भाग Ⅰ: ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक किडनी रोग वाले रोगियों के एरिथ्रोइड पूर्वज कोशिकाओं से उत्पन्न किडनी ऑर्गेनॉइड

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रोबर्टा फेसिओलियो, फर्नांडो हेनरिक लोजुडिस, और एट अल।

परिचय

ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिकगुर्दे की बीमारी(ADPKD) दुनिया भर में क्रोनिक किडनी रोग (CKD) का सबसे लगातार आनुवंशिक कारण है, और यह सबसे अधिक प्रचलित विरासत में मिली मोनोजेनिक विकारों में से एक है, जो 1:400-1000 [1] की अनुमानित आबादी को प्रभावित करती है।ADPKD (ऑटोसोमल प्रमुख) पॉलीसिस्टिकगुर्दे की बीमारी) PKD1 (टाइप 1 पॉलीसिस्टिक किडनी रोग) और PKD2 (टाइप 2 पॉलीसिस्टिक किडनी रोग) जीन में उत्परिवर्तन के कारण होता है, क्रमशः पॉलीसिस्टिन -1 (PC1) और पॉलीसिस्टिन -2 (PC2) के लिए कोडिंग, जिसके परिणामस्वरूप सिलिया परिवर्तन और पुटी का निर्माण होता है। दोनों प्रोटीन कई आणविक मार्गों के साथ-साथ ऊतक आकृति विज्ञान और कार्य को नियंत्रित करते हैं। हालांकि, सिस्टोजेनेसिस अंतर्निहित सटीक आणविक तंत्र अस्पष्ट रहते हैं। यह अच्छी तरह से स्वीकार किया गया है कि सामान्य एलील में एक दैहिक उत्परिवर्तन (दूसरा-हिट) के बाद एक रोगाणु उत्परिवर्तन सिस्टोजेनेसिस [2,3] के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, ऑर्थोलॉगस माउस मॉडल के परिणामों के आधार पर, यह प्रदर्शित किया गया है कि परिपक्व गुर्दे [4,5] में तेजी से और गंभीर पुटी वृद्धि के लिए एक अतिरिक्त गुर्दे का अपमान (तीसरा-हिट) आवश्यक है। ऐसा लगता है कि मनुष्यों में, दूसरी हिट गुर्दे के विकास के दौरान होती है, जिससे गर्भाशय में भी सिस्टिक गठन और विकास होता है। इसलिए, पीकेडी 1 (टाइप 1 पॉलीसिस्टिक किडनी रोग) और पीकेडी 2 (टाइप 2 पॉलीसिस्टिक किडनी रोग) उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप गुर्दे की बीमारी की गंभीरता और प्रगति की दर कई कारकों से प्रभावित हो सकती है, जिसमें जीन की निष्क्रियता का समय, गुर्दा विकासात्मक चरण, पर्यावरणीय प्रभाव, सहवर्ती गुर्दे के घावों की उपस्थिति और आनुवंशिक उत्परिवर्तन की विविधता।

यद्यपि ADPKD (ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक .) के पैथोफिज़ियोलॉजिकल तंत्र से संबंधित असंख्य डेटा हैंगुर्दे की बीमारी) ऑर्थोलॉगस और नॉनऑर्थोलॉजस माउस मॉडल को नियोजित करने वाले अध्ययनों से एकत्र किए गए, सिस्टोजेनेसिस के मानव सेलुलर मॉडल पर ध्यान केंद्रित करने वाले केवल कुछ मुट्ठी भर अध्ययन उपलब्ध हैं [6]। 2007 में, ताकाहाशी एट अल। [जेड ने सफलतापूर्वक दैहिक कोशिकाओं को भ्रूणीय गुणों के साथ प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं में पुन: प्रोग्राम किया, उन्हें "प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल" (आईपीएससी) नाम दिया। तब से, कई दैहिक कोशिका स्रोतों को या तो पशु या मानव ऊतकों (hiPSCs) [Z] से IPSCs (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) में पुन: क्रमादेशित किया गया है, जिसमें वयस्क फ़ाइब्रोब्लास्ट बाद के मुख्य स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। 2013 में, फ्रीडमैन एट अल। [8] ADPKD (ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक) के फाइब्रोब्लास्ट से प्रेरित hiPSCs (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल)गुर्दे की बीमारी) रोगियों और पॉलीसिस्टिक रोग (पीकेडी) पैथोफिज़ियोलॉजी की जांच के लिए ऐसी कोशिकाओं के उपयोग का समर्थन करते हुए, पॉलीसिस्टिन -2 की सिलिअरी अभिव्यक्ति में कमी पाई गई। हाल ही में, चेन एट अल ने 2016 में बताया कि उन्होंने एरिथ्रोइड पूर्वज कोशिकाओं [9] से हाईपीएस कोशिकाएं प्राप्त की थीं।

