एपिजेनेटिक रेगुलेटर BRD4 रैट किडनी में कैडमियम-ट्रिगर इंफ्लेमेटरी रिस्पांस में शामिल है

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झोंगगुओ गोंग एट अल

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सार

कैडमियम (सीडी) को एक संभावित भड़काऊ संकेतक के रूप में वर्णित किया गया है, जबकि बढ़ते प्रमाण से पता चलता है कि अनुचित सूजन एक योगदान कारक हैगुर्दे की चोट. इसलिए, सीडी-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिसिटी के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए सीडी-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया पर शोध का बहुत महत्व है। ब्रोमोडोमैन युक्त 4(बीआरडी 4) एक महत्वपूर्ण एपिजेनेटिक नियामक है जो कई सूजन संबंधी बीमारियों के विकास में शामिल है, लेकिन सीडी-ट्रिगर में इसकी नियामक भूमिकाएंभड़काऊप्रतिक्रिया स्पष्ट की जानी बाकी है। यहां, हमने पाया कि स्प्रेग-डावले चूहों में सीडी के साथ उपचार (2 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू, आईपी, लगातार 5 दिन) और चूहे मेंगुर्दा कोशिकालाइन (NRK{0}}E, 0-10 μM, 12 h) ने भड़काऊ साइटोकिन्स के प्रतिलेखन को प्रेरित किया, जिसे JQ1 (BRD4 अवरोधक, 25 mg/kg BW, ip) द्वारा कम किया जा सकता है। , विवो में लगातार 3 दिन; 0.5 μM, 12 h इन विट्रो) या BRD4 छोटा हस्तक्षेप RNA (siRNA, इन विट्रो), यह सुझाव देता है कि BRD4 सीडी-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया में भाग लेता है। इसके बाद, हमारे अध्ययन ने सीडी-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया में बीआरडी 4 ​​की भूमिकाओं को स्पष्ट किया। BRD4 के निषेध ने विवो और इन विट्रो में सीडी-प्रमोटेड NF-κB परमाणु अनुवाद और सक्रियण को कम कर दिया। Cd ने RelA K310 के एसिटिलीकरण स्तर को बढ़ाया और विवो और इन विट्रो में एसिटिलेटेड NF-κB RelA के लिए BRD4 बाइंडिंग को बढ़ाया, जिसे BRD4 को रोककर निरस्त कर दिया गया। सारांश में, हमारे अध्ययन से पता चलता है कि BRD4 NF-κB सिग्नलिंग मार्ग की सक्रियता की मध्यस्थता करके और चूहे में एसिटिलेटेड NF-κB RelA के लिए बाध्यकारी बढ़ाकर भड़काऊ साइटोकिन्स के सीडी-ट्रिगर प्रतिलेखन में शामिल है।गुर्दा,इसलिए, BRD4 Cd- प्रेरित गुर्दे की बीमारियों के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य हो सकता है।

