोग परिणामों पर संभावित निर्णायक और जबरदस्त प्रभाव पड़ता है।

सिस्टैंच पौधा-बढ़ाने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली

कीवर्ड

बाह्यकोशिकीय पुटिकाएं, बाहरी झिल्ली पुटिकाएं, जीवाणु और वायरल सह-संक्रमण, निमोनिया, मैक्रोफेज, वायुकोशीय उपकला कोशिका, एंटीवायरल जन्मजात प्रतिरक्षा

परिचय

बाहरी झिल्ली पुटिकाएं (ओएमवी) स्वाभाविक रूप से ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया द्वारा जारी की जाती हैं, जिनका व्यास 300 एनएम तक होता है। ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया झिल्ली पुटिकाओं (एमवी) को छोड़ने में समान रूप से सक्षम हैं। उनके जैवजनन के परिणामस्वरूप, इन लिपिड बाईलेयर झिल्ली संरचनाओं में, पेरिप्लास्मिक सामग्री के अलावा, बैक्टीरिया (बाहरी) झिल्ली के प्रमुख घटक जैसे लिपिड, प्रोटीन और, ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के मामले में, लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) होते हैं। [1]. जीवाणु संचार में उनकी भूमिका के अलावा, ओएमवी रोगजनक प्रभावों और विषाणु कारकों के परिवहन से जुड़े हुए हैं, उदाहरण के लिए हेलिकोबैक्टर पाइलोरी से वीएसीए, शिगेला डाइसेंटेरिया से शिगा टॉक्सिन या एंटरोहेमोरेजिक एस्चेरिचिया कोली से क्लाईए [2]। इन ओएमवी को उपकला कोशिका और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में हेरफेर करते हुए दिखाया गया था। ओएमवी सतह पर बैक्टीरियल एंडोटॉक्सिन की उपस्थिति अन्य परिवहनित रोगज़नक़-संबंधित आणविक पैटर्न (पीएएमपी) के साथ मिलकर उन्हें प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए शक्तिशाली उत्तेजक बनाती है, क्योंकि उन्हें अभी भी उनके संबंधित रिसेप्टर्स द्वारा पहचाना जा सकता है [3]। जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं में टोललाइक रिसेप्टर्स (टीएलआर) और नोड-जैसे रिसेप्टर्स की भागीदारी प्रो-इंफ्लेमेटरी और इम्यूनोरेगुलेटरी साइटोकिन्स की रिहाई को ट्रिगर कर सकती है, जिसमें न्यूट्रोफिल की भर्ती या उपकला कोशिका परतों में तंग जंक्शनों का विघटन शामिल है [4]। फेफड़े में एक महत्वपूर्ण निवासी प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार वायुकोशीय मैक्रोफेज (एएम) है, जो वायुकोश में वायु-ऊतक इंटरफ़ेस पर रहता है। साँस के कणों के अंतर्ग्रहण के माध्यम से, एएम फागोसाइटोसिस और गिरावट द्वारा सूक्ष्मजीवों और कणों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं। रोगज़नक़ मुठभेड़ पर, मैक्रोफेज अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं में एंटीजन पेश करते हैं और प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स जारी करते हैं। इस प्रकार, वे प्रकार I और II वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं (एईसी) और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र। S1A) पर कार्य कर सकते हैं। विभिन्न प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स [5, 6] के माध्यम से इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग और विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को प्रेरित करने के लिए एएम को कई पीएएमपी द्वारा सक्रिय किया जा सकता है, जिससे MyD88 या टीआरआईएफ सिग्नलिंग होती है, जो बदले में, जीन के विभिन्न उपसमूहों को प्रेरित करती है (अतिरिक्त फ़ाइल 1) : चित्र. S1B). इसके अलावा, वे फुफ्फुसीय होमियोस्टैसिस और रोगजनन में अन्य कार्यों को पूरा करते हैं, जिससे वे फेफड़ों की प्रतिरक्षा में एक केंद्रीय सिग्नलिंग केंद्र और ऑर्केस्ट्रेटर बन जाते हैं। इन्फ्लूएंजा वायरस ऑर्थोमेक्सोविरिडे के परिवार से संबंधित हैं और हल्के से लेकर गंभीर मामलों तक ऊपरी और निचले श्वसन पथ के संक्रमण का कारण बनते हैं। जबकि अधिकांश मौसमी इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण स्व-सीमित होते हैं, कुछ रोगियों में निमोनिया और तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम विकसित हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप दुनिया भर में 650,{22}} वार्षिक मौतें होने का अनुमान है [7]। इन्फ्लुएंजा ए वायरस (आईएवी) मुख्य रूप से वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को संक्रमित करता है और उनमें प्रतिकृति बनाता है। वायरल संक्रमण कई प्रतिलेखन कारकों, अर्थात् परमाणु कारक कप्पा बी (एनएफ-κबी) और इंटरफेरॉन नियामक कारक (आईआरएफ) -3/7 के माध्यम से पैटर्न पहचान रिसेप्टर (पीआरआर) सक्रियण और सिग्नलिंग की ओर जाता है, जो प्रकार I और III को प्रेरित करता है। इंटरफेरॉन (आईएफएन) उत्पादन। यह प्रमुख IFN प्रतिक्रिया परिणामस्वरूप ऑटो- और पैराक्राइन तरीके से एक सेलुलर "एंटीवायरल स्थिति" को प्रेरित करती है [8]। इसके अतिरिक्त, संक्रमण होने पर कई अन्य साइटोकिन्स और केमोकाइन भी स्रावित होते हैं। यह कसकर विनियमित मेजबान रक्षा साइटोकिन नेटवर्क प्रतिरक्षा कोशिका आबादी को संक्रमण स्थल पर भर्ती करता है और जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को व्यवस्थित करता है [9]। हालाँकि, IAV एएम को भी संक्रमित कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप तीव्र संक्रमण के दौरान एएम की संख्या काफी कम हो जाती है, जिसे संक्रमण को हल करने के लिए फिर से स्थापित करने की आवश्यकता होती है। जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सक्रियता और प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के स्राव से अतिरिक्त जन्मजात कोशिकाओं की भर्ती होती है, संक्रमण को नियंत्रित किया जाता है और ऊतक की मरम्मत शुरू की जाती है [10, 11]। यहां, हम जीवाणु बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं के प्रति मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया और बाद के आईएवी संक्रमण पर उनके प्रभाव का विश्लेषण करते हैं।

सिस्टैंच अनुपूरक लाभ-प्रतिरक्षा प्रणाली को कैसे मजबूत करें

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सामग्री और विधियां

रसायन और एंटीबॉडी

हैम का F12 माध्यम GE हेल्थकेयर यूरोप (फ़्रीबर्ग, जर्मनी) से प्राप्त किया गया था। आरपीएमआई-1640, डीएमईएम, ग्लूटामैक्स, पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन और एफसीएस लाइफ टेक्नोलॉजीज (डार्मस्टेड, जर्मनी) से खरीदे गए थे। पीबीएस को कैप्रीकॉर्न साइंटिफिक जीएमबीएच (एब्सडॉर्फरग्रंड, जर्मनी) से हासिल किया गया था। ऑप्टि-एमईएम थर्मो फिशर साइंटिफिक (फ्रैंकफर्ट, जर्मनी) से प्राप्त किया गया था। फोर्बोल 12-माइरिस्टेट 13-एसीटेट (पीएमए) की आपूर्ति सिग्मा-एल्ड्रिच केमी (म्यूनिख, जर्मनी) द्वारा की गई थी। एलपीएस (साल्मोनेला मिनेसोटा आर595, टीएलआर ग्रेड) एंज़ो लाइफ साइंसेज (लॉज़ेन, स्विट्जरलैंड) से प्राप्त किया गया था। Pam3CSK4 को इनविवोजन (सैन डिएगो, यूएसए) से खरीदा गया था। JAK अवरोधक रक्सोलिटिनिब को बायोज़ोल डायग्नोस्टिक्स वर्ट्रीब जीएमबीएच (इचिंग, जर्मनी) से प्राप्त किया गया था। पॉलीमीक्सिन बी को मर्क मिलिपोर (बिलेरिका, यूएसए) से खरीदा गया था। एबकैम (कैम्ब्रिज, यूके) से एंटीबॉडी प्राप्त की गईं: एमएक्स1 (एबी95926), इन्फ्लूएंजा न्यूक्लियोप्रोटीन (9जी8); सेल सिग्नलिंग (कैम्ब्रिज, यूके): फॉस्फो-आईआरएफ-3 (Ser396)(4D4G), फॉस्फो-टीबीके-1 (Ser172)(D52C2), TBK-1 (61223S), फॉस्फो- STAT1 (Tyr)(58D6), STAT1 (D1K9Y), माउस विरोधी खरगोश (L27A9), IRAK-1 (4359S), फॉस्फो-p38 (Tr180/Tyr182)(9211S), p38 (9212S); थर्मो फिशर वैज्ञानिक: बकरी विरोधी माउस (488 के लिए एलेक्सा); प्रोटीनटेक: एंटी-आईआरएफ -3 (66670-1) या सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (हीडलबर्ग, जर्मनी): -एक्टिन (सी4), एंटी-माउस (mIgGκBPHRP, एससी-516102)। अन्य सभी प्रयुक्त रसायन विश्लेषणात्मक ग्रेड के थे और वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किए गए थे।