पिछले कुछ वर्षों में, iPSCs (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) [Z,10-12] से 3-आयामी ऑर्गेनोइड्स के निर्माण में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है। मुख्यगुर्दाट्यूबलर एपिथेलियल ऑर्गेनोइड गुर्दे के ऊतकों से, साथ ही मूत्र से प्राप्त किए जा सकते हैं, और ये ऑर्गेनोइड व्यक्तिगत रोग मॉडलिंग के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं, जैसा कि शुटगेंस एट अल द्वारा दिखाया गया है। [13]। बाद के अध्ययनों में, फ्रीडमैन एट अल। [14] उत्पन्न करने में सक्षम थेगुर्दाएक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध hiPS सेल लाइन से प्राप्त ऑर्गेनोइड्स, मेटा-नेफ्रिक द्रव्यमान में मौजूद सेल प्रकारों को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना करते हैं जो नेफ्रॉन की सभी संरचनाओं को जन्म देते हैं। फिर, PKD1 (टाइप 1 पॉलीसिस्टिक .) को नीचे गिराकरगुर्दारोग) या PKD2 (टाइप 2 पॉलीसिस्टिक किडनी रोग) जीन, इन जांचकर्ताओं ने सिस्ट के गठन को देखागुर्दानलिकाएं इन सभी उन्नत और नवीन तकनीकों को ध्यान में रखते हुए, हमने ADPKD (ऑटोसोमल डोमिनेंट पॉलीसिस्टिक) के परिसंचारी एरिथ्रोइड पूर्वज कोशिकाओं से IPSC (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) प्राप्त करने का लक्ष्य रखा है।गुर्दे की बीमारी)रोगियों और प्रारंभिक सिस्टोजेनेसिस से संबंधित कुछ पैथोफिजियोलॉजिकल घटनाओं को उकसाने की कोशिश करते हुए, ऑर्गेनोजेनेसिस में शामिल चरणों को पुन: व्यवस्थित करने के लिए इन विट्रो में किडनी ऑर्गेनॉइड के विकास का परीक्षण करें।

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तरीके रोगी चयन

एडीपीकेडी (ऑटोसोमल डोमिनेंट पॉलीसिस्टिक किडनी डिजीज) (पीटी1:66 साल पुराना, ईजीएफआर 43.8 एमएल/मिनट प्रति 1.73 मी2 और पीटी2:56 साल पुराना, ईजीएफआर 60.2 एमएल/ मिन प्रति 1.73 एम2), इसके बाद पॉलीसिस्टिक किडनी रोग हुआ। साओ पाउलो (यूएनआईएफईएसपी) के संघीय विश्वविद्यालय के नेफ्रोलॉजी डिवीजन के आउट पेशेंट क्लिनिक और एक स्वस्थ महिला से एक और नमूना एकत्र किया गया था, जो तकनीक को स्थिर और सामान्य करने के लिए नियंत्रण के रूप में कार्य करता था। एडीपीकेडी (ऑटोसोमल डोमिनेंट पॉलीसिस्टिक किडनी डिजीज) निदान सकारात्मक पारिवारिक इतिहास और गुर्दे के सिस्ट की उपस्थिति पर आधारित था, पेई एट अल द्वारा अल्ट्रासोनोग्राफिक नैदानिक ​​​​मानदंडों के अनुसार। [15]। (पारिवारिक वंशावली S1A अंजीर में प्रस्तुत की जाती है)। दोनों रोगियों में सिस्टिक किडनी और लीवर थे (चुंबकीय अनुनाद चित्र S1B अंजीर में प्रस्तुत किए गए हैं)। अध्ययन की समीक्षा की गई और विश्वविद्यालय की नैतिकता सलाहकार समिति (सीईपी यूनिफेस्प, "कॉमाइट डे एटिका एम पेस्क्विसा दा यूनिवर्सिडेड फेडरल डी साओ पाउलो", Nr.1199.-0079-10/2018) द्वारा अनुमोदित किया गया। अध्ययन के उद्देश्य की व्याख्या करने के लिए एक साक्षात्कार के बाद, रोगियों और स्वस्थ नियंत्रण दोनों ने सूचित सहमति फॉर्म पर हस्ताक्षर किए।