कीवर्ड: बीआरडी4कैडमियमगुर्दे की सूजनसाइटोकिन्स NF-κB JQ1

1 परिचय

कैडमियम (सीडी) उच्च विषाक्तता और लंबे आधे जीवन के साथ एक भारी धातु प्रदूषक है। औद्योगिक उत्पादन के विकास के साथ, पर्यावरण सुरक्षा और मानव स्वास्थ्य के लिए सीडी प्रदूषण के बढ़ते खतरे ने चिंता का विषय बना दिया है (वांग एट अल।, 2020; होरिगुची और ओगुमा, 2016)। शरीर द्वारा इसे अवशोषित करने के बाद, सीडी बहु-अंग क्षति को प्रेरित करती है औरगुर्दामुख्य लक्ष्य अंग है (फर्नांडो एट अल।, 2020; झाओ एट अल।, 2021)। पहले, हमने व्यवस्थित रूप से सत्यापित किया कि ऑटोफैगी निषेध, ऑक्सीडेटिव तनाव और एपोप्टोसिस सहक्रियात्मक रूप से चूहों में सीडी-कारण नेफ्रोटॉक्सिसिटी में योगदान करते हैं (लियू एट अल।, 2017; वांग एट अल।, 2017)। सूजन एक शारीरिक प्रतिक्रिया है जो संक्रमण या चोट के खिलाफ एक रक्षात्मक प्रतिक्रिया के रूप में कार्य करती है, लेकिन सीडी-प्रेरित अनियंत्रित और अनुचित भड़काऊ प्रतिक्रियाएं नुकसान पहुंचा सकती हैं जैसे कि दर्शकों के सामान्य ऊतक को नुकसान पहुंचाना और ऑटोइम्यून बीमारियों को बढ़ावा देना (होसेन-खन्नाज़र एट अल।, 2020; झांग एट) अल।, 2020)। सीडी-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया ने हृदय रोगों और यकृत की क्षति को बढ़ा दिया, यह सुझाव देते हुए कि सीडी-मध्यस्थता में सूजन महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती हैगुर्दापैथोलॉजिकल प्रक्रियाएं (Fagerberg et al।, 2017; Almeer et al।, 2019)।

एपिजेनेटिक्स गैर-डीएनए अनुक्रम परिवर्तनों के आधार पर जीन अभिव्यक्ति में आनुवंशिक संशोधनों को संदर्भित करता है, और इन संशोधनों की प्रतिवर्तीता नए चिकित्सीय लक्ष्यों (वेंडेटी और रुडिन, 2013) की खोज को सक्षम बनाती है। ब्रोमोडोमैन और एक्स्ट्रा-टर्मिनल डोमेन (बीईटी) परिवार में ब्रोमोडोमैन युक्त 2 (बीआरडी 2), बीआरडी 3, बीआरडी 4, और ब्रोमोडोमैन टेस्टिस-स्पेसिफिक (बीआरडीटी) शामिल हैं, जो दो ब्रोमोडोमेंस और हिस्टोन और गैर-हिस्टोन के एसिटिलेटेड लाइसिन के लिए बाध्यकारी हैं। लोचरिन एट अल।, 2014; चटर्जी और बोहमन, 2018)। बीटा प्रोटीन कई जीनों के ट्रांसक्रिप्शनल सह-सक्रियकर्ता के रूप में कार्य करते हैं, इस प्रकार विभिन्न रोग मॉडल (जियाओ एट अल।, 2020; वांग एट अल।, 2019 बी) में सेल चक्र, भड़काऊ प्रतिक्रिया, ऑक्सीडेटिव तनाव और अन्य शारीरिक प्रक्रियाओं को विनियमित करते हैं। BRD4 बीटा प्रोटीन परिवार का एक विशेष रूप से अच्छी तरह से अध्ययन किया गया सदस्य है, और संचित जांच ने इसे विभिन्न प्रकार के विनियमन में एक उपन्यास एपिजेनेटिक लक्ष्य के रूप में रिपोर्ट किया है।गुर्दा रोग, क्रोनिक नेफ्रैटिस, डायबिटिक नेफ्रोपैथी, और प्रायोगिक गुर्दे की क्षति (ज़ेंग और झोउ, 2002; मोर्गाडो-पास्कुअल एट अल।, 2019) सहित। BRD4 को कई रोगों (जू और वाकोक, 2014; सुआरेज़-अल्वारेज़ एट अल।, 2017) में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए परमाणु कारक-(B (NF-κB) -निर्भर प्रतिलेखन प्रक्रिया में भाग लेने की पुष्टि की गई है। BRD4 को एसिटिलेटेड RelA (NF-κB सबयूनिट, एक प्रोटीन-कोडिंग जीन) द्वारा लाइसिन 310 (RelA-K310ac) में इसके ब्रोमोडोमेंस के माध्यम से भर्ती किया जा सकता है, इस प्रकार साइक्लिन-आश्रित किनसे 9 (CDK9) को सक्रिय करता है और RNA पोलीमरेज़ II को फॉस्फोराइलेट करता है। NF-κB लक्ष्य जीन का प्रतिलेखन (Hajmirza et al।, 2018)। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि BRD4 अवरोधक भड़काऊ रोगों के लिए एक संभावित चिकित्सीय विकल्प हो सकता है। चूहे की रीढ़ की हड्डी की चोट के मॉडल में, BRD4 के निषेध ने भड़काऊ प्रतिक्रिया को कम कर दिया और माइक्रोग्लिया की कार्यात्मक वसूली को बढ़ावा दिया (Dey et al।, 2019)। इसके अलावा, BRD4 के निषेध ने एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध, एंटी मेम्ब्रेन बेसल GN, और एंजियोटेंसिन II (सुआरेज़-अल्वारेज़ एट अल।, 2017) के म्यूरिन मॉडल में प्रायोगिक गुर्दे की सूजन को समाप्त कर दिया।

