जन्मजात हृदय रोग में न्यूरोप्रोटेक्शन की वर्तमान स्थिति भाग 2

इसके बाद सूक्ष्म छवियों को इमेजजे सॉफ्टवेयर (नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ, बेथेस्डा, एमडी, यूएसए) का उपयोग करके इमेज कैलकुलेशन के अधीन किया गया। Hsp60 के सिग्नल को "x" से गुणा किया गया।

Hsp60 एक महत्वपूर्ण प्रोटीन अणु है जो मानव शरीर में एक महत्वपूर्ण जैविक भूमिका निभाता है। हाल के वर्षों में हुए शोध से पता चला है कि Hsp60 की उपस्थिति मानव स्मृति से निकटता से संबंधित है।

Hsp60 एक आणविक चैपरोन प्रोटीन है जो मुख्य रूप से प्रोटीन फोल्डिंग, अनफोल्डिंग, स्थिरीकरण और गिरावट में शामिल है। ये प्रक्रियाएँ मानव शरीर के सामान्य चयापचय और सेलुलर फ़ंक्शन के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। साथ ही, Hsp60 में एंटीऑक्सिडेंट, एंटी-इंफ्लेमेटरी और इम्यूनोमॉडुलेटरी प्रभाव भी होते हैं, और यह मानव स्वास्थ्य और प्रतिरक्षा प्रणाली के संतुलन को बनाए रखने में एक बड़ी भूमिका निभाता है।

शोध में पाया गया है कि Hsp60 स्मृति निर्माण और रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सीखने और स्मृति की प्रक्रिया के दौरान, मस्तिष्क की कोशिकाएँ बड़ी संख्या में Hsp60 अणु बनाती हैं। ये अणु कोशिकाओं को बाहरी वातावरण से हस्तक्षेप और क्षति से बचा सकते हैं ताकि सीखने और स्मृति की सुचारू प्रगति सुनिश्चित हो सके। इसके अलावा, Hsp60 मस्तिष्क कोशिकाओं के सिग्नल ट्रांसडक्शन और न्यूरॉन्स के विकास को बदलकर मानव सोच और व्यवहार को भी प्रभावित कर सकता है और अनुभूति और तनाव प्रतिरोध पर सकारात्मक प्रभाव डालता है।

हालाँकि Hsp60 की भूमिका ने मानव शरीर पर सकारात्मक प्रभाव दिखाया है, लेकिन लोगों को यह भी महसूस करने की आवश्यकता है कि Hsp60 की अधिकता और कमी दोनों ही मानव स्वास्थ्य पर नकारात्मक प्रभाव डाल सकती है। इसलिए, हमें मानव स्वास्थ्य में Hsp60 की स्थिति और भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए मानव शरीर की विभिन्न शारीरिक और रोग स्थितियों में Hsp60 के तंत्र का सक्रिय रूप से पता लगाना और अध्ययन करना चाहिए। यह देखा जा सकता है कि हमें याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टेन्चे डेज़र्टिकोला याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है, क्योंकि सिस्टेन्चे डेज़र्टिकोला में एंटीऑक्सीडेंट, एंटी-इंफ्लेमेटरी और एंटी-एजिंग प्रभाव होते हैं, जो मस्तिष्क में ऑक्सीकरण और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को कम करने में मदद कर सकते हैं, जिससे तंत्रिका तंत्र के स्वास्थ्य की रक्षा होती है। इसके अलावा, सिस्टेन्चे डेज़र्टिकोला तंत्रिका कोशिकाओं की वृद्धि और मरम्मत को भी बढ़ावा दे सकता है, जिससे तंत्रिका नेटवर्क की कनेक्टिविटी और कार्य में वृद्धि होती है। ये प्रभाव याददाश्त, सीखने की क्षमता और सोचने की गति को बेहतर बनाने में मदद कर सकते हैं, और संज्ञानात्मक शिथिलता और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के विकास को भी रोक सकते हैं।

अल्पकालिक स्मृति सुधारने के लिए जानें पर क्लिक करें

"x" मान इस प्रकार निर्धारित किया गया: नियंत्रण समूह में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए सिग्नल से "x"-फोल्डेड Hsp60 सिग्नल को घटाने पर माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए मान शून्य से कम या उसके बराबर हो गया। हिस्टोन H2B के सिग्नल को "y" से गुणा किया गया।

"y" मान इस प्रकार निर्धारित किया गया: नियंत्रण समूह में परमाणु-डीएनए सिग्नल से "y"-फोल्डेड हिस्टोन-H2B सिग्नल को घटाने से परमाणु-डीएनए मान शून्य से कम या बराबर हो गया। यदि बैकग्राउंड सिग्नल गुणन से उच्च हो जाता है, तो गुणित छवि के कंट्रास्ट को सभी नमूनों में समान स्थितियों के लिए समायोजित किया जा सकता है।