पूरे रक्त से पृथक एरिथ्रोइड पूर्वज कोशिकाओं का विस्तार कमरे के तापमान पर रक्त के नमूनों को EDTA (एक थक्कारोधी के रूप में) युक्त एक वैक्यूटेनर ट्यूब में एकत्र किया गया था। एरिथ्रॉइड पूर्वज (ईपी) कोशिकाओं को तब रोसेटसेप विधि (15216; स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज) के माध्यम से अलग किया गया था, जिसने वांछित ईपी आबादी को बनाए रखते हुए अवांछित कोशिकाओं, जैसे परिपक्व आरबीसी और प्लेटलेट्स को हटा दिया। पूरे रक्त में ईपी की कम सांद्रता के कारण, कोशिकाओं को एक विशिष्ट संस्कृति माध्यम में विस्तारित और सुसंस्कृत किया गया जिसमें साइटोकिन्स और पूरक (एक्स-विवो माध्यम, लोन्ज़ा) शामिल थे। ईपी कोशिकाओं को ट्रांसफ़रिन रिसेप्टर (सीडी 71) का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा पहचाना गया था और ग्लाइकोफोरिन ए (ग्लाइ ए) को मार्कर के रूप में जीएफपी (एस 2 अंजीर) के साथ लेबल किया गया है।

रिप्रोग्रामिंग एरिथ्रोइड पूर्वज कोशिकाएं

विस्तारित ईपी कोशिकाओं को एकत्र किया गया और एक एपि 5 एपिसोमल आईपीएससी (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) रिप्रोग्रामिंग-मिंग किट (थर्मो फिशर) का उपयोग करके न्यूक्लियोफेक्ट किया गया, जिसमें पांच रिप्रोग्रामिंग कारकों (अक्टूबर -4, Sox2, Lin28, L-Myc, का एक अनुकूलित मिश्रण था। और Klf4)। ट्रांसफ़ेक्शन (इलेक्ट्रोपोरेशन) एक लोन्ज़ा न्यूक्लियो फ़ैक्टर किट से एपिसोडिक वैक्टर (वायरस-मुक्त, गैर-एकीकृत) के साथ किया गया था। अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं को मानक सेल संस्कृति स्थितियों (37सी, 95 प्रतिशत सीओ, और 5 प्रतिशत ओ,) के तहत रिप्रोग्रामिंग (स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज) के लिए रेप्रोटेएसआर-विशिष्ट संस्कृति माध्यम में चढ़ाया गया था।

कैरियोटाइपिंग

यह सत्यापित करने के लिए कि क्या रिप्रोग्रामिंग प्रक्रिया ने क्रोमोसोमल अखंडता को संरक्षित किया है, यूनिफेस्प के आनुवंशिक विभाग में कैरियोटाइप विश्लेषण किया गया था। कोशिकाओं को आईपी के 5 मिलीलीटर में कोल्सीसिन के 100 उल (0.08ug/ml) के साथ इलाज किया गया था। कोशिका चक्र गिरफ्तारी को प्रेरित करने के लिए सेल संस्कृति माध्यम, जिसके बाद परमाणु सूजन को प्रेरित करने के लिए 0.075 एम हाइपोटोनिक केसीएल समाधान जोड़ा गया; कोशिकाओं को तब मेथनॉल और एसिटिक एसिड (3:1) के मिश्रण के साथ तय किया गया था। मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों को काटा गया था, और राइट स्टेनिंग का उपयोग जी-बैंड (S3 अंजीर) के साइटोजेनिक विश्लेषण के लिए किया गया था।

IPSC (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) कॉलोनी लक्षण वर्णन

ईपी कोशिकाओं को विशिष्ट आईपीएससी (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) कॉलोनियों का गठन करने वाले एपिसोडिक वैक्टर द्वारा पुन: प्रोग्राम किया गया और एक सामान्य कैरियोटाइप (एस 3 अंजीर) प्रस्तुत किया गया। IPSC (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) कॉलोनी विशेषताओं की तुलना H9 लाइन सेल (hESC, ह्यूमन एम्ब्रियोनिक स्टेम सेल, WA 0 9, विसेल रिसर्च इंस्टीट्यूट, यूएसए से उपलब्ध) से प्राप्त एक स्थापित नियंत्रण के साथ की गई थी। अंजीर 1 बी)। चूंकि IPSC (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) ने विशिष्ट आकारिकी प्रस्तुत की, प्लुरिपोटेंसी मार्करों की पहचान इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा की गई। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया था। फिक्सिंग के बाद, नमूनों को तीन बार पीबीएस से धोया गया, 5 प्रतिशत पीएसए और 0.3 प्रतिशत ट्राइटन-एक्स -100 / डीपीबीएस में अवरुद्ध किया गया, और प्राथमिक एंटीबॉडी (सेल सिग्नलिंग, मा, ईयूए) के साथ रातोंरात ऊष्मायन किया गया, अर्थात् ओसीटी 4 (1 :400 कमजोर पड़ने) प्लुरिपोटेंसी के परीक्षण के रूप में। अगले दिन, एक नई स्लाइड तैयार की गई, पीबीएस में धोया गया, और एलेक्सा फ्लोर सेकेंडरी एंटीबॉडी (1: 200 कमजोर पड़ने, सेल सिग्नलिंग) के साथ ऊष्मायन किया गया, और डीएपीआई (1: 1000, इंविट्रोजन, एमए, यूएसए) को परमाणु के लिए जोड़ा गया। पहचान।