सीडी के संभावित समर्थक भड़काऊ प्रभावों और सूजन पर बीआरडी 4 ​​के नियामक प्रभावों को देखते हुए, हमने अनुमान लगाया कि बीआरडी 4 ​​सीडी-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया में शामिल है। जैसा कि अपेक्षित था, BRD4 सीडी उजागर चूहे के गुर्दे के मॉडल में भड़काऊ साइटोकिन्स की प्रतिलेखन प्रक्रिया की मध्यस्थता करता है। हमारे अध्ययन से सीडी-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया में एक संभावित तंत्र का पता चलता है और सीडी-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिसिटी की चिकित्सा में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1. रसायन और एंटीबॉडी

कैडमियम क्लोराइड (CdCl2, निर्जल, 439800) सिग्मा-एल्ड्रिच (कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) से खरीदा गया था। (प्लस) -JQ1 (HY -13030) MedChemExpress (मोनमाउथ जंक्शन, एनजे, यूएसए) से प्राप्त किया गया था। बायोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी (शंघाई, चीन, P0027) से एक परमाणु प्रोटीन निष्कर्षण किट खरीदी गई थी। थर्मो फिशर साइंटिफिक (मैडिसन, WI, यूएसए) से एक कुशल रसायनयुक्त किट (ECL, 32209) और बाइसीनोनिक एसिड प्रोटीन परख अभिकर्मक (BCA, 23225) प्राप्त किए गए थे। निम्नलिखित प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था: NF-κB p65 ({11}} AP), IL -1 (26048-1- AP), TNF- (17590-1-AP) से खरीदे गए थे। प्रोटीनटेक ग्रुप (वुहान, चीन); -एक्टिन (3700 s), हिस्टोन H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), सामान्य खरगोश IgG (IgG, 4394) सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (Danvers, MA, USA) से खरीदे गए थे; BRD4 (ab128874), K (लाइसिन) एसिटाइलट्रांसफेरेज़ 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (एसिटाइल K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488-संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश (ab150073) खरीदे गए। Abcam (कैम्ब्रिज, यूके) से। दूसरा एंटीबॉडी: बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच प्लस एल) (115-035-003) और बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच प्लस एल) (111-035-003) जैक्सन इम्यूनोरिसर्च (वेस्ट ग्रोव, पीए, यूएसए) से खरीदे गए थे। )