डीएसडीएनए धुंधलापन की छवि, गुणा किए गए Hsp60 और हिस्टोन H2B की समायोजित छवि को घटाकर, बाद के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। "एडजस्ट-थ्रेशोल्ड" फ़ंक्शन का उपयोग करके, इन छवियों को बाइनरीकृत किया गया। हमने 2 से 20 µm2 (वृत्ताकारता 0.1–1.0) के आकार वाले डीएसडीएनए पंक्टा का चयन किया, और उन्हें "विश्लेषण-विश्लेषण कण" फ़ंक्शन का उपयोग करके गिना गया।

2.3. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

अभिकर्मक से एक दिन पहले, हेला कोशिकाओं को 600 कोशिकाओं/µL के घनत्व पर प्लेट किया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार (10 nM की अंतिम RNA सांद्रता के साथ) लिपोफ़ेक्टामाइन RNAiMAX अभिकर्मक (थर्मोफ़िशर साइंटिफिक) में स्टील्थ RNAi siRNA (थर्मो फ़िशर साइंटिफ़िक) का उपयोग करके हेला कोशिकाओं में रुचि के जीन की अभिव्यक्ति को शांत किया गया था।

siRNA नॉकडाउन के चार दिन बाद, कोशिकाओं को स्थिरीकरण के अधीन किया गया। सेल-कल्चर नमूनों को 2% PFA और 2% ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ 0.1 M फॉस्फेट बफर, pH 7.4, में 37 ◦C पर स्थिर किया गया, फिर 30 मिनट के लिए 4 ◦C रेफ्रिजरेटर में रखा गया। नमूनों को 2% ग्लूटाराल्डिहाइड में 0.1 M फॉस्फेट बफर में रात भर 4 ◦C पर स्थिर किया गया। नमूनों को 30 मिनट के लिए 0.1 M फॉस्फेट बफर से तीन बार धोया गया और 0.1 M फॉस्फेट बफर में 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड के साथ 4 ◦C पर 1 घंटे के लिए पोस्ट-फिक्स किया गया।

नमूनों को निर्जलित इनग्रेडेड इथेनॉल घोल में डाला गया, रेजिन (क्वेटोल, निशिन ईएम कंपनी, टोक्यो, जापान) में स्थानांतरित किया गया और 48 घंटे के लिए 60 ◦C पर पॉलीमराइज़ किया गया। पॉलीमराइज़्ड रेजिन को अल्ट्रामाइक्रोटोम (अल्ट्राकट यूसीटी, लीका माइक्रोसिस्टम्स, वेट्ज़लर, जर्मनी) का उपयोग करके हीरे के चाकू से अल्ट्राथिन 70- एनएम सेक्शन में काटा गया और फिर तांबे के ग्रिड पर लगाया गया।

खंडों को 15 मिनट के लिए आर.टी. पर 2% यूरेनिल एसीटेट के साथ अभिरंजित किया गया और आसुत जल से धोया गया, इसके बाद आर.टी. पर 3 मिनट के लिए सीसा अभिरंजक विलयन (सिग्मा-एल्ड्रिच, टोक्यो, जापान) के साथ द्वितीयक अभिरंजन किया गया।

ग्रिड को ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (जेईएम-1400प्लस, जेईओएल लिमिटेड) के तहत देखा गया था., टोक्यो, जापान) को 80 kV (ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क) या 100 kV (कोशिका) के त्वरण वोल्टेज पर, और छवियों को एक चार्ज-युग्मित-डिवाइस (CCD) कैमरा (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया।

2.4. इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

सोने की डिस्क पर रखे नमूनों को तरल प्रोपेन में -175 डिग्री सेल्सियस पर जमाया गया। नमूनों के जमने के बाद, उन्हें 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इथेनॉल में 1% टैनिक एसिड और 2% आसुत जल के साथ फ्रीज-प्रतिस्थापित किया गया।

फिर नमूनों को 4 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया, उसके बाद 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन किया गया। इसके बाद, नमूनों को 30 मिनट के लिए 3 बार निर्जल इथेनॉल में निर्जलित किया गया, उसके बाद 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इथेनॉल और राल (एलआर व्हाइट: लंदन रेजिन कंपनी लिमिटेड, बर्कशायर, यूके) के 50:50 मिश्रण के साथ घुसपैठ की गई। नमूनों को ताजा 100% राल में स्थानांतरित किया गया और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया, और इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराया गया।

नमूनों को ताजा 100% रेजिन में स्थानांतरित किया गया और 50 ◦CO/N पर पॉलीमराइज़ किया गया। पॉलीमराइज़्ड रेजिन को अल्ट्रामाइक्रोटोम (अल्ट्राकट यूसीटी; लीका) का उपयोग करके हीरे के चाकू से 90 एनएम पर अल्ट्रा-पतले सेक्शन में काटा गया और सेक्शन को निकल ग्रिड पर रखा गया। ग्रिड को 4 ◦CO/N पर 1% BSA/PBS में एंटी-डीएसडीएनए एंटीबॉडी (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) के साथ इनक्यूबेट किया गया, उसके बाद 1% BSA/PBS के साथ 1 मिनट के लिए तीन बार धोया गया।