अंजीर 1. आईपीएससी का निर्माण और लक्षण वर्णन(प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल). IPSC को एक स्वस्थ नियंत्रण (HC) और दो अलग ADPKD रोगियों (PT1 और PT2) से विस्तारित एरिथ्रोइड पूर्वज (EP) कोशिकाओं से पुन: प्रोग्राम किया गया था।

ए। गुर्दे की योजनाबद्ध चरणबद्ध पीढ़ी बी। आईपीएससी की समानता (ए। वाणिज्यिक एच 9 भ्रूण कोशिकाओं से आईपीएससी की विशिष्ट छवि। बी। स्वस्थ नियंत्रण से पूर्वज एरिथ्रोइड कोशिकाओं से आईपीएससी)

C. IPSC कॉलोनियों की आकृति विज्ञान D. IPSC प्लुरिपोटेंसी की विशेषता एक EVOS fl उल्टे डिजिटल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत देखी गई।

OCT4 एंटीबॉडी लेबलिंग का उपयोग HC, PT1, और PT2 कॉलोनियों की प्लुरिपोटेंसी प्रकृति को चिह्नित करने के लिए प्लुरिपोटेंसी मार्कर के रूप में किया गया था।

सेल नाभिक को डीएपीआई (अंजीर 1 बी के लिए स्केल बार: 200 माइक्रोन; अंजीर 1 सी के लिए स्केल बार: 1000 माइक्रोन; स्केल बार एचसी / पीटी 2 के लिए अंजीर 1 डी: 1000 माइक्रोन; स्केल बार पीटी 1 के लिए अंजीर 1 डी: 200 माइक्रोन) के साथ लेबल किया गया था।

तीनों रोगाणु परतों में अंतर करने के लिए IPSC (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) की क्षमता

iPSCs (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) mTeSR1 संस्कृति माध्यम (स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज, बीसी, कनाडा) में मैट्रीगेल (1:10, बीडी बायोसाइंसेस, एनवाई, ईयूए) के साथ लेपित 6-वेल प्लेट्स में उगाए गए थे। IPSCs (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) को विभेदित करने से रोकने के लिए, कालोनियों को एक माइक्रोस्कोप के तहत एक पिपेट टिप के साथ यांत्रिक विखंडन द्वारा मैन्युअल रूप से पारित किया गया था, या उन्हें जेंटल सेल (लाइफ टेक्नोलॉजीज) (S4 अंजीर) का उपयोग करके एंजाइमी पाचन द्वारा अलग कर दिया गया था। इन विधियों का उपयोग करते हुए, IPSCs (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) को 22 सीरियल पास-ऋषियों के लिए बनाए रखा गया था ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाओं ने रिप्रोग्रामिंग कारकों को ठीक से शामिल किया है। IPSCs (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) को तब STEMdiff Trilineage विभेदन किट (स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज) का उपयोग करके तीन रोगाणु परतों में अंतर करने के लिए प्रेरित किया गया था। पांच दिनों के बाद, कोशिकाओं को मेसोडर्म और एंडोडर्म के लाइन-आयु-विशिष्ट मार्करों के विश्लेषण के लिए काटा गया था, और सात दिनों के बाद उनका एक्टोडर्म के लिए विश्लेषण किया गया था, STEMdiff ट्रिलिनेज डिफरेंशियल प्रोटोकॉल (S5 अंजीर) के अनुसार।