2.2. पशु और प्रयोग

चौबीस स्प्राग-डावले चूहों (नर, 6 सप्ताह पुराने, 110–120 ग्राम) को पेंग्यू प्रायोगिक पशु प्रजनन कं, लिमिटेड (जिनान, शेडोंग, चीन) से खरीदा गया था। पर्यावरण नियंत्रित कमरे (24 ± 5 ​​डिग्री, 12 घंटे प्रकाश/अंधेरे चक्र) में चूहों को भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच की अनुमति दी गई थी। प्रायोगिक प्रक्रियाएं यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देश 2010/63/यूरोपीय संघ के लिए पशु प्रयोगों के लिए लागू थीं, और सभी प्रक्रियाओं को यंग्ज़हौ विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। एक सप्ताह के अनुकूलन के बाद, चूहों को बेतरतीब ढंग से चार समूहों में विभाजित किया गया था: (1) नियंत्रण समूह: इसी विलायक (शारीरिक खारा या 2- हाइड्रोक्सीप्रोपाइल - - साइक्लोडेक्सट्रिन समाधान) के साथ अंतःक्षिप्त रूप से इंजेक्ट किया गया। (2) सीडी समूह: सीडीएल 2 (2 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन, शारीरिक खारा में भंग) सीडी नशा मॉडल को स्थापित करने के लिए लगातार 5 दिनों तक इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया जाता है। (3) सीडी प्लस जेक्यू1 समूह: सीडीसीएल 2 (2 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) ने सीडी नशा मॉडल को स्थापित करने के लिए लगातार 5 दिनों तक इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्शन लगाया, और जेक्यू 1 (25 मिलीग्राम / किग्रा शरीर का वजन, 2- हाइड्रोक्सीप्रोपाइल {{ में भंग) 25}}साइक्लोडेक्सट्रिन समाधान) 6-8 दिन पर अंतर्गर्भाशयी इंजेक्शन। (4) जेक्यू1 समूह: जेक्यू1 (25 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन) 6-8 दिनों में अंतर्गर्भाशयी इंजेक्शन लगाया जाता है। चूहे के सीरम और गुर्दे के ऊतकों में सीडी सामग्री के आंकड़े तालिका एस 1 में सूचीबद्ध किए गए थे, जो सीडी-उजागर चूहे के मॉडल की सफल स्थापना को दर्शाते हैं।

8 दिनों के उपचार के बाद, चूहों को 12 घंटे के उपवास के बाद गहरी संज्ञाहरण के तहत गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था से मार दिया गया। गुर्दे के ऊतकों को विच्छेदित किया गया था और पश्चिमी धब्बा और मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) विश्लेषण के लिए प्रत्येक गुर्दे के 1 ग्राम ऊतक को जल्दी से −80 C पर संग्रहीत किया गया था। ऊतक की शेष मात्रा इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) धुंधला के लिए 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में जल्दी से तय की गई थी।

2.3. सेल संस्कृति और उपचार

रैट किडनी सेल लाइन (NRK{0}}E) शंघाई सेल बैंक ऑफ चाइना एकेडमी ऑफ साइंसेज से प्राप्त की गई थी। NRK-52E कोशिकाओं को Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM, गिब्को, 12800-017) के साथ संवर्धित किया गया जिसमें 5 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS, गिब्को, 10437-028), पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (1 00 U/mL) 5 प्रतिशत CO2 की आर्द्र स्थिति में और 37 डिग्री पर 95 प्रतिशत हवा में। CdCl2 (अल्ट्राप्योर वाटर-डिसोल्व्ड) और JQ1 (डाइमिथाइल सल्फोऑक्साइड-डिसोल्व्ड) को अलग-अलग 4 डिग्री और -20 डिग्री पर स्टोर किया गया था, और उपयोग करने से पहले वर्किंग सॉल्यूशंस में पतला किया गया था। प्रायोगिक डिजाइन इस प्रकार था: (1) कोशिकाओं को 0, 2.5, 5, 10 μM सीडी के साथ 12 घंटे, या 5 μM सीडी के लिए 0, 6, 12, 24 घंटे के लिए बाद में परखने के लिए इलाज किया गया। (2) कोशिकाओं को 5 μM सीडी और / या 0.5 μM JQ1 के साथ 12 घंटे के लिए बाद के assays के प्रदर्शन के लिए इलाज किया गया था। (3) कोशिकाओं को siBRD4 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और / या 5 μM सीडी के साथ एक और 12 घंटे के लिए इलाज किया गया ताकि बाद की assays का प्रदर्शन किया जा सके।