जीवाणु संवर्धन और ओएमवी/एमवी तैयारी

एल. न्यूमोफिला स्ट्रेन कॉर्बी वाइल्डटाइप को पहले बताए अनुसार संभाला गया था [12]। के. निमोनिया (#700721/ एमजीएच78578), ई.कोली (#25922), और एस. एंटरिका सेरोवर टाइफिम्यूरियम (#14028) अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (रॉकविले, एमडी, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। ClearColi™ BL21 BioCat GmbH (हीडलबर्ग, जर्मनी) से था। एस. निमोनिया डी39 Δसीपीएस स्वेन हैमरस्चिमिड द्वारा प्रदान किए गए थे। बैक्टीरिया को रातोंरात एगर प्लेटों पर उगाया गया (मैककॉन्की: केपी, ईसी, साल; एलबी: क्लियर कोली; ब्लड एगर प्लेट्स: एसपी) और फिर तरल मीडिया (एलबी: केपी, ईसी, साल, क्लियर कोली; टीएचवाई: एसपी) को टीका लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया। . लगातार झटकों के तहत 37 डिग्री पर लेट लॉगरिदमिक चरण तक बैक्टीरिया विकसित हुए (मैक्सक्यू 6 {{19%), थर्मो फिशर साइंटिफिक, कार्लज़ूए, जर्मनी; एसपी को छोड़कर)। फिर बैक्टीरियल कल्चर को तीन बार (4,500×जी, 15 मिनट, 4 डिग्री; मल्टीफ्यूज एक्स3आर, थर्मो फिशर साइंटिफिक) घुमाया गया। शेष बैक्टीरिया को 0.22 µm छिद्रों के माध्यम से बाँझ निस्पंदन द्वारा हटा दिया गया। सतह पर तैरनेवाला 100 केडीए आणविक भार कट-ऑफ फिल्टर (मर्क केजीएए, डार्मस्टेड, जर्मनी) के साथ केंद्रित था और पुटिकाओं को या तो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन या आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा शुद्ध किया गया था। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के लिए, सतह पर तैरनेवाला को 100,000×g, 3 घंटे, 4 डिग्री पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज किया गया था। प्राप्त ओएमवी/एमवी गोली को बाँझ पीबीएस के साथ धोने के बाद, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन दोहराया गया और पुटिका गोली को बाँझ पीबीएस में भंग कर दिया गया। प्रोटीन सामग्री निर्माता के निर्देशों (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के अनुसार पियर्स बीसीए प्रोटीन परख किट द्वारा निर्धारित की गई थी, और उत्तेजना प्रयोगों के लिए समान प्रोटीन मात्रा का उपयोग किया गया था। एसईसी के लिए, सतह पर तैरनेवाला 500 μL तक केंद्रित था और मूल/70 एनएम जनरल 2 कॉलम (IZON साइंस लिमिटेड, ल्योन, फ्रांस) पर लोड किया गया था, जो निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार 10 एमएल पीबीएस के साथ पूर्व-धोए गए थे। पुटिकाओं को बाँझ पीबीएस का उपयोग करके साफ़ किया गया और 500 μL के अंश एकत्र किए गए। पुटिकाओं को 7-12 अंशों में निरूपित किया गया था, जो नैनो-फ्लो साइटोमेट्री (एनएफसीएम; नैनोएफसीएम कंपनी, लिमिटेड, नॉटिंघम, यूके) द्वारा निर्धारित किया गया था। एकत्रित पुटिका युक्त अंशों को आणविक भार कट-ऑफ फिल्टर (मर्क केजीएए) का उपयोग करके 200-400 μL तक केंद्रित किया गया था। सभी तैयारियों की पुटिका सांद्रता एनएफसीएम द्वारा निर्धारित की गई थी और उत्तेजना प्रयोगों के लिए समान मात्रा में पुटिकाओं का उपयोग किया गया था। दोनों शुद्धिकरण विधियों की ओएमवी/एमवी तैयारी की जांच -20 डिग्री पर एलिकोट्स में चढ़ाना और भंडारण करके बैक्टीरिया को दूषित करने के लिए की गई थी।

एनएफसी

एनएफसीएम के लिए एक नैनो एनालाइजर, (नैनोएफसीएम कंपनी लिमिटेड, नॉटिंघम, यूके) जो 488 एनएम लेजर से सुसज्जित है, को एक परिभाषित एकाग्रता के साथ 2{6}}0 एनएम पॉलीस्टाइरीन मोतियों (नैनोएफसीएम कंपनी) के साथ कैलिब्रेट किया गया था। 2.08×10^8 कण/एमएल और कण सांद्रता के लिए संदर्भ के रूप में भी उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, चार अलग-अलग आकारों के मोनोडिस्पर्स सिलिका मोतियों (नैनोएफसीएम कंपनी) का उपयोग पुटिकाओं के आकार को जांचने के लिए आकार संदर्भ मानक के रूप में किया गया था। ताज़ा फ़िल्टर किए गए (0.1 µm) 1×पीबीएस का पृष्ठभूमि संकेत के रूप में विश्लेषण किया गया और अन्य मापों से घटाया गया। प्रत्येक वितरण हिस्टोग्राम या डॉट प्लॉट 1 kPa के नमूना दबाव के साथ 1 मिनट के लिए एकत्र किए गए डेटा से प्राप्त किया गया था। ओएमवी नमूनों को फ़िल्टर किए गए (0.1 µm) 1×पीबीएस से पतला किया गया, जिसके परिणामस्वरूप कणों की गिनती 2,500-12, 000 घटनाओं की इष्टतम सीमा में हुई। कण सांद्रता और आकार वितरण की गणना एनएफसीएम सॉफ्टवेयर (एनएफ प्रोफेशन V1.08) का उपयोग करके की गई थी।

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)

कार्बन-लेपित तांबे के ग्रिड (400 जाल) को ग्लो डिस्चार्जिंग (PELCO easiGlow, Ted Pella, USA) द्वारा हाइड्रोफिलाइज़ किया गया था। पांच μL नमूने हाइड्रोफिलाइज्ड ग्रिड पर लगाए गए, और डबल डिस्टिल्ड वॉटर के साथ एक छोटे से धोने के चरण के बाद 2% (w/v) यूरेनिल एसीटेट के साथ दाग दिया गया। नमूनों का विश्लेषण 120 केवी के त्वरण वोल्टेज का उपयोग करके जेईओएल जेईएम -2100 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ किया गया था। छवियाँ F214 फास्टस्कैन सीसीडी कैमरा (TVIPS, गौटिंग, जर्मनी) से प्राप्त की गईं।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

कोश पालन

मानव कोशिका रेखाएँ (THP-1, A549, BEAS2B, Calu-3, HCC827) अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन से प्राप्त की गईं। मैडिन-डार्बी कैनाइन किडनी II कोशिकाएं (एमडीसीके II) ईसीएसीसी-सिग्मा-एल्ड्रिच (डार्मस्टेड, जर्मनी) से खरीदी गई थीं। THP-1 Dual™ (Dual) और THP-1 Dual™ TRIF-KO (TRIF−/-) सेल इनविवोजेन यूरोप (टूलूज़, फ़्रांस) से प्राप्त किए गए थे। कोशिकाओं को सेल कल्चर स्थितियों में 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 2 एमएम ग्लूटामाइन के साथ-साथ 10% हीटइनएक्टिवेटेड एफसीएस के साथ पूरक करके हैम के एफ12, डीएमईएम या आरपीएमआई -1640 में संवर्धित किया गया। THP-1 Dual™ कोशिकाओं को 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 mM ग्लूटामाइन, 10% ताप-निष्क्रिय FCS, 100 µg/mL Normocin™ और 25 mM HEPES बफर के साथ पूरक RPMI -1640 में संवर्धित किया गया। 24 घंटे के लिए 20 एनएम पीएमए जोड़कर मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं में टीएचपी -1, दोहरी और टीआरआईएफ -/- कोशिकाओं को विभेदित किया गया था।

SparQ वेक्टर में Mx1 की क्लोनिंग

निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ़्यूज़न हाई-फ़िडेलिटी डीएनए पॉलीमरेज़ (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स, इप्सविच, यूएसए) का उपयोग करके फ़्यूज़न पीसीआर द्वारा एमएक्स1 का कोडिंग अनुक्रम टीएचपी -1 सीडीएनए से उत्पन्न किया गया था। HA कोडिंग अनुक्रम को रिवर्स प्राइमर में फ़्यूज़ करके एक HATag जोड़ा गया था (अर्थात्: 5′-atcggaTTCGAAATGGTTGTT TCCGAAGTGGAC-3′, एंटीसेंस: 5′-tccgatGCGGCC GCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAA CCGGGGAACTGGGCAAG-3′)। पीसीआर टुकड़े के साथ-साथ स्पारक्यू वेक्टर (एडजीन, वॉटरटाउन, यूएसए) को बीएसटीबीआई और नॉटआई प्रतिबंध एंजाइम (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के साथ पचाया गया और टी 4 डीएनए लिगेज (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) के साथ स्पारक्यू वेक्टर में जोड़ा गया।

HEK293T कोशिकाओं का अभिकर्मक और लेंटवायरस उत्पादन

HEK293T कोशिकाओं को Opti-MEM में पतला SparQ वेक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था जिसमें Mx1 और एक GFP अनुक्रम, वायरल पैकेजिंग वेक्टर psPAX2 और लिपोफ़ेक्टामाइन 2 0 00 (थर्मो) के साथ लिफाफा प्लास्मिड pVSV-G (Addgene) शामिल था। फिशर साइंटिफिक) निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार। लेंटवायरस का उत्पादन किया गया और वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला हर दिन 72 घंटे के लिए एकत्र किया गया। सतह पर तैरनेवाला को 0.45 µm फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया था और THP -1 कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस किया गया था (नीचे देखें)। Mx1 अनुक्रम के बिना एक खाली SparQ वेक्टर का उपयोग कोशिकाओं के पारगमन के लिए संबंधित नियंत्रण सेल लाइन (VC=वेक्टर नियंत्रण) उत्पन्न करने के लिए किया गया था।

THP‑1 कोशिकाओं का पारगमन

THP-1 कोशिकाओं को HEK293T सेल कल्चर (ऊपर देखें) के फ़िल्टर किए गए सतह पर तैरनेवाला से लेंटवायरस के साथ स्थानांतरित किया गया था। ट्रांसडक्शन प्रभावकारिता में सुधार के लिए पॉलीब्रिन (4 माइक्रोग्राम/एमएल, सिग्मा-एल्ड्रिच) जोड़ा गया था। कोशिकाओं को छह दिनों तक ऊष्मायन किया गया। जीएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा क्रमबद्ध किया गया था।

बीडीएम का अलगाव और भेदभाव

स्वस्थ दाताओं से मानव मोनोसाइट्स को परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से चुंबकीय सीडी 14 सकारात्मक चयन द्वारा अलग किया गया था और 1% मानव एबीसेरम की उपस्थिति में रक्त-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीडीएम) में विभेदित किया गया था जैसा कि पहले वर्णित है [13]।

मैक्रोफेज की ओएमवी/एमवी उत्तेजना

प्राथमिक मानव मैक्रोफेज या विभेदित टीएचपी -1 कोशिकाओं को शुद्ध ओएमवी / एमवी (अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से शुद्ध किए गए पुटिकाओं के लिए प्रत्येक 1 माइक्रोग्राम / एमएल और एसईसी-शुद्ध के लिए 1, 000 की बहुलता वाले पुटिकाओं (एमओवी)) के साथ ऊष्मायन किया गया था। वेसिकल्स) पूरे मीडिया में 20 घंटे तक। अतिरिक्त अवरोधक अनुप्रयोग पुटिका उपचार से 1 घंटे पहले किया गया था। टी-उत्तेजित मैक्रोफेज का उपयोग या तो प्रोटीन या आरएनए अलगाव या बाद के संक्रमण प्रयोगों के लिए किया गया था। प्राप्त साइटोकाइन युक्त सतह पर तैरनेवाला का उपयोग एलिसा या एलडीएच विश्लेषण के लिए किया गया था या बाँझ फ़िल्टर किया गया था और उपकला कोशिका उत्तेजना के लिए उपयोग किया गया था।