क्यूआरटी-पीसीआर . द्वारा तीनों रोगाणु लाइनों का आणविक लक्षण वर्णन

तीन रोगाणु परतों की संस्कृतियों से कुल आरएनए को जीई आरएनए स्पिन मिनी किट (जीई हेल्थकेयर, यूएसए) का उपयोग करके निकाला गया था, और फिर निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उच्च क्षमता रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, यूएसए) का उपयोग करके सीडीएनए में परिवर्तित किया गया था। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (जीआरटी-पीसीआर) एक एसवाईबीआर ग्रीन पीसीआर किट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था। 2 ^ सीटी पद्धति का उपयोग करके mRNA अभिव्यक्ति स्तरों की गणना की गई थी। Hydroxymethylbilane सिंथेज़ (HMBS) और ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया गया था, और OCT4 की अभिव्यक्ति का उपयोग मात्रात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। SOX17 की अभिव्यक्ति का उपयोग एंडोडर्म में भेदभाव की पहचान करने के लिए किया गया था, CXCR4 का उपयोग मेसोडर्म में भेदभाव की पहचान करने के लिए किया गया था, और PAX6 का उपयोग एक्टोडर्म (S6 अंजीर) में भेदभाव की पहचान करने के लिए किया गया था। सभी प्राइमर अनुक्रम S1 तालिका में निर्दिष्ट हैं, और प्रत्येक प्राइमर जोड़ी के लिए दक्षता वक्र का मूल्यांकन किया गया था।

विभिन्न रोगाणु परतों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस

IPSC (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) को छह-अच्छी तरह से प्लेटों में कवरस्लिप पर अंतर करने के लिए प्रेरित किया गया था। विभेदन के बाद, कवरस्लिप्स को मूल कुओं से हटा दिया गया और एक नई प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया, जहां कोशिकाओं को 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया और फिर पीबीएस से धोया गया, जैसा कि ऊपर वर्णित है। OCT4 (1:400; सेल सिग्नलिंग), CXCR4 (1; 100; सेल सिग्नलिंग), PAX6 (1: 100; थर्मो फिशर), और SOX17 (1: 100; R & D सिस्टम) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। प्रतिदीप्ति का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था एलेक्सा फ्लोर सेकेंडरी एंटीबॉडी (1:200; सेल सिग्नलिंग)।

IPSCs (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) से किडनी ऑर्गेनॉइड भेदभाव

क्रूज़ एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के बाद रेनलऑर्गेनोइड्स उत्पन्न किए गए थे। [6] कुछ अनुकूलन के साथ। संक्षेप में, 50, 000 HC और दो ADPKD (ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक किडनी रोग) से IPSC (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) रोगियों का उपयोग Accutase टुकड़ी समाधान (स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज) के साथ एकल कोशिकाओं के निलंबन का उत्पादन करने के लिए किया गया था। एकल कोशिकाओं को 10uM Rho-kinase अवरोधक (Y27632, स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज या स्टेमजेंट) के साथ पूरक किया गया था। 16 घंटे के बाद, संस्कृति माध्यम को 1 एमएल mTeSR1 प्लस 2.5 प्रतिशत Matrigel प्लस 10 μuM Y27632 के साथ बदल दिया गया था। 20 घंटे के बाद, माध्यम को केवल 1mL ofmTeSRI के साथ बदल दिया गया था; 14 घंटे बाद, संस्कृति माध्यम को बदल दिया गया था, और कोशिकाओं को प्रेरित किया गया था 6 uM CHIR99021 (AT104; स्टेम सेल या स्टेमजेंट GSK-3b इनहिबिटर/Wnt पाथवे एगोनिस्ट) प्लस एडवांस्ड RPMI (थर्मो फिशर) प्लस ग्लूटामैक्स (लाइफ टेक्नोलॉजीज) प्लस 10 ug/ml एंटीबायोटिक (एम्पीसिलीन; 1:1000; गिब्को ) अंत में, 36 घंटे बाद, संस्कृति माध्यम को डीआरबी माध्यम से बदल दिया गया जिसमें उन्नत आरपीएमआई (थर्मो फिशर) प्लस ग्लूटामैक्स (थर्मो फिशर) प्लस बी 27 सप्लीमेंट (17504-044; लाइफ टेक्नोलॉजीज) प्लस एंटीबायोटिक शामिल थे। 28 दिनों के लिए हर तीन दिन में DRB माध्यम को बदला गया। यह अवधि (28 दिन) माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जाने वाले ऑर्गेनोइड के लिए पर्याप्त थी।

आरटी-पीसीआर द्वारा ऑर्गेनोइड्स का आण्विक लक्षण वर्णन

अर्ध-मात्रात्मक जीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन आरटी-पीसीआर द्वारा भ्रूणजन्य प्रक्रिया के दौरान किया गया था, जिसमें कुल आरएनए को दिन में गठित सेल संरचनाओं से शुद्ध किया गया था 0 (आईपीएससी (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल)) और 14,21, 28, और भेदभाव प्रेरण के 35 दिन बाद। WT1 (गुर्दे का विकास), AQP1 (समीपस्थ ट्यूब), और ECAD (सिस्ट एपिथेलियम मार्कर) की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया गया था। GAPDH का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया गया था। OCT4 की अभिव्यक्ति का उपयोग मात्रात्मक मानक के रूप में किया गया था।