2.4. छोटा दखल देने वाला आरएनए संक्रमण

हमने उत्पाद नियमावली के अनुसार 24 घंटे के लिए लिपोफ़ेक्टामाइन RNAiMAX अभिकर्मक अभिकर्मक (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैट # 13778150) द्वारा NRK -52 E कोशिकाओं में 20 nM BRD4 छोटे हस्तक्षेप करने वाले RNA (siBRD4, Invitrogen, CA, USA) को ट्रांसफ़ेक्ट किया। निम्नलिखित अर्थों में siRNAs का उपयोग किया गया था:

siBRD4, 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′ के लक्ष्य अनुक्रम के साथ;

5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT के लक्ष्य अनुक्रम के साथ siCt (siRNA नकारात्मक नियंत्रण), -3′।

2.5. पश्चिमी सोख्ता

गुर्दे के ऊतक के नमूने और NRK-52E कोशिकाओं को कुल प्रोटीन निकालने के लिए प्रोटीज अवरोधक युक्त RIPA बफर में lysed किया गया था। नाभिकीय प्रोटीन को ताजे ऊतकों और कोशिकाओं से अग्रिम रूप से तैयार किया गया था और इसे -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था। प्रोटीन के नमूने (20-30 कुरूप प्रति नमूना) को एसडीएस-पेज वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया गया, फिर पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड झिल्ली (मिलिपोर, ISEQ00010) में स्थानांतरित कर दिया गया। झिल्लियों को 90 मिनट के लिए 5 प्रतिशत स्किम दूध के साथ अवरुद्ध किया गया था, और निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री पर 12 घंटे ऊष्मायन किया गया था: -एक्टिन (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000)। फिर झिल्ली को टीबीएसटी से धोया गया और कमरे के तापमान (आरटी) पर 90 मिनट के लिए इसी माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 10000) के साथ ऊष्मायन किया गया। झिल्लियों को इलेक्ट्रोकेमिलिनेसेंस (ईसीएल, थर्मोफिशर साइंटिफिक) के साथ जोड़ा गया था और केमिडॉक एक्सआरएस (बायो-रेड, मार्नेस-ला कोक्वेट, फ्रांस) पर निर्धारित किया गया था, और इमेजजे (एनआईएच, बेथेस्डा, एमडी, यूएसए) का उपयोग करके ऑप्टिकल घनत्व का विश्लेषण किया गया था।

2.6. इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला हो जाना

NRK{0}}E कोशिकाओं को एक 24-कुओं की प्लेट में रखा गया था, जो लगभग 60 प्रतिशत संगम तक उगाए गए थे। कोशिकाओं को 12 घंटे के लिए 5 μM सीडी और / या 0.5 μM JQ1 के साथ इलाज किया गया, फिर पीएफए ​​​​(4 प्रतिशत, 10 मिनट) के साथ तय किया गया, ट्राइटन एक्स - 100 (0.1 प्रतिशत, 15 मिनट) के साथ पारगम्य, बीएसए के साथ अवरुद्ध (2 प्रतिशत, 90 मिनट) आरटी पर, और प्राथमिक एंटीबॉडी (एनएफ-κबी पी65, 1:50 कमजोर पड़ने) के साथ रातोंरात 4 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया। तीन बार पीबीएस से धोए जाने के बाद, कोशिकाओं को 90 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500 कमजोर पड़ने) के साथ ऊष्मायन किया गया था, और आरटी पर 5 मिनट के लिए डीएपीआई के साथ, फिर कोशिकाओं को एक मुखर माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था। तीन स्वतंत्र अध्ययनों में NF-κB परमाणु अनुवाद का विश्लेषण किया गया था।