वायरस शुद्धि और वायरस अनुमापन

वायरस शुद्धिकरण और वायरस अनुमापन MDCK II कोशिकाओं में किया गया जैसा कि पहले बताया गया है [14]। जैसा कि पहले बताया गया है, वायरल टिटर का निर्धारण प्लाक परख द्वारा किया गया था [15]। संक्षेप में, संगम एमडीसीके II कोशिकाएं क्रमिक रूप से पतला वायरस या ऊतक सतह पर तैरनेवाला (एफसीएस के बिना एमडीसीके II संस्कृति माध्यम में) से संक्रमित थीं। वायरस को 37 डिग्री पर 1 घंटे तक कोशिकाओं में सोखने दिया गया। दस, इनोकुलम को ताजा मीडिया (1 यूजी/एमएल टीपीसीके उपचारित ट्रिप्सिन (आईएवी के लिए) और 1% एविसेल® पीएच -101 (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ पूरक) से बदल दिया गया था। एमडीसीके II कोशिकाओं को क्रिस्टल वायलेट से रंगा गया था या वायरस-संक्रमित कोशिकाओं को प्राथमिक एंटीबॉडी (1:2,000) (माउस एंटी-इन्फ्लूएंजा ए न्यूक्लियोप्रोटीन, एमसीए400, बायो-रेड, जर्मनी) और द्वितीयक एंटीबॉडी ( 1:4,000) (बकरी एंटी-माउस आईजीजीएचआरपी, 170-6516, बायो-रेड, जर्मनी) प्लाक परख के लिए। प्लाक को मैन्युअल रूप से गिना गया और प्रति एमएल प्लाक बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) के रूप में व्यक्त किया गया।

पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

वाइरस संक्रमण

बैक्टीरियल वेसिकल्स या साइटोकाइन युक्त सतह पर तैरनेवाला के साथ 20 घंटे पूर्व-उत्तेजना के बाद, कोशिकाएं IAV या वेसिकुलर स्टामाटाइटिस वायरस (वीएसवी) से संक्रमित हो गईं। मैक्रोफेज H1N1 (A/WSN/33) या VSV से संक्रमित थे, जबकि उपकला कोशिकाएं FCS के बिना ताजा मीडिया में H1N1 (A/हैम्बर्ग/2009/PDM) दोनों से संक्रमित थीं। टीकाकरण के 1 घंटे के बाद, मुक्त वायरस को हटा दिया गया और मीडिया को IAV के लिए TPCK-ट्रिप्सिन युक्त मीडिया या VSV के लिए रिक्त मीडिया से बदल दिया गया। बहुचक्रीय प्रतिकृति की अनुमति देने के लिए कोशिकाओं को 48 घंटों तक ऊष्मायन किया गया था।

मानव पीसीएलएस की तैयारी

हनोवर मेडिकल स्कूल (एमएचएच, हनोवर, जर्मनी) में फेफड़ों के कैंसर के कारण लोब रिसेक्शन से गुजरने वाले मरीजों से फेफड़े के ऊतकों को प्राप्त किया गया था। प्रयोगों के लिए फेफड़े के स्थूल और सूक्ष्म रूप से रोग-मुक्त भागों के केवल ऊतक का उपयोग किया गया था। मानव परिशुद्धता-कट फेफड़े के स्लाइस (पीसीएलएस) को पहले वर्णित के अनुसार तैयार किया गया था [16]। प्रति कुएं दो टिश्यू स्लाइस को एक 24-वेल प्लेट में जलमग्न परिस्थितियों में (डीएमईएम/एफ12 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) 37 डिग्री, 5% सीओ2 पर रात भर में तैयार किया गया।

पीसीएलएस का आईएवी संक्रमण

पीसीएलएस को एल. न्यूमोफिला या के. न्यूमोनिया से शुद्ध किए गए 1 माइक्रोग्राम/एमएल ओएमवी से प्रेरित किया गया, जिसे डीएमईएम/एफ12 में पतला किया गया और 37 डिग्री पर 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, 20 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ पूरक किया गया। मीडिया को हटा दिया गया और पीसीएलएस को इन्फ्लूएंजा वायरस ए/कैलिफ़ोर्निया/04/2009(एच1एन1पीडीएम) के 250 μL में 25,{8}} पीएफयू/वेल के साथ टीका लगाया गया। समरूप वायरस संक्रमण को सक्षम करने के लिए पीसीएलएस को 35 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया और टीकाकरण के दौरान हर 15 मिनट में हिलाया गया। बाद में, इनोकुलम को हटा दिया गया और उसके स्थान पर 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक DMEM/F12 लगाया गया। 48 घंटे तक ऊष्मायन के बाद, वायरस का पता लगाने, एलडीएच रिलीज और साइटोकिन मात्रा का ठहराव के लिए सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था। साइटोकिन माप के लिए नमूनों को 0.2% प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल (पी1860, सिग्मा-एल्ड्रिच, म्यूनिख, जर्मनी) के साथ पूरक किया गया था और विश्लेषण तक 80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था। जैसा कि पहले वर्णित है [17] आरएनए शुद्धिकरण तक पीसीएलएस को 80 डिग्री पर जमे और संग्रहीत किया गया था।

एलडीएच

एलडीएच रिलीज परख निर्माता के निर्देशों के अनुसार रोश (मैनहेम, जर्मनी) या साइटोटॉक्सिसिटी डिटेक्शन किटप्लस (एलडीएच) (रोश, मर्क) से प्राप्त पियर्स ™ एलडीएच साइटोटॉक्सिसिटी परख किट का उपयोग करके किया गया था। अवशोषण को एक माइक्रोप्लेट रीडर अनंत F200Pro (Tecan, Männedorf, स्विट्जरलैंड) का उपयोग करके मापा गया था।

एलिसा

निर्माता के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलिसा किट (आर एंड डी सिस्टम्स, विस्बाडेन, जर्मनी) का उपयोग करके साइटोकिन्स सीएक्ससीएल 8/आईएल -8, सीएक्ससीएल 10/आईपी -10, और आईएल -1 को सेल-मुक्त सतह पर तैरनेवाला से मात्राबद्ध किया गया था। निर्देश।

क्वांटी‑ब्लू™ परख

THP-1 Dual™ और संबंधित TRIF−/− कोशिकाओं से सेल कल्चर सतह पर तैरनेवाला में SEAP की रिपोर्टर गतिविधि का निर्धारण करने के लिए, QUANTI-Blue™ परख निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था। संक्षेप में, ओएमवी के साथ कोशिकाओं की उत्तेजना के बाद सेल कल्चर सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था। सबसे पहले, क्वांटी-ब्लू™ सॉल्यूशन और सेल कल्चर सुपरनैटेन्ट को एक फैट-बॉटम 96-वेल प्लेट में डाला गया। 150 मिनट के लिए 37 डिग्री पर ऊष्मायन के बाद, 630 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व एक माइक्रोप्लेट रीडर अनंत F200प्रो में निर्धारित किया गया था।

QUANTI‑luc™ परख

THP से सेल कल्चर सतह पर तैरनेवाला में लूसिया ल्यूसिफेरेज की रिपोर्टर गतिविधि निर्धारित करने के लिए दोहरी™ और संबंधित TRIF−/− कोशिकाओं, QUANTI-Luc™ परख निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था। संक्षेप में, सेल कल्चर सुपरनैटेन्ट को एक सफेद फैट-बॉटम 96-वेल प्लेट (ब्रांड जीएमबीएच एंड कंपनी केजी, वर्थाइम, जर्मनी) में वितरित किया गया था। QUANTI-Luc™ परख समाधान जोड़ा गया और माइक्रोप्लेट रीडर इनफिनिट F200Pro में 0.1 s पढ़ने के समय के साथ ल्यूमिनसेंस माप तुरंत किया गया।

पश्चिमी ब्लॉट

प्रोटीन अभिव्यक्ति या फॉस्फोराइलेशन के निर्धारण के लिए, वेस्टर्न ब्लॉट का प्रदर्शन पहले बताए अनुसार किया गया था [18]।

आरएनए तैयारी और वास्तविक समय पीसीआर

जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, आरएनए अलगाव को फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा किया गया था और जैसा कि पहले वर्णित है [12] रिवर्स ट्रांसक्राइब किया गया था। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर को लूना यूनिवर्सल क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) और विशिष्ट प्राइमर जोड़े के साथ वीआईआईए 7 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में प्रदर्शित किया गया था। 2−ΔΔCT विधि [19] का उपयोग करके, एक्स-गुना प्रेरण की गणना की गई और परिणाम संबंधित नियंत्रण कोशिकाओं के लिए सामान्यीकृत किए गए। 18एस: एफडब्ल्यूडी: 5′-GACTCTTTCGAGGCCCTGTA-3′, रेव: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3′ CXCL8: एफडब्ल्यूडी: 5′-ACTGAGAGTGATTGAGAG TGGAC-3′, रेव: 5′-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC{ {20}}′ IFI44: fwd: 5′-TATCCAGACAGAGCTACC-3′, Rev: 5′-ATAGAGAAGGCTAAGCCGCTTC-3′ IFIT1: fwd: 5′-ATGCAGGAAGAACATGACAACC-3′, Rev: 5 ′-TCTGGACACTCCATTCTATAGCG-3' " , रेव: 5′-TGTCCTGGAGGCAGTATTCAAG-3′ IL1B: fwd: 5′-AGCTCGCCAGTGAAATGATGG-3′, रेव: 5′-CAGGTCCTGGAAGGAGCACTTC-3′ IL12B: fwd: 5′-GCCCAGAGCAAGATGTG टीसीए{{ 58}}′, रेव: 5′-CACCATTTCTCCAGGGGCAT-3' -GAAATTTCAAACAGCTGCACAAAG -3′, रेव: 5′-AATATGAGTGCAGACCGTGC-3′ RPS18: fwd: 5'-GCGGCGGAAAATAGCCTTTG-3′, रेव: 5′-GATCACACGTTCCACCTCATC-3′