परिणाम

एरिथ्रोइड प्रोजेनिटर्स (ईपी) से आईपीएससी (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) प्राप्त करना

एरिथ्रोइड प्रोजेनिटर से किडनी ऑर्गेनोइड प्राप्त करने के लिए नियोजित प्रोटोकॉल को संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। ईपी के विस्तार के परिणामस्वरूप लगभग 20 दिनों (एस 2 ए अंजीर) के बाद 1x10 डिग्री कोशिकाएं हुईं, और लगभग दो महीने बाद, ईपी को मार्कर सीडी 71 और ग्लाइ ए की अभिव्यक्ति से पहचाना गया। पृथक्करण विधि की दक्षता ने अभिव्यक्ति का खुलासा किया; 88 प्रतिशत कोशिकाओं सीडी71 पॉजिटिव थे, और 57,4 प्रतिशत ग्लाइक ए पॉजिटिव (एस2बीफिग) थे।

यह सत्यापित करने के बाद कि कोशिकाएँ EP हैं, उन्हें रिप्रोग्रामिंग कारकों (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc, और klf4) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और फिर रीप्रोग्रामिंग (ReproTeSR, स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज) के लिए एक विशिष्ट माध्यम में बनाए रखा गया। लगभग पांच दिनों के लिए। IPSC (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) ने एक ही सेल संस्कृति में मौजूद गैर-रिप्रोग्राम्ड कोशिकाओं से अलग आकारिकी के साथ कॉलोनियों का निर्माण करके विशिष्ट सेलुलर विशेषताओं का विकास किया। कोशिकाओं की निगरानी तब तक की गई जब तक कि हमने विशिष्ट IPSC (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) जैसी कॉलोनियों का अवलोकन नहीं किया, जो वाणिज्यिक H9 सेल लाइन (Eig 1B) की कॉलोनियों के समान थीं। iPSC (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) कॉलोनियों को भी उनके अपेक्षाकृत बड़े आकार से पहचाना गया था, तंग सेल पैकिंग, अच्छी तरह से परिभाषित सजातीय आकार, और नियमित किनारों। फीडर-फ्री रिप्रोग्रामिंग माध्यम (ईआईजी 1 सी) में विभेदित कोशिकाओं से कॉलोनी अतिवृद्धि की निम्न डिग्री द्वारा पहचान की सुविधा प्रदान की गई थी। कॉलोनी आकारिकी और प्लुरिपोटेंसी मार्करों के संदर्भ में एचसी और एडीपीकेडी (ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक किडनी रोग) रोगियों (पीटीएल और पीटी 2) से आईपीएससी कॉलोनियों में कोई पता लगाने योग्य अंतर नहीं पाया गया, जैसा कि अंजीर 1 डी में दिखाया गया है।

IPSC (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) को आगे तीन रोगाणु परतों में अंतर करने की उनकी क्षमता की विशेषता थी। एचसी से कोशिकाओं में रोगाणु परत के विकास की प्रगति की विशिष्ट छवियों को S5 अंजीर में दिखाया गया है। तीन रोगाणु परतों के विकास को विशिष्ट आकृति विज्ञान (ईआईजी 2 ए) द्वारा सत्यापित किया गया था और विभेदक मार्करों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग द्वारा, अर्थात् एंडो-डर्म के लिए FOXA2 द्वारा सत्यापित किया गया था। , मेसोडर्म के लिए चिकनी पेशी एक्टिन (SMA) और एक्टोडर्म के लिए SOX2 (Eig2B -2D)। एंटीबॉडी के लिए नकारात्मक नियंत्रण S7 अंजीर में दिखाए गए हैं। चित्र 2E RT-PCR द्वारा पता लगाए गए एंडोडर्म (SOX17), मेसोडर्म (CXCR4), और एक्टोडर्म (PAX6) के विशिष्ट मार्करों के जीन अभिव्यक्ति स्तर को दर्शाता है।

अंजीर 2. तीन रोगाणु परतों की विशेषता। स्वस्थ नियंत्रण (HC) और ADPKD1 रोगी (PT1 और PT2)।

A. तीन रोगाणु परतों की विशिष्ट आकृति विज्ञान। रोगाणु परतों को विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा विशेषता दी गई थी। बी एंडोडर्म (FOXA2),