2.7. क्यूपीसीआर

गुर्दे के ऊतकों और NRK-52E कोशिकाओं के कुल RNA को RNAiso Plus किट (Takara Bio, Shiga, Japan) से निकाला गया। निर्माता के मैनुअल (रोश, बेसल, स्विटजरलैंड) के अनुसार पहली श्रृंखला सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए कुल आरएनए का 1 कुरूप इस्तेमाल किया गया था। लाइटसाइक्लर® 96 रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम (रोच) का उपयोग करके सापेक्ष एमआरएनए स्तरों का पता लगाने के लिए प्रति कुएं में 2 μL पूरक डीएनए (सीडीएनए) लिया गया। समीकरण 2-△△CT के अनुसार सापेक्ष mRNA स्तर की गणना करें। प्राइमरों को तालिका S2 में सूचीबद्ध किया गया था। -एक्टिन एक चूहा संदर्भ जीन था।

2.8. सह-इम्युनोप्रेरीगेशन (सह-आईपी)

गुर्दे के ऊतकों और NRK-52E कोशिकाओं को ताजा-तैयार सेल लिसीज़ बफर (20 मिमी HEPES-KOH pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1 प्रतिशत ट्राइटन X{{8}) में lysed किया गया था। }) PMSF युक्त। प्रोटीन जी बीड्स (100 μL प्रति नमूना, बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) को 2 कुरूप BRD4, RelA-K310ac, या IgG एंटीबॉडी प्रति नमूना के साथ मिलाया गया, और RT पर 10 मिनट के लिए घुमाया गया। फिर, कुल प्रोटीन lysates मोतियों-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स के साथ रातोंरात 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया। तीन बार सेल लसीका बफर से धोए जाने के बाद, नमूनों को कॉन्फ़िगर करने के लिए इम्युनोप्रेसीपिट्स को 1 × एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर के साथ फिर से जोड़ा गया। एंटी-बीआरडी 4 ​​और एंटी-रिला K310ac प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाया गया था।

2.9. सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त किए गए थे और माध्य ± SEM के रूप में व्यक्त किए गए थे जब तक कि अन्यथा उल्लेख न किया गया हो। प्रायोगिक समूहों की तुलना एसपीएसएस 22.0 (एसपीएसएस इंक, शिकागो, आईएल, यूएसए) का उपयोग करके अयुग्मित दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट या विचरण (एनोवा) के एकतरफा विश्लेषण द्वारा की गई थी। महत्व p < 0.05="" पर="" निर्धारित="" किया="" गया="">

3। परिणाम

3.1. सीडी विवो और इन विट्रो में भड़काऊ साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है

एक पर्यावरण प्रदूषक के रूप में, सीडी जैविक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला को विनियमित करके गुर्दे की क्षति का कारण साबित हुई है (वांग एट अल।, 2019सी)। इस अध्ययन में, सीडी-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिसिटी में सूजन शामिल है या नहीं, इसकी जांच के लिए सीडी एक्सपोजर के बाद भड़काऊ साइटोकिन्स के प्रतिलेखन स्तर में परिवर्तन की जांच की गई। डेटा से पता चला है कि सीडी एक्सपोजर ने इंटरल्यूकिन (आईएल) -1 और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ) - एनआरके में प्रोटीन स्तर -52 ई कोशिकाओं (छवि 1 ए-बी) और चूहे के गुर्दे के ऊतकों (छवि 1 सी) में काफी वृद्धि की है। -डी)। इस बीच, जैसा कि चित्र 1ई-एफ में दिखाया गया है, सीडी एक्सपोजर ने भड़काऊ साइटोकिन्स (आईएल -1, आईएल -6, टीएनएफ-, और (मोनोसाइट केमोअट्रेक्टेंट प्रोटीन -1) एमसीपी के ट्रांसक्रिप्शनल स्तर को बढ़ाया। -1) विवो और इन विट्रो में। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि सीडी चूहे के गुर्दे में भड़काऊ साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति को प्रेरित करती है।