इम्यूनोफ्लोरेसेंस

टीएचपी{0}} कोशिकाओं को कवरस्लिप्स पर 20 एनएम पीएमए जोड़कर विभेदित किया गया और 20 घंटे के लिए ओएमवी/एमवी के साथ इनक्यूबेट किया गया। कोशिकाओं को बाद में 4 घंटे के लिए H1N1 (A/WSN/33; संक्रमण की बहुलता (MOI) 0.1) से संक्रमित किया गया। 3% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ 15 मिनट के निर्धारण के बाद, स्लाइड्स को पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया और टीबीएस (10 मिनट, कमरे के तापमान) में 0.2% ट्राइटन एक्स -100 के साथ पारगम्य बनाया गया। अवरुद्ध करने के बाद (टीबीएस में 1% बीएसए/0.2% ट्राइटन एक्स-100), कोशिकाओं को -एनपी एंटीबॉडी (अवरुद्ध समाधान में 1:250) के साथ ऊष्मायन किया गया था। द्वितीयक एंटीबॉडी (1:1000) को डीएपीआई (1:2000) के साथ अंधेरे में 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। माउंटेड कवरस्लिप्स का विश्लेषण एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (एक्सियोविज़न, ज़ीस, जेना, जर्मनी) पर किया गया।

नीतिपरक कथन

मानव फेफड़े के ऊतकों के टुकड़ों के साथ प्रयोगों को हनोवर मेडिकल स्कूल (एमएचएच, हनोवर, जर्मनी) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और ये विश्व चिकित्सा संघ की आचार संहिता (संख्या 2701-2015) के अनुपालन में हैं। सभी रोगियों या उनके परिजनों ने अनुसंधान के लिए फेफड़े के ऊतकों के उपयोग के लिए लिखित सूचित सहमति दी। सभी रक्त दाताओं ने सूचित लिखित सहमति दी (नैतिकता अनुमोदन संख्या: 161/17)।

चित्र 1 बैक्टीरिया पुटिकाओं की विशेषता और मानव मैक्रोफेज में प्रतिक्रिया। विभिन्न बैक्टीरियल सतह पर तैरनेवाला (लीजियोनेला न्यूमोफिला (एलपी), क्लेबसिएला निमोनिया (केपी), एस्चेरिचिया कोली (ईसी), साल्मोनेला एंटरिका सेरोवर टाइफिम्यूरियम (साल), और स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया (एसपी) से आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से मुक्त प्रोटीन से बैक्टीरिया बाह्य पुटिकाओं को अलग करना। ). प्रत्येक अंश में पुटिका सांद्रता नैनो-फ्लो साइटोमेट्री (एनएफसीएम) द्वारा निर्धारित की गई थी और प्रोटीन की मात्रा बीसीए द्वारा निर्धारित की गई थी। शुद्ध ओएमवी/एमवी के बी वेसिकल आकार वितरण एनएफसी द्वारा निर्धारित किए गए थे। शुद्ध ओएमवी/एमवी की सी टीईएम छवियां। स्केल बार=50 एनएम. डी-जी बीडीएम को विभिन्न बैक्टीरिया से ओएमवी/एमवी (प्रत्येक 1 माइक्रोग्राम/एमएल) से उत्तेजित किया गया या 48 घंटे तक नियंत्रण के लिए अनुपचारित छोड़ दिया गया। डी सीएक्ससीएल8 रिलीज एलिसा द्वारा निर्धारित किया गया था और इसे एनजी/एमएल में दर्शाया गया है। IL1B (E) और IL12B (F) की अभिव्यक्ति qपीसीआर द्वारा निर्धारित की गई थी, परिणाम RPS18 के लिए सामान्यीकृत हैं और अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं के सापेक्ष दर्शाए गए हैं। जी जीवाणु पुटिकाओं के साथ 1 घंटे के ऊष्मायन के बाद, वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा IRAK {{10 }}, p38, और TBK {{12 }} की अभिव्यक्ति और फॉस्फोराइलेशन निर्धारित किया गया था। चार जैविक स्वतंत्र प्रतिकृतियों के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए गए हैं। बार्स तीन (बी) से चार (डी-एफ) स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य मान+एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। आँकड़े: 2-वे एनोवा (डीएफ); *पी<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; ns=not significant; n=3–4

आंकड़े

डेटा को कम से कम तीन जैविक रूप से स्वतंत्र प्रयोगों के लिए औसत मान + SEM के रूप में दिखाया गया है। प्रिज्म 6.07 (ग्राफपैड, ला जोला, यूएसए) का उपयोग किया गया। अयुग्मित नमूनों के लिए एक या दो-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किए गए। पी-वैल्यू 0.05 से कम या उसके बराबर को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। यदि अन्यथा इंगित नहीं किया गया है, तो परीक्षण बनाम संबंधित नियंत्रण (*) किए गए थे।

डेटा और सामग्री की उपलब्धता

इस अध्ययन के दौरान उत्पन्न या विश्लेषण किए गए सभी डेटा इस लेख और इसकी पूरक फ़ाइल में शामिल हैं।

परिणाम

ओएमवी/एमवी द्वारा मैक्रोफेज का प्रो-इंफ्लेमेटरी सक्रियण

विभिन्न बैक्टीरिया से ओएमवी/एमवी के लिए मानव प्राथमिक रक्त-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीडीएम) की जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए, लीजियोनेला न्यूमोफिला (एलपी), क्लेबसिएला निमोनिया (केपी), एस्चेरिचिया कोली (ईसी), साल्मोनेला एंटरिका सेरोवर टाइफिम्यूरियम (सैल) से पुटिकाएं ) और स्ट्रेप्टोकोकस न्यूमोनिया (एसपी) को आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) के माध्यम से अलग किया गया था। नैनो-फ्लो साइटोमेट्री (एनएफसीएम) द्वारा पुटिकाओं की संख्या और बीसीए (छवि 1 ए) द्वारा प्रोटीन की उपस्थिति के लिए अंशों का विश्लेषण किया गया था। अंश 7-12 से पुटिकाओं को एकत्रित किया गया और प्रयोगों के लिए उपयोग किया गया। ओएमवी/एमवी में एक तुलनीय आकार वितरण प्रोफ़ाइल थी (छवि 1 बी), औसत आकार में भिन्न नहीं थी (अतिरिक्त फ़ाइल 1: छवि एस 2 ए), समान रूप से केंद्रित थे (अतिरिक्त फ़ाइल 1: छवि एस 2 बी), और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन द्वारा देखे गए थे माइक्रोस्कोपी (TEM; चित्र 1C)। विभिन्न जीवाणुओं की समान पुटिका सांद्रता के अनुरूप बीडीएम को 48 घंटे तक ओएमवी/एमवी से उत्तेजित किया गया (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र एस2सी)। पुटिकाओं के साथ बीडीएम का ऊष्मायन साइटोटोक्सिक नहीं था (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र। एस2डी)। ओएमवी/एमवी ने व्यापक रूप से मैक्रोफेज से सीएक्ससीएल8 अभिव्यक्ति और रिलीज को प्रेरित किया (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र एस3ए और 1डी), जबकि आईएल1बी और आईएल12बी एमआरएनए प्रेरण समय और प्रजाति-निर्भर था (चित्र 1ई+एफ)। आईएल -1 की रिहाई उन प्रजातियों पर निर्भर थी जिनसे जीवाणु पुटिकाओं को अलग किया गया था (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र एस3बी)। यद्यपि पुटिका ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद पी38 का फॉस्फोराइलेशन बीडीएम में तुलनीय था, आईआरएके के ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया-प्रेरित गिरावट से केवल ओएमवी -1 और टीबीके के फॉस्फोराइलेशन -1 लेकिन ग्राम-पॉजिटिव से एमवी नहीं (चित्र) . 1G और अतिरिक्त फ़ाइल 1: S4A-D).

चित्र 2 बैक्टीरियल बाह्यकोशिकीय पुटिकाएं बीडीएम में टाइप I इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया को सक्रिय करती हैं। बीडीएम को विभिन्न बैक्टीरिया से ओएमवी/एमवी (प्रत्येक 1 माइक्रोग्राम/एमएल) से उत्तेजित किया गया या नियंत्रण के रूप में अनुपचारित छोड़ दिया गया। वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा ओएमवी/एमवी ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद आईआरएफ -3 का फॉस्फोराइलेशन और अभिव्यक्ति निर्धारित की गई थी। तीन जैविक रूप से स्वतंत्र प्रतिकृतियों का प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया है। IFNA1 (B), IFNB (C), IFIT1 (E), और IFI44 (F) की अभिव्यक्ति को qपीसीआर द्वारा मापा गया था, परिणाम RPS18 के लिए सामान्यीकृत हैं और अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं के सापेक्ष दर्शाए गए हैं। एसटीएटी1 का डी फॉस्फोराइलेशन ओएमवी/एमवी उत्तेजना के 2 घंटे बाद वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा निर्धारित किया गया था। चार जैविक स्वतंत्र प्रतिकृतियों का प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया है। एसटीएटी1 का जी फॉस्फोराइलेशन और एमएक्स1 की अभिव्यक्ति बैक्टीरियल वेसिकल उत्तेजना के 20 घंटे के बाद वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा निर्धारित की गई थी। चार जैविक स्वतंत्र प्रतिकृतियों के प्रतिनिधि परिणाम दर्शाए गए हैं। बार्स चार स्वतंत्र प्रयोगों से माध्य मान+SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं। आँकड़े: 2-वे एनोवा; *पी<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=4

एनएफ-κबी और एपी-1 और उनके डाउनस्ट्रीम लक्ष्यों के सक्रियण के अलावा, पीआरआर सिग्नलिंग से आईआरएफ का सक्रियण हो सकता है। इस प्रकार, आईआरएफ -3 का फॉस्फोराइलेशन निर्धारित किया गया था। Kp/Ec/SalOMVs ने BDMs (चित्र 2A) में IRF -3 के फॉस्फोराइलेशन को बढ़ा दिया, जिसके परिणामस्वरूप IFN I (चित्र 2B+C) की अभिव्यक्ति हुई, STAT1 का डाउनस्ट्रीम फॉस्फोराइलेशन (चित्र 2D और अतिरिक्त फ़ाइल 1): S4E) और इंटरफेरॉन-उत्तेजित जीन (ISGs; IFIT1, IFI44 और Mx1; चित्र 2E-G) का प्रेरण। चूँकि फॉस्फोराइलेशन की घटनाएँ आम तौर पर अल्पकालिक होती हैं और प्रतिरक्षा सिग्नलिंग कैस्केड को चालू और बंद करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जानी जाती हैं, Kp/Ec/SalOMVs (चित्र 2G और अतिरिक्त फ़ाइल 1) को जोड़ने के 20 घंटे बाद STAT1 के फॉस्फोराइलेशन की भी जाँच की गई: एस4एफ+जी). प्रयोगों से पता चला कि ओएमवी न केवल मैक्रोफेज में प्रो-इंफ्लेमेटरी सिग्नलिंग को सक्रिय कर रहे हैं बल्कि एंटीवायरल सिग्नलिंग को भी प्रेरित कर रहे हैं।