इसके बाद उन्हें {{0}}nm सोने के कणों (बकरी एंटी-माउस IgG पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी) से संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ 2 घंटे के लिए RT पर इनक्यूबेट किया गया। PBS से धोने के बाद, ग्रिड को 0.1 M कैकोडाइलेट बफर में 2% ग्लूटाराल्डिहाइड में रखा गया।

इसके बाद, ग्रिड को सुखाया गया और फिर 15 मिनट के लिए 2% यूरेनिल एसीटेट के साथ और 3 मिनट के लिए RT पर लीड स्टेन सॉल्यूशन (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ दाग दिया गया। ग्रिड को ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (JEM-1400प्लस; JEOLLtd.) के माध्यम से 100 kV के त्वरण वोल्टेज पर देखा गया। डिजिटल इमेज को CCD कैमरा (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) के साथ प्राप्त किया गया।

3। परिणाम

3.1. TFAM या GBA में कमी से एक्टोपिक माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए में वृद्धि होती है

सबसे पहले, हमने हेला कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया-व्युत्पन्न साइटोप्लाज्मिक डीएनए का पता लगाने का एक उदाहरण दिखाया जिसमें टीएफएएम प्रोटीन को siRNA द्वारा नष्ट कर दिया गया था (चित्र 1 ए)। टीएफएएम एक प्रमुख माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिलेखन कारक है और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए प्रतिकृति और मरम्मत में भी कार्य करता है [20]।

इस जीन में अनुक्रम बहुरूपता पार्किंसंस रोग से जुड़ी बताई गई है [21,22]। TFAM प्रोटीन नॉकडाउन के 3 दिनों के बाद, हेला कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में बहुत सारे डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए डॉट्स का पता चला।

हिस्टोन कोशिका द्रव्य में परमाणु-मूल डीएनए के लिए सकारात्मक मार्कर हैं, और कोशिका द्रव्य में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए और माइटोकॉन्ड्रियल-मूल डीएनए के लिए नकारात्मक मार्कर हैं [23]। ये बिंदु हिस्टोन के साथ सह-स्थानीय नहीं थे, यह दर्शाता है कि वे परमाणु-व्युत्पन्न डीएनए नहीं थे। इसके अलावा, इनमें से कुछ साइटोप्लाज्मिक, एक्टोपिक डीएनए डॉट्स माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स के लिए एक मार्कर Hsp60 के साथ सह-स्थानीय नहीं थे, यह दर्शाता है कि वे माइटोकॉन्ड्रिया के बाहर रहते थे (चित्र 1बी, सी)।

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने यह भी दिखाया कि एक्टोपिक डीएनए माइटोकॉन्ड्रिया से लीक हुआ (चित्र 2ए, बी)। संक्षेप में, TFAM नॉकडाउन द्वारा साइटोप्लाज्म में एक्टोपिक डीएनए डॉट्स में वृद्धि माइटोकॉन्ड्रिया से माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए लीक होने के कारण हुई थी। दूसरा, हमने हेला कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया-व्युत्पन्न साइटोप्लाज्मिक डीएनए का पता लगाने का एक और उदाहरण दिखाया जिसमें GBA प्रोटीन को siRNA द्वारा नॉकडाउन किया गया था (चित्र 1ए)।

जीबीए गौचर रोग के लिए कारक जीन है, लेकिन जीबीए का विषमयुग्मी उत्परिवर्तन पार्किंसंस रोग के लिए भी एक जोखिम कारक है [24]। जीबीए प्रोटीन नॉकडाउन के 3 दिनों के बाद हेला कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में बहुत सारे डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए डॉट्स का पता चला। कुछ डीएनए डॉट्स हिस्टोन के साथ सह-स्थानीयकृत थे, जो यह सुझाव देते थे कि वे परमाणु-व्युत्पन्न डीएनए थे।

अन्य डीएनए डॉट्स हिस्टोन के साथ सह-स्थानीयकृत नहीं थे, जिससे पता चलता है कि वे परमाणु-व्युत्पन्न डीएनए नहीं थे, बल्कि माइटोकॉन्ड्रिया-व्युत्पन्न डीएनए थे (चित्र 1डी)। संक्षेप में, जीबीए नॉकडाउन द्वारा साइटोप्लाज्म में एक्टोपिक डीएनए डॉट्स में वृद्धि कम से कम आंशिक रूप से माइटोकॉन्ड्रिया से माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए लीक होने के कारण थी।

For more information:1950477648nn@gmail.com