C. मेसोडर्म (SMA) और D. एक्टोडर्म (SOX2)। सेल नाभिक डीएपीआई के साथ दागे गए थे। अंतिम कॉलम मर्ज किए गए चित्र दिखाते हैं।

OCT4 की E. जीन अभिव्यक्ति IPSC की बहुलता को इंगित करती है, SOX17 एंडोडर्म के लिए एक मार्कर था, CXCR4 मेसोडर्म के लिए एक मार्कर था और PAX6 एक्टोडर्म (n=2) के लिए एक मार्कर था।

IPSC द्वारा OCT4 अभिव्यक्ति का उपयोग आंतरिक मात्रात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। तीन रोगाणु परतों (पैमाने: 200 माइक्रोन) की कोशिकाओं में OCT4 अभिव्यक्ति अवांछनीय थी।

IPSCs (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) से किडनी ऑर्गेनॉइड का निर्माण

एचसी से प्राप्त आईपीएससी (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) और एडीपीकेडी (ऑटोसोमल डोमिनेंट पॉलीसिस्टिक किडनी रोग) दोनों रोगियों से त्रि-आयामी वृक्क संरचनाएं उत्पन्न की गईं, जो भ्रूण के विकास को पुन: व्यवस्थित करने वाले चरणों का पालन करती हैं। चित्र 3 उन चरणों को दिखाता है जो संबंधित भ्रूण संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। IPSC (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) कॉलोनियों (Eig 3A) को एकल IPSC (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) (Fig3C) प्राप्त करने के लिए Accutase (छवि 3B) के साथ अलग कर दिया गया था। सामान्य भ्रूणजन्य प्रक्रिया को ध्यान में रखते हुए, कॉलोनियों को एक ब्लास्टुला और फिर एक गैस्ट्रुला में अंतर करने की उम्मीद की जाएगी, लेकिन संस्कृति में आईपीएससी (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) का सहज भेदभाव अभी भी एक चुनौती है क्योंकि कोशिकाएं अनायास एपोप्टोसिस [16] से गुजरती हैं। इस अवांछित परिणाम को दरकिनार करने के लिए, 10μM Rho-kinase अवरोध करनेवाला Y27632） का एक ROCK अवरोधक एकल-कोशिका चरण के बाद 16 घंटे में जोड़ा गया था। ROCK पाथवे का अवरोध कोशिकाओं को मृत्यु पथ को ट्रिगर करने से रोकता है, जिससे उन्हें जीवित रहने और भेदभाव प्रक्रिया की ओर बढ़ने के लिए समायोजित करने की अनुमति मिलती है। IPSCs (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल) तब एपिब्लास्ट चरण तक पहुंचने तक बढ़े, जो गोलाकार गुहाओं (छवि 3 डी) की उपस्थिति की विशेषता है। इसके बाद, एक शक्तिशाली GSK-3b अवरोधक/Wnt पाथवे एगोनिस्ट (CHIR99021) जोड़ा गया, जिसके बाद उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (चित्र 3E और 3E) को प्रेरित करने के लिए DRB माध्यम को जोड़ा गया और अंत में मेसेनचाइम-उपकला संक्रमण ( अंजीर 3 जी); इन चरणों ने उपकलाकरण और प्री-ट्यूबलर एग्रीगेट्स और रीनल वेसिकल्स (ईआईजी 3 एच) के अनुक्रमिक गठन को सक्षम किया, जिसने अंततः रीनल ट्यूबलर ऑर्गेनोइड्स (छवि 3 डी) के गठन को सक्षम किया। ये सभी इन विट्रो भ्रूणजनन चरण एचसी और एडीपीकेडी (ऑटोसोमल डोमिनेंट पॉलीसिस्टिक किडनी रोग) रोगियों दोनों से प्राप्त कोशिकाओं के लिए समान थे।

ट्यूबलर संरचनाओं की उपस्थिति को इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा सत्यापित किया गया था: समीपस्थ नलिकाओं के लिए NHE3 और AQP1 (Eig4A) और ग्लोमेरुली के लिए NPHS2 (Eig 4B)। इसके विपरीत, AQP2 लेबलिंग का पता नहीं चला था (Eig 4B), यह पुष्टि करता है कि यह कार्यप्रणाली ने केवल मेटानेफ्रिक द्रव्यमान के विकास की अनुमति दी, लेकिन मूत्रवाहिनी की कली की नहीं। फोरस्किन (चित्र 4बी) की अनुपस्थिति में मार्कर ईसीएडी का पता नहीं चला था।