ओएमवी प्री-इनक्यूबेशन मैक्रोफेज में आईएवी प्रतिकृति को बदल देता है

Mx1 एक प्रसिद्ध एंटीवायरल कारक है जो IAV प्रतिकृति को रोकता है [20], जिसे मैक्रोफेज के Kp/Ec/SalOMV उपचार पर व्यक्त किया गया था। इसलिए हमने अनुमान लगाया कि ओएमवी पूर्व-उपचार वायरल प्रतिकृति को बदल देता है। आईएवी संक्रमण प्रयोग टीएचपी -1 कोशिकाओं में स्थापित किए गए थे, जो एमआरएनए और प्रोटीन स्तरों पर केपी/ईसी/सैलोमवी उपचार पर एमएक्स1 के समान स्तर को व्यक्त करते हैं (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र। एस5ए+बी) और एसटीएटी1 के फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित करते हैं। , जबकि कुल STAT1 प्रोटीन स्थिर रहता है (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र। S5C), H1N1 स्ट्रेन (A/WSN/33) के साथ जो मैक्रोफेज में संक्रमित और प्रतिकृति बनाता है [21]। एलपीओएमवी/एसपीएमवी के साथ टीएचपी -1 कोशिकाओं की पूर्व-उत्तेजना ने संक्रमित नियंत्रण (--) की तुलना में संक्रमण के 24 घंटे बाद आईएवी प्रतिकृति (पीआई) को बढ़ा दिया, जबकि एमएक्स 1- के साथ पूर्व-उपचार ओएमवी (केपी) को प्रेरित करता है। /Ec/Sal) ने IAV प्रतिकृति को अवरुद्ध कर दिया (चित्र 3ए)। जबकि TLR2/1 एगोनिस्ट Pam3CSK4 प्री-ट्रीटमेंट LpOMV/SpMV के साथ देखे गए प्रभाव की नकल कर सकता है, जो दोनों TLR2/1 [12, 22, 23] के माध्यम से संकेत देने के लिए जाने जाते हैं, TLR4 एगोनिस्ट के रूप में घुलनशील LPS ने Kp/Ec को पुन: उत्पन्न नहीं किया। /SalOMV प्रभाव (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S5D)। पूर्व-उपचार के बाद आईएवी लोड में अंतर वायरल न्यूक्लियोप्रोटीन (एनपी) (छवि 3 बी) के खिलाफ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा भी देखा जा सकता है। Kp/Ec/SalOMV पूर्व-उपचार ने IAV प्रतिकृति को अवरुद्ध कर दिया और NP-पॉजिटिव क्षेत्र काफी कम हो गया (चित्र 3C)। LpOMV/SpMV पूर्व-उपचार के बाद इसे नहीं देखा जा सका। यह जांचने के लिए कि क्या Mx1 प्रेरण अवलोकित अवरुद्ध IAV प्रतिकृति के लिए पर्याप्त है, Mx1 को OMV पूर्व-उत्तेजना (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S5E) की नकल करने के लिए THP -1 मैक्रोफेज में अत्यधिक अभिव्यक्त (सेक्स) किया गया था। Mx1oex कोशिकाओं के IAV संक्रमण के परिणामस्वरूप इम्यूनोफ्लोरेसेंट एनपी-पॉजिटिव क्षेत्र 4 h pi (चित्र 3D) में कमी आई और खाली वेक्टर नियंत्रण (VC) (चित्र 3E) की तुलना में वायरल प्रतिकृति 6 h pi में कमी आई। ओएमवी अनुमान के साथ तुलना में सीमा (चित्र 3ए)। निष्कर्ष में, Kp/Ec/SalOMV ने क्लासिकल प्रो-इंफ्लेमेटरी तरीके से मैक्रोफेज को सक्रिय किया और एंटीवायरल जीन को प्रेरित किया जिसके परिणामस्वरूप IFN- / रिसेप्टर (IFNAR), STAT1 का डाउनस्ट्रीम फॉस्फोराइलेशन और Mx1 की अभिव्यक्ति हुई, जो सीधे IAV प्रतिकृति में हस्तक्षेप कर सकती है ( चित्र 4ए)। एंटीवायरल प्रतिक्रिया के प्रेरण के लिए JAK/STAT सिग्नलिंग के महत्व की पुष्टि करने के लिए, पुटिका उत्तेजना से पहले एक JAK अवरोधक (JAKi) लागू किया गया था। JAK निषेध ने Kp/SalOMV-प्रेरित CXCL8 अभिव्यक्ति (चित्र 4B) को नहीं बदला, लेकिन IAV संक्रमण (चित्र 4D और अतिरिक्त फ़ाइल 1: S6A) पर भी mRNA (चित्र 4C) और प्रोटीन स्तर पर Mx1 को काफी कम कर दिया। तदनुसार, JAKi ने OMV प्रेरित वायरल प्रतिकृति नाकाबंदी को उलट दिया (चित्र 4E)।

चित्र 3 एमएक्स {{1}उत्प्रेरण ओएमवी टीएचपी कोशिकाओं में इन्फ्लूएंजा ए वायरस प्रतिकृति को अवरुद्ध करता है। विभेदित टीएचपी -1 कोशिकाओं में एक इन्फ्लुएंजा ए वायरस प्रतिकृति। कोशिकाओं को या तो ओएमवी/एमवी (प्रत्येक 1 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ पूर्व-उपचार किया गया था या नियंत्रण के लिए अनुपचारित छोड़ दिया गया था (-)। 20 घंटे पूर्व-उपचार के बाद, कोशिकाओं को 24 और 48 घंटों के लिए A/ WSN/33(H1N1) (MOI {{25%)। IAV प्रतिकृति को 18S पर सामान्यीकृत IAV-NP के विरुद्ध qपीसीआर द्वारा निर्धारित किया गया था। तीन से पांच स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य मान±SEM दिखाए गए हैं। बी विभेदित टीएचपी -1 कोशिकाओं को ओएमवी/एमवी (प्रत्येक 1 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ पूर्व-उपचार किया गया था या नियंत्रण के लिए अनुपचारित छोड़ दिया गया था (-)। 20 घंटे पूर्व-ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को 4 घंटे के लिए A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) से संक्रमित किया गया। निर्धारण के बाद, कोशिकाओं को -इन्फ्लूएंजा एनपी एंटीबॉडी (पीला) और डीएपीआई (नीला) से रंग दिया गया। चार जैविक स्वतंत्र प्रयोगों का एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया है। सी (बी) से एनपी पॉजिटिव (एनपी+) क्षेत्र की मात्रा का निर्धारण। बार्स चार स्वतंत्र प्रयोगों+एसईएम के औसत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। डी टीएचपी -1 कोशिकाएं एमएक्स1 (एमएक्स1ओईएक्स) और खाली वेक्टर नियंत्रण (वीसी) कोशिकाओं को अत्यधिक व्यक्त करने वाली कोशिकाएं 4 घंटे के लिए इन्फ्लूएंजा वायरस ए/डब्लूएसएन/33(एच1एन1) (एमओआई 0.1) से संक्रमित थीं। -इन्फ्लुएंजा एनपी के साथ निर्धारण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के बाद, एनपी + क्षेत्र को मात्राबद्ध किया गया था और वीसी कोशिकाओं के सापेक्ष दर्शाया गया है। बार्स चार स्वतंत्र प्रयोगों+एसईएम के माध्य मान दिखाते हैं। E Mx1oex और VC कोशिकाएं 6 घंटे के लिए A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.001) से संक्रमित थीं। वायरल प्रतिकृति को प्लाक परख द्वारा निर्धारित किया गया था और परिणाम प्रति एमएल प्लाक बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) के रूप में दर्शाए गए हैं। बार्स चार स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य मान+SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं। आँकड़े: 2-वे एनोवा (ए), 1-वे एनोवा (सी), अयुग्मित टी-टेस्ट (डी+ई); *पी<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=3–5

ओएमवी पर एंटीवायरल प्रतिक्रिया टीएलआर4-टीआरआईएफ-निर्भर है

शामिल पीआरआर की पहचान करने के लिए, वाणिज्यिक प्रतिरक्षा एगोनिस्ट को ओएमवी की नकल करने के लिए अकेले या एलपीएस के साथ संयोजन में लागू किया गया था। हालाँकि, KpOMVs (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S7) के साथ कोई प्रतिबिंबित Mx1 प्रेरण नहीं देखा गया था, जो उनके लिगैंड संरचना या PRRs के लिए स्थानिक प्रस्तुति के कारण OMVs द्वारा मैक्रोफेज के एक अंतर और लंबे समय तक सक्रियण का सुझाव देता है। टी में शामिल प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स का एनएफ-κबी- और आईआरएफ-सिग्नलिंग (छवि 5 ए) के लिए टीएचपी -1 रिपोर्टर कोशिकाओं द्वारा आगे मूल्यांकन किया गया था। केपीओएमवी उपचार पर, टीएचपी -1 कोशिकाओं ने एमएक्स1 प्रोटीन (चित्र 5बी और अतिरिक्त फ़ाइल 1: एस6बी) की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि दिखाई, जो टीआरआईएफ की कमी (टीआरआईएफ -/-) टीएचपी -1 कोशिकाओं में खो गई थी। चित्र 5बी और अतिरिक्त फ़ाइल 1: एस6बी)। आईआरएफ रिपोर्टर (छवि 5 सी) के लिए भी यही देखा गया था, जबकि एनएफ-κबी रिपोर्टर सक्रियण और सीएक्ससीएल 8 प्रेरण उत्तेजना पर टीएचपी -1 और टीआरआईएफ -/- दोनों कोशिकाओं में उच्च थे (छवि 5 डी + ई)। STAT-निर्भर IFIT1, IFI44, और Mx1 जीन अभिव्यक्ति को THP -1 रिपोर्टर कोशिकाओं (छवि 5E) में KpOMV उत्तेजना पर प्रेरित किया गया था, जबकि यह समान रूप से उत्तेजित TRIF -/- कोशिकाओं (छवि 5E) में काफी कम हो गया था। पूर्व-उत्तेजना के बाद अतिरिक्त IAV संक्रमण के परिणामस्वरूप वायरल प्रतिकृति में कमी आई, जबकि TRIF विलोपन ने IAV प्रतिकृति को बचाया (चित्र 5F)। यह जांचने के लिए कि क्या केपीओएमवी मैक्रोफेज में एक सामान्य एंटीवायरल प्रतिक्रिया उत्पन्न करता है, कोशिकाओं को वेसिकुलर स्टामाटाइटिस वायरस (वीएसवी) से संक्रमित किया गया था, जो नियंत्रण कोशिकाओं में दोहराया गया था, लेकिन केपीओएमवी पूर्व-उपचारित कोशिकाओं में अवरुद्ध हो गया था और टीआरआईएफ विलोपन द्वारा भी बचाया जा सकता था (चित्र)। 5जी). चूंकि टीएलआर4 के माध्यम से एलपीएस की पहचान एंडोसाइटोसिस और टीआरआईएफ-सक्रियण के लिए आवश्यक है, ओएमवी सतह पर एलपीएस को लिपोपेप्टाइड एंटीबायोटिक पॉलीमीक्सिन बी (पीबी) द्वारा बेअसर कर दिया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एमएक्स1 प्रेरण में 50% की कमी आई (छवि 6 ए + बी और अतिरिक्त फ़ाइल 1) : S6C), लेकिन NF-κB-निर्भर CXCL8 प्रतिलेखन (छवि 6C) में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। KpOMV+PB पूर्व-उत्तेजना पर वायरल प्रतिकृति को बेसल स्तर तक बचाया गया (चित्र 6D)। चूंकि पीबी द्वारा एलपीएस मान्यता का निषेध एमएक्स1 को पूरी तरह से अवरुद्ध करने के लिए अपर्याप्त था, एंडोटॉक्सिन-मुक्त क्लियर कोली (सीसी) से ओएमवी को अलग किया गया और पूर्व-उत्तेजना के लिए उपयोग किया गया। Cc एक परिवर्तित लिपिड A को व्यक्त करता है और एक सक्रिय TLR4/MD2 कॉम्प्लेक्स को प्रेरित नहीं कर सकता है [24]। CcOMVs ने Mx1 (चित्र 6A+B और अतिरिक्त फ़ाइल 1: S6C) को प्रेरित नहीं किया और मैक्रोफेज में IAV प्रतिकृति को कम नहीं किया (चित्र 6D)। यह सर्वविदित है कि विभेदक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं के अलगाव के परिणामस्वरूप पुटिकाओं के साथ-साथ दूषित पदार्थों (जैसे प्रोटीन या जीवाणु कोशिका उपांग) का सह-अलगाव होता है। MISEV2018 दिशानिर्देशों [25] के अनुसार, प्रमुख प्रयोगों को अल्ट्राफिल्ट्रेशन (यूएफ) और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) के संयोजन के माध्यम से पृथक ओएमवी के साथ दोहराया गया था। यूएफ-एसईसी शुद्ध केपीओएमवी के साथ टीएचपी -1 रिपोर्टर कोशिकाओं के उत्तेजना के परिणामस्वरूप एमएक्स1 (अतिरिक्त फ़ाइल 1: छवि एस8ए) और आईआरएफ रिपोर्टर (छवि एस8बी) शामिल हो गए, जबकि यह टीआरआईएफ -/- मैक्रोफेज में खो गया था। अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S8A+B)। IAV प्रतिकृति को KpOMV पूर्व-उपचारित कोशिकाओं में अवरुद्ध कर दिया गया था और TRIF हटाए जाने पर बचाया गया था (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S8C)। NF-κB रिपोर्टर गतिविधि कोशिकाओं की TRIF स्थिति की परवाह किए बिना KpOMVs द्वारा प्रेरित की गई थी (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S8D)।

चित्र 4 जेएके-सिग्नलिंग का निषेध मैक्रोफेज में इन्फ्लूएंजा ए वायरस प्रतिकृति को बचाता है। एक ओएमवी मैक्रोफेज में टीआरआईएफ-आईआरएफ-सिग्नलिंग को सक्रिय करता है, जो बदले में आईएफएन-अभिव्यक्ति और बाद में आईएफएनएआर-सिग्नलिंग के साथ रिलीज को प्रेरित करता है। IFNAR JAK/STAT के माध्यम से संकेत देता है और ISG की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, जिनमें से एक Mx1 है। इससे IAV प्रतिकृति अवरुद्ध हो जाती है। B-E THP-1 कोशिकाओं को 2{{22) के लिए OMVs (1 µg/mL; Kp/Sal) जोड़ने से पहले 10 µM JAK अवरोधक (JAKi) के साथ 1 घंटे के लिए प्री-इन्क्यूबेट किया गया था। }} एच। बी-सी सीएक्ससीएल8 (बी) और एमएक्स1 (सी) अभिव्यक्ति क्यूपीसीआर द्वारा निर्धारित की गई थी और परिणाम आरपीएस18 के लिए सामान्यीकृत हैं और अनुपचारित नियंत्रण के सापेक्ष दर्शाए गए हैं। बार्स तीन से चार स्वतंत्र प्रयोगों+एसईएम का माध्य मान दिखाते हैं। डी+ई ओएमवी पूर्व-उपचारित कोशिकाएं अतिरिक्त रूप से आईएवी (एमओआई 0.001) से संक्रमित थीं। डी वेस्टर्न ब्लॉट संक्रमण (पीआई) के 0-3 घंटे बाद एमएक्स1 प्रोटीन अभिव्यक्ति दिखाता है। ई वायरल प्रतिकृति संक्रमण के 24 घंटे बाद प्लाक परख द्वारा निर्धारित की गई थी। बार्स चार स्वतंत्र प्रयोगों+एसईएम के माध्य मान दिखाते हैं। आँकड़े: 1-वे एनोवा (बी+सी+ई); *पी<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; *compared to DMSO control, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=4

चित्र 5 ओएमवी टीआरआईएफ के माध्यम से मैक्रोफेज में एंटीवायरल सिग्नलिंग प्रेरित करते हैं। एक टीएचपी -1 दोहरी रिपोर्टर कोशिकाएं एनएफ-κबी मार्ग के सक्रियण के बाद स्रावित भ्रूण क्षारीय फॉस्फेट (एसईएपी) की अभिव्यक्ति और आईआरएफ मार्ग के सक्रियण पर लूसिया ल्यूसिफेरेज की अभिव्यक्ति और स्राव को प्रेरित करती हैं। इसके अतिरिक्त, TRIF (ग्रे बार) को विभेदित किया गया और बाद में -/- कोशिकाओं से उत्तेजित किया गया, जिसमें एडॉप्टर अणु TRIF का एक स्थिर नॉकआउट होता है। (बीएफ) टीएचपी -1 रिपोर्टर कोशिकाएं (= दोहरी; काली पट्टियाँ) और टीआरआईएफ -/- कोशिकाएं केपीओएमवी (1 μg/mL) 2 0 घंटे के लिए या नियंत्रण के लिए अनुपचारित छोड़ दी जाती हैं। संकेतित समय के बाद, सतह पर तैरनेवाला, आरएनए और/या प्रोटीन एकत्र किए गए। एमएक्स1 प्रोटीन अभिव्यक्ति की बी प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा छवि। सी+डी लूसिया रिपोर्टर गतिविधि (सी) और एसईएपी रिपोर्टर गतिविधि (डी) सेल कल्चर सतह पर तैरनेवाला में निर्धारित की गई थी। दोनों पत्रकारों की गतिविधि निर्धारित करने के लिए एक ही सतह पर तैरनेवाला का उपयोग किया गया था। ई STAT- और NF-κB-निर्भर लक्ष्य जीन (ऊपर से नीचे तक: IFIT1, IFI44, Mx1, CXCL8) के लिए सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति qपीसीआर द्वारा निर्धारित की गई थी और परिणाम RPS18 के लिए सामान्यीकृत किए गए हैं और अस्थिर दोहरे नियंत्रण के सापेक्ष दर्शाए गए हैं। तह परिवर्तन लॉग2 रूपांतरित थे। कोशिकाओं को अतिरिक्त रूप से 24 घंटे (एफ) के लिए ए/डब्लूएसएन/33(एच1एन1) (एमओआई {{25%).1) या 12 घंटे (जी) के लिए वीएसवी (एमओआई 0.1) से संक्रमित किया गया था। वायरल प्रतिकृति का निर्धारण प्लाक परख द्वारा किया गया था। बार्स चार (सी-एफ) से एफवी (जी) स्वतंत्र प्रयोगों+एसईएम का औसत मान दिखाते हैं। आँकड़े: 2-वे एनोवा (सी-जी); *पी<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; * compared to unstimulated Dual control, # as depicted in the graph; ns=not signifcant; n=4–5

चित्र 6 एलपीएस अवरोध के बाद ओएमवी-प्रेरित एमएक्स1 अभिव्यक्ति खो जाती है। टीएचपी -1 कोशिकाओं को ओएमवी (1 µg/mL; Kp या क्लियर कोली (Cc)) के साथ अकेले या 20 µg/mL पॉलीमीक्सिन बी (पीबी) के साथ संयोजन में या अनुपचारित छोड़ दिए जाने पर 2 0 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। नियंत्रण के लिए. एक Mx1 प्रोटीन अभिव्यक्ति वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा निर्धारित की गई थी। तीन जैविक रूप से स्वतंत्र प्रयोगों का एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया है। एमएक्स1 बी और सीएक्ससीएल8 सी अभिव्यक्ति क्यूपीसीआर द्वारा निर्धारित की गई थी। बार्स चार स्वतंत्र प्रयोगों+एसईएम के माध्य मान दिखाते हैं। डी टीएचपी -1 कोशिकाओं को 20 घंटे के लिए ओएमवी (1 माइक्रोग्राम/एमएल; केपी या सीसी) के साथ अकेले या 20 माइक्रोग्राम/एमएल पीबी के संयोजन में इनक्यूबेट किया गया था या नियंत्रण के लिए अनुपचारित छोड़ दिया गया था और फिर अतिरिक्त रूप से ए/डब्लूएसएन/33 से संक्रमित किया गया था। (एच1एन1) (एमओआई 0.001)। संक्रमण के 24 घंटे बाद प्लाक परख द्वारा वायरस प्रतिकृति का निर्धारण किया गया। बार्स चार स्वतंत्र प्रयोगों+एसईएम के माध्य मान दिखाते हैं। आँकड़े: 1-वे एनोवा बी-डी; *पी<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; *compared to control, #compared to KpOMV; ns=not significant; n=3–4