पूर्वज गुर्दे के विकास की प्रक्रिया के दौरान व्यक्त विशिष्ट मार्करों की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए, सभी नमूने (एचसी, पीटी 1, और पीटी 2) भेदभाव की पूरी प्रक्रिया के पांच बिंदुओं पर एकत्र किए गए थे: दिन 0 (आईपीएससी (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम) कोशिकाओं)), दिन 14,21,28, और फिर दिन 35 (सिस्ट इंडक्शन के बाद 7 दिन)। जीन अभिव्यक्ति के समय पाठ्यक्रम में भ्रूणजनन प्रक्रिया के दौरान विभेदन का पता चला, जैसा कि चित्र 5ए-5C में दिखाया गया है। प्लुरिपोटेंसी मार्कर OCT4 को IPSC (दिन O) द्वारा व्यक्त किया गया था, लेकिन इसका स्तर 14 दिनों में कम हो गया था, जो भेदभाव के बाद बहुत निम्न स्तर तक पहुंच गया था। इसके विपरीत, मेटानेफ्रिक मेसेनचाइम (WT1) और समीपस्थ नलिका (AQP1) के विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति उत्तरोत्तर वृद्धि हुई जब भेदभाव प्रक्रिया 14 दिन तक शुरू हुई, 21 दिन तक एक पठार तक पहुंच गई। चित्र 5D ECAD की अभिव्यक्ति को दर्शाता है, एक सिस्टोजेनेसिस मार्कर, 35 दिन पर, यानी फोरस्किन द्वारा पुटी प्रेरण के 7 दिन बाद। फोरस्किन की अनुपस्थिति में, ईसीएडी की अभिव्यक्ति बहुत कम थी, यहां तक ​​कि एडीपीकेडी (ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक किडनी रोग) रोगियों में भी। हालांकि, जब फोरस्किन जोड़ा गया (दिन 28), दोनों रोगियों ने ईसीएडी अभिव्यक्ति में वृद्धि का प्रदर्शन किया; लेकिन एचसी ऑर्गेनॉइड में वही पैटर्न नहीं देखा गया जो फोरस्किन की उपस्थिति में भी ईसीएडीएक्सप्रेशन के निम्न स्तर के साथ बना रहा।

फोरस्किन से प्रेरित ऑर्गेनोइड्स से बनने वाले सिस्ट की उपस्थिति ADPKD (ऑटोसोमल डोमिनेंट पॉलीसिस्टिक किडनी डिजीज) रोगियों के लिए स्पष्ट थी, जैसा कि Eig6 में दिखाया गया है। ऊपरी पैनल फोरस्किन (Eig6Aa) को जोड़ने से पहले 28 दिन ऑर्गेनॉइड की छवियां दिखाता है। Eig6Ab (पैनोरमिक व्यू-4X) और 6Ac(20X व्यू-इंग) की उपस्थिति में दिन 35 पर ऑर्गेनॉइड दिखाते हैं। forskolin दोनों रोगियों (PT1 और PT2) के नमूनों में पुटी जैसी संरचनाओं की उपस्थिति दिखा रहा है, लेकिन HC नमूने में नहीं। सिस्ट की उपस्थिति को इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग (चित्र 6बी) द्वारा भी सत्यापित किया गया था। एचसी ऑर्गेनॉइड में ईसीएडी लेबलिंग का पता नहीं चला था, लेकिन यह दोनों रोगियों के ऑर्गेनोइड्स में स्पष्ट रूप से देखा गया था। दिलचस्प है, एक पुटी लुमेन की उपस्थिति भी देखी जा सकती है।

अंजीर 3. ट्यूबलर ऑर्गेनोइड का निर्माण।

एचसी, पीटी1 और पीटी2 समूहों से उत्पन्न आईपीएससी से 28 दिनों में एपिथेलियल ट्यूबलर किडनी ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी की चरण-विपरीत छवियां। पहले 36 घंटे में, आईपीएससी को 3डी कल्चर में बनाए रखा गया था।

फिर, उन्हें अलग कर दिया गया, एकल कोशिकाओं में बदल दिया गया, और वाई -27632 के साथ इलाज किया गया, जिसने सेलुलर पुनर्गठन और अस्तित्व की अनुमति दी, जिससे एपिब्लास्ट स्पेरोइड्स (डी) का उत्पादन हुआ।

फिर, CHIR99201 और DRB को जोड़ा गया, Wnt/-कैटेनिन मार्ग को सक्रिय किया गया और ट्यूबलर ऑर्गेनोइड्स (I) में विभेदन की अनुमति दी गई।

ADPKD रोगियों और एक HC दाता से प्राप्त गोलाकारों के बीच आकारिकी समान है। (ए और एफ के लिए स्केल बार: 1000μm; बी, सीडी, ई, जी, एच और आई: 200μm के लिए स्केल बार)।

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