ओएमवी का आईएवी प्रतिकृति-अवरोधक प्रभाव एईसी में स्थानांतरित किया जा सकता है

चूँकि मैक्रोफेज फेफड़े में IAV प्रतिकृति के लिए मुख्य कोशिका प्रकार नहीं हैं और IFN I के रूप में पैरासरीन भी कार्य करता है, AECs में IAV प्रतिकृति प्रभाव की स्थानांतरणीयता का परीक्षण किया गया था, क्योंकि ये कोशिकाएँ, मैक्रोफेज के विपरीत, OMV/MV पर सीधे प्रतिक्रिया नहीं करती हैं ( अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S9)। KpOMV-उपचारित मैक्रोफेज से सुपरनैटेंट (SN) ने LpOMV-SN (चित्र 7A) के विपरीत, A549 कोशिकाओं में Mx1 को प्रेरित किया, जबकि CXCL8 को दोनों के बाद प्रेरित किया गया (चित्र 7B)। KpOMVSN ने वायरल प्रतिकृति को कम कर दिया (चित्र 7C), जो मैक्रोफेज प्रयोगों और Mx1 प्रेरण के पैटर्न के अनुरूप था। JAK/STAT-सिग्नलिंग पर देखे गए IAV सीमित प्रभाव की निर्भरता की पुष्टि करने के लिए, KpOMV-SN को JAKi के साथ जोड़ा गया, KpOMV-SN-उपचार पर Mx1 प्रेरण को अवरुद्ध किया गया (चित्र 7A) और IAV प्रतिकृति को बहाल किया गया (चित्र 7C)। फेफड़ों में प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं के जटिल विनियमन की नकल करने के लिए, मानव परिशुद्धता-कट फेफड़े के स्लाइस (पीसीएलएस) के पूर्व विवो आईएवी संक्रमण की स्थापना की गई थी। एलपी/केपीओएमवी पीसीएलएस (चित्र 8ए) के लिए साइटोटॉक्सिक नहीं थे और ओएमवी पूर्व-उत्तेजना और आईएवी संक्रमण के संयोजन के परिणामस्वरूप एमएक्स1 इंडक्शन (चित्र 8बी) और सीएक्ससीएल10 रिलीज (चित्र 8सी) हुआ। KpOMVs ने, लेकिन LpOMVs ने नहीं, PCLS में IAV प्रतिकृति को काफी कम कर दिया (चित्र 8D)। यूवी निष्क्रिय आईएवी (चित्र 8ए-सी) के संक्रमण से देखे गए प्रभावों को समाप्त कर दिया गया। हमारे निष्कर्ष फेफड़ों की सूजन के एक मॉडल की ओर ले जाते हैं, जिसमें एएम आईएफएन I को शामिल करके ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया से ओएमवी पर प्रतिक्रिया करते हैं, एएम में ऑटोक्राइन तरीके से एंटीवायरल प्रतिक्रियाएं प्रेरित करते हैं और एईसी में इन विट्रो और पूर्व विवो पीसीएलएस मॉडल में पैराक्राइन तरीके से एंटीवायरल प्रतिक्रियाएं प्रेरित करते हैं। (चित्र 8ई)।

चित्र 7 इन्फ्लुएंजा ओएमवी का एक वायरस प्रतिकृति-अवरोधक प्रभाव एईसी में स्थानांतरित किया जा सकता है। टीएचपी-1 कोशिकाओं को 20 घंटे के लिए एलपीओएमवी या केपीओएमवी के साथ ऊष्मायन किया गया या नियंत्रण के लिए अनुपचारित छोड़ दिया गया। सतह पर तैरनेवाला (एसएन) को बाँझ फ़िल्टर किया गया था और अकेले 2 0 घंटे के लिए या 10 µM JAKi के साथ संयोजन में A549 कोशिकाओं के पूर्व-उत्तेजना के लिए उपयोग किया गया था। A+B Mx1 (A) और CXCL8 B अभिव्यक्ति संक्रमण के समय बिंदु (0 h pi) पर qपीसीआर द्वारा निर्धारित की गई थी। बार्स चार स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य मान + अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं के लिए सामान्यीकृत SEM दिखाते हैं। C पूर्व-उपचारित A549 कोशिकाएं अतिरिक्त रूप से 24 घंटे के लिए इन्फ्लूएंजा वायरस A/हैम्बर्ग/5/2009(H1N1pdm) (MOI 0.01) से संक्रमित थीं। वायरल प्रतिकृति का निर्धारण प्लाक परख द्वारा किया गया था। बार्स चार स्वतंत्र प्रयोगों+SEM के माध्य मान हैं। आँकड़े: 1-वे एनोवा; **पी<0.01, ****p<0.0001; * compared to control-SN; # compared to KpOMV-SN; n=4

बहस

हमने पाया कि विभिन्न बैक्टीरिया के पुटिकाएं मैक्रोफेज में विभेदक सिग्नलिंग उत्पन्न करती हैं जो बाद के संक्रमण में आईएवी प्रतिकृति को सीमित करने में सक्षम है। साहित्य के अनुरूप, एलपी, केपी, ईसी और साल से पृथक ओएमवी और एसपी से एमवी आकार में तुलनीय थे [26-28]। बैक्टीरिया पुटिकाओं के साथ ऊष्मायन किए गए मैक्रोफेज ने साइटोटॉक्सिसिटी नहीं दिखाई [29, 30], लेकिन एक प्रो-इंफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया प्रेरित की। सभी पुटिकाओं ने प्राथमिक मानव मैक्रोफेज से p38 फॉस्फोराइलेशन और CXCL8 और IL -1 की रिहाई को ट्रिगर किया, जबकि IFN I और उनके डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग के प्रेरण में अंतर थे। हमने और अन्य लोगों ने पहले ही दिखाया है कि एलपीओएमवी टीएलआर2 [12, 22] के माध्यम से संकेत देते हैं और एसपीएमवी ने मैक्रोफेज [31] में एक अलग सक्रियण पैटर्न को प्रेरित किया है। LpOMVs/SpMVs ने प्रो-इंफ्लेमेटरी NF-κB लक्ष्य जीन को सक्रिय किया, जैसा कि मूल बैक्टीरिया के लिए वर्णित है [12, 22, 31]। फिर भी, Kp/Ec/SalOMVs की पहचान ने, NF-κB लक्ष्य जीन के अलावा, डाउनस्ट्रीम IFNB अभिव्यक्ति के साथ IRF -3 फॉस्फोराइलेशन और STAT1 के लंबे समय तक चलने वाले फॉस्फोराइलेशन को ISG के प्रेरण के साथ सक्रिय करने के लिए प्रेरित किया। IFNAR-JAK/STAT सिग्नलिंग। ओएमवी अपनी सतह पर एलपीएस रखते हैं, लेकिन ओएमवी की सूजनरोधी क्षमता की नकल शुद्ध एलपीएस से नहीं की जा सकती। हमने और अन्य लोगों ने देखा कि शुद्ध एलपीएस की समान मात्रा की तुलना में मैक्रोफेज ओएमवी के प्रति अधिक संवेदनशील हैं [32, 33]। ओएमवी में प्रतिरक्षा एगोनिस्ट की एक मात्रा होती है जो एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए आवश्यक होती है [32]। वाणिज्यिक टीएलआर और आरआईजी-आई एगोनिस्ट अकेले या एलपीएस के साथ संयोजन में प्रभाव की नकल नहीं कर सकते। यह पहले प्रदर्शित किया गया था कि एलपीएस-लोडेड लिपोसोम्स ने मुक्त एलपीएस [34] की तुलना में मैक्रोफेज में टीआरआईएफ-आईआरएफ -3 की अधिक लंबी सक्रियता को प्रेरित किया। TRIF−/− मैक्रोफेज का उपयोग करके, हमने इस एडॉप्टर अणु पर ISG इंडक्शन की निर्भरता दिखाई। इसके अलावा, एलपीएसमास्किंग पीबी के साथ संयुक्त एंडोटॉक्सिन मुक्त सीसीओएमवी या ओएमवी मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया को निरस्त करने के लिए पर्याप्त थे। यह बाद में एंडोसाइटोसिस और टीआरआईएफ-सिग्नलिंग के साथ टीएलआर4 के माध्यम से ओएमवी की पहचान को इंगित करता है। तदनुसार, Kp/Ec/SalOMVs TLR4 के माध्यम से मैक्रोफेज के प्रो-इंफ्लेमेटरी सक्रियण को प्रेरित करने में सक्षम थे, जिससे MyD88 सिग्नलिंग और NF-κB निर्भर जीन अभिव्यक्ति के साथ-साथ IFN I प्रतिक्रिया के साथ TRIF सिग्नलिंग हुई। यह उस साहित्य के अनुरूप है जो दर्शाता है कि चूहों में निसेरिया मेनिंगिटिडिस ओएमवी की प्रतिरक्षात्मकता के लिए टीएलआर4 और टीआरआईएफ एक साथ आवश्यक हैं [35]। चूँकि टाइप I IFNs एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं के मास्टर नियामक हैं, इसलिए हमने अनुमान लगाया कि Kp/Ec/SalOMVs की पहचान IAV प्रतिकृति को प्रभावित करती है। हमने दिखाया कि मैक्रोफेज ने टीआरआईएफ-सक्रिय ओएमवी पूर्व-उपचार के बाद आईएवी और वीएसवी प्रतिकृति को कुशलतापूर्वक अवरुद्ध कर दिया, जबकि टीआरआईएफ -/- ने वायरल प्रतिकृति को बचाया। IFNAR सिग्नलिंग पर प्रभाव को इंगित करने के लिए, JAK1/2 निषेध को OMVs के साथ जोड़ा गया, STAT 1-निर्भर Mx1 प्रेरण को सफलतापूर्वक अवरुद्ध किया गया और मैक्रोफेज में वायरल प्रतिकृति को बचाया गया। पीबी के साथ केपीओएमवी के संयोजन या एंडोटॉक्सिन मुक्त सीसीओएमवी के अनुप्रयोग ने मैक्रोफेज में आईएवी प्रतिकृति को कम नहीं किया क्योंकि वे एंटीवायरल जीन को प्रेरित करने में असमर्थ थे। चूंकि अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्राप्त बाह्यकोशिकीय पुटिका तैयारियों में पुटिकाओं के साथ-साथ मुक्त प्रोटीन और जीवाणु कोशिका संलग्नक होते हैं, ओएमवी तैयारी अतिरिक्त रूप से अल्ट्राफिल्ट्रेशन और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी [25] के संयोजन के माध्यम से उत्पन्न की गई थी।

चीनी जड़ी बूटी सिस्टैंच पौधा-एंटीट्यूमर

प्राप्त शुद्ध वेसिकल तैयारियां डाउनस्ट्रीम एमएक्स1 इंडक्शन के साथ टीआरआईएफ-आईआरएफ सिग्नलिंग को प्रेरित करने में समान रूप से सक्षम थीं और प्रत्यक्ष वेसिकल प्रभाव के लिए तर्क देते हुए वायरल प्रतिकृति को अवरुद्ध कर दिया। यद्यपि एटीएम फेफड़ों में रक्षा की पहली पंक्ति हैं, मानव फेफड़ों में अधिकांश आईएवी संक्रमण और प्रतिकृति एईसी में होती है [36]। इसलिए, एईसी को ओएमवी से उत्तेजित किया गया था, लेकिन उन्होंने मैक्रोफेज की तरह उत्तेजना पर प्रतिक्रिया नहीं दी। केवल ब्रोन्कियल एपिथेलियल सेल लाइन BEAS2B ने CXCL8 अभिव्यक्ति के साथ प्रतिक्रिया की, लेकिन Mx1 प्रेरण का अभाव था। चूंकि हम मैक्रोफेज में टीएलआर4 और टीआरआईएफ के आधार पर एक एंटीवायरल जीन अभिव्यक्ति दिखा सकते हैं, हम परिकल्पना करते हैं कि चार परीक्षण किए गए उपकला कोशिका लाइनें मैक्रोफेज के समान टीएलआर4 को व्यक्त नहीं करती हैं और वे टीएलआर4 सक्रियण पर ओएमवी को एंडोसाइटोज करने में विफल रहीं। यह उस साहित्य के अनुरूप है जो दर्शाता है कि पृथक मानव एईसी एलपीएस पर प्रतिक्रिया नहीं करते हैं जैसा कि युग्मित एएम ने किया था [37]। जैसे ही हमने ओएमवी प्री-इनक्यूबेशन पर एंटीवायरल स्थिति को आईएफएन I से जोड़ा, हमने एईसी को पूर्व-उत्तेजित करने के लिए ओएमवी-उत्तेजित मैक्रोफेज के एक सतह पर तैरनेवाला का उपयोग किया। प्रत्यक्ष पुटिका उत्तेजना के विपरीत, KpOMV-उत्तेजित मैक्रोफेज का वातानुकूलित माध्यम, इन कोशिकाओं में Mx1 अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है और बाद के संक्रमण प्रयोगों में IAV प्रतिकृति को कम करता है। एलपीओएमवी-उपचारित मैक्रोफेज से सतह पर तैरनेवाला ने उपकला कोशिकाओं में सीएक्ससीएल8 को प्रेरित किया लेकिन कोई एमएक्स1 प्रेरण नहीं हुआ और वायरल प्रतिकृति में परिवर्तन हुआ। वातानुकूलित मीडिया के साथ देखे गए प्रभाव का श्रेय IFN I को देने के लिए, सतह पर तैरनेवाला को JAK1/2 अवरोधक के साथ जोड़ा गया, जिससे Mx1 प्रेरण अवरुद्ध हो गया, और वायरल प्रतिकृति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। चूँकि मानव फेफड़े में विभिन्न कोशिका प्रकारों की परस्पर क्रिया अधिक जटिल होती है और वातानुकूलित मीडिया द्वारा पूरी तरह से नकल नहीं की जा सकती है, इसलिए हमने मानव डिस्टल फेफड़े के ऊतकों के व्यवहार्य वर्गों तक अपना दृष्टिकोण बढ़ाया है, जिसका व्यापक रूप से मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन पर अध्ययन के लिए उपयोग किया गया है। इन्फ्लूएंजा वायरस और जीवाणु संक्रमण [38-41]। उपयोग किए गए इन विट्रो मॉडल के विपरीत, पूर्व विवो मानव फेफड़े के ऊतक फेफड़े की त्रि-आयामी वास्तुकला को बनाए रखते हैं और फेफड़े में निवासी कोशिका प्रकारों के बीच एक शारीरिक परस्पर क्रिया की अनुमति देते हैं, फिर भी इसमें आगे भर्ती प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह की संभावना का अभाव होता है। IAV के साथ KpOMV-उत्तेजित PCLS के लगातार संक्रमण से पूर्व-उपचारित नियंत्रणों की तुलना में वायरल लोड कम हो गया। चूंकि इन विट्रो में परीक्षण किए गए सभी एईसी ने प्रत्यक्ष जीवाणु पुटिका उत्तेजना पर प्रतिक्रिया नहीं दी, हम अनुमान लगाते हैं कि इस पूर्व विवो मॉडल में, एएम प्रमुख प्रतिक्रियाशील कोशिका प्रकार हैं। चूंकि बाद के संक्रमण के लिए एक इन्फ्लूएंजा आइसोलेट को चुना गया था जो विशेष रूप से एईसी में संक्रमित और प्रतिकृति बनाता है, इसलिए यह माना जा सकता है कि यह एक पैराक्राइन एंटीवायरल प्रभाव है जो एएम से उत्पन्न होता है और एईसी में फैलता है। यहां प्राप्त आंकड़ों के आधार पर, हम निम्नलिखित मॉडल (चित्र 8ई) का प्रस्ताव करते हैं: ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया से ओएमवी मानव मैक्रोफेज को शास्त्रीय प्रो-इंफ्लेमेटरी तरीके से सक्रिय कर सकते हैं और सफल एंडोसाइटोसिस के बाद टीएलआर4 और टीआरआईएफ के माध्यम से उन्हें एंटी-वायरल प्राइम कर सकते हैं। पुटिका. IFN I रिलीज़ बदले में IFNAR और JAK/STAT सिग्नलिंग के माध्यम से मैक्रोफेज और/या AECs को एंटीवायरल प्रदान कर सकता है। इन कोशिकाओं के बाद के संक्रमण से वायरल लोड में Mx1-मध्यस्थ कमी आती है। चूंकि हमारे पास प्राथमिक मानव एएम तक पहुंच नहीं थी, इसलिए मानव बीडीएम को एक मॉडल के रूप में उपयोग करके प्रयोग किए गए। इन मैक्रोफेज की विभिन्न विकासात्मक उत्पत्ति और प्राइमिंग को ध्यान में रखते हुए, यह अनुमान लगाया जा सकता है कि एएम ने बीडीएम के विपरीत कमजोर सूजन-रोधी प्रतिक्रिया दिखाई होगी। विभिन्न निमोनिया-उत्प्रेरण रोगजनकों के खिलाफ टीकाकरण रणनीतियों में जीवाणु पुटिकाओं का पहले से ही उपयोग किया जाता है ([42] में समीक्षा की गई है)। इसलिए, ओएमवी न केवल अपने मेजबान बैक्टीरिया के खिलाफ संभावित प्रणालीगत टीकाकरण रणनीतियों के लिए एक उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं, बल्कि निवासी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय करके वायरल संक्रमण से निपटने के लिए स्थानीय रूप से भी इस्तेमाल किया जा सकता है। भविष्य में इन विवो अध्ययनों की आवश्यकता यह जांचने के लिए है कि क्या ये इन विट्रो निष्कर्ष अन्य वायरल रोगजनकों पर लागू होते हैं। इसके अलावा, यह ध्यान देने की आवश्यकता है कि विवो में अतिरंजित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए संभावित रूप से होने वाली एंडोटॉक्सिक प्रतिक्रिया की गंभीर रूप से निगरानी की जानी चाहिए। प्रकार I IFN के प्रेरण को सख्ती से नियंत्रित करने की आवश्यकता है, क्योंकि यह स्वस्थ व्यक्तियों में दिखाया गया था कि TLR7 एगोनिस्ट की साँस लेना पहली खुराक के बाद शुरू में अच्छी तरह से सहन किया गया था, लेकिन इससे TNF- और IFN I प्रतिक्रिया में वृद्धि हुई और इन्फ्लूएंजा जैसे लक्षण दिखाई दिए। , दूसरी खुराक के बाद [43]। प्रतिकूल प्रभावों से निपटने के लिए, ओएमवी के आनुवंशिक रूप से संशोधित संस्करणों की आवश्यकता हो सकती है, जो संतुलित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करते हैं और अच्छी प्रयोज्यता प्राप्त करते हैं। कुल मिलाकर, हम यहां एक मॉडल प्रस्तुत करते हैं कि कैसे ओएमवी मानव मैक्रोफेज में एंटीवायरल सिग्नलिंग को प्रेरित कर सकते हैं और इसका उपयोग आईएवी प्रतिकृति को रोकने के लिए कैसे किया जा सकता है।

चित्र 8 केपीओएमवी मानव परिशुद्धता से काटे गए फेफड़ों के स्लाइस में इन्फ्लूएंजा ए वायरस की प्रतिकृति को कम करता है। मानव पीसीएलएस को 20 घंटे के लिए 1 माइक्रोग्राम/एमएल ओएमवी (एलपी/केपी) के साथ इनक्यूबेट किया गया और फिर 48 घंटे के लिए इन्फ्लूएंजा ए/कैलिफ़ोर्निया/04/2009(एच1एन1पीडीएम) से संक्रमित किया गया। वायरस की यूवी निष्क्रियता ने नियंत्रण के रूप में कार्य किया। साइटोटोक्सिसिटी पीसीएलएस से जारी एलडीएच की मात्रा का निर्धारण करके निर्धारित की गई थी और कुल लसीका की तुलना में % में दर्शाया गया है। बी एमएक्स1 अभिव्यक्ति को क्यूपीसीआर द्वारा निर्धारित किया गया था और इसे आरपीएस18 और अनुपचारित नियंत्रण पीसीएलएस के सापेक्ष प्रस्तुत किया गया है। सी सीएक्ससीएल10 रिलीज़ एलिसा द्वारा निर्धारित की गई थी और इसे एनजी/एमएल में दर्शाया गया है। डी वायरल प्रतिकृति प्लाक परख द्वारा निर्धारित की गई थी और इसे पीएफयू/एमएल में दर्शाया गया है। बार्स तीन से पांच जैविक प्रतिकृतियों+एसईएम का माध्य मान दिखाते हैं। फेफड़ों में ओएमवी की एंटीवायरल प्रतिरक्षा को शामिल करने के लिए ई प्रस्तावित मॉडल। आँकड़े: 1-वे एनोवा (एसी), फ्रीडमैन-टेस्ट (डी); *पी<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; * compared to IAV infected, but not pre-treated PCLS, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=5

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