3.2. BRD4 भड़काऊ साइटोकिन्स की सीडी-प्रेरित प्रतिलेखन प्रक्रिया में भाग लेता है

BRD4 एक नया वर्णित एपिजेनेटिक नियामक है जो कई बीमारियों में सूजन प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए एसिटिलेटेड हिस्टोन या गैर-हिस्टोन से बांधता है। यहाँ, BRD4 अवरोधक JQ1 और BRD 4-siRNA का उपयोग Cd-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया पर BRD4 की भूमिका की जांच करने के लिए किया गया था। डेटा से पता चला है कि सीडी-एलिवेटेड आईएल -1 और टीएनएफ-प्रोटीन के स्तर को विवो में जेक्यू1 उपचार और इन विट्रो (छवि 2ए-डी) और बीआरडी4 इन विट्रो (छवि। एस1ए-बी) में नीचे-विनियमित किया गया था। इस बीच, JQ1 उपचार ने NRK-52E कोशिकाओं (छवि 2E) में IL-1, IL-6, TNF- और MCP-1 के सीडी-संवर्धित प्रतिलेखन स्तर को महत्वपूर्ण रूप से बाधित कर दिया। और चूहे के गुर्दे के ऊतक (चित्र। 2F)। इसके अलावा, BRD4 नॉकडाउन ने NRK -52 E कोशिकाओं (चित्र। S1C) में भड़काऊ साइटोकिन्स के सीडी-वृद्धि वाले प्रतिलेखन स्तर को काफी कम कर दिया। सामूहिक रूप से, इन निष्कर्षों से पता चलता है कि बीआरडी 4 ​​चूहे के गुर्दे में सीडी-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण नियामक है।

3.3. Cd एक्सपोजर के बाद BRD4 अभिव्यक्ति का स्तर अपरिवर्तित रहता है

अगला, सीडी एक्सपोजर के बाद बीआरडी 4 ​​के अभिव्यक्ति स्तरों में परिवर्तन का पता चला। NRK-52ई कोशिकाओं को एक सांद्रता प्रवणता के तहत सीडी के साथ इलाज किया गया था, और चूहों को विवो और इन विट्रो में गुर्दे में बीआरडी 4 ​​अभिव्यक्ति पर सीडी के प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए 5 दिनों के लिए सीडी के साथ अंतःक्षिप्त किया गया था। परिणामों से पता चला कि सीडी-उजागर एनआरके -52 ई कोशिकाओं (छवि 3 ए-बी) और चूहे के गुर्दे के ऊतकों (छवि 3 सी-डी) दोनों में बीआरडी 4 ​​प्रोटीन का स्तर अपरिवर्तित था। इसके अलावा, सीडी एक्सपोजर (छवि 3 ई-एफ) के बाद बीआरडी 4 ​​एमआरएनए स्तर अनलेडेड थे। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि BRD4 सीडी-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया की मध्यस्थता करता है जो अभिव्यक्ति के स्तर में बदलाव पर निर्भर नहीं करता है।

3.4. BRD4 सीडी-प्रमोटेड NF-κB न्यूक्लियर ट्रांसलोकेशन को नियंत्रित करता है

हमारे अध्ययन में सीडी-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया में बीआरडी 4 ​​की भूमिकाओं का पता लगाया गया था। NF-κB सिग्नलिंग पाथवे परिवर्तन भड़काऊ साइटोकिन्स (ची एट अल।, 2021) के प्रतिलेखन से निकटता से संबंधित है। हमारे अध्ययन में पाया गया कि BRD4 सीडी-विनियमित परमाणु अनुवाद और NF-κB के सक्रियण में शामिल है। सबसे पहले, NF-κB का उप-स्थानीयकरण IF धुंधला और IHC धुंधला द्वारा निर्धारित किया गया था। अंजीर में डेटा। 4A और D ने दिखाया कि JQ1 NRK -52 E कोशिकाओं और चूहे के गुर्दे के ऊतकों में Cd- प्रचारित NF-κB परमाणु अनुवाद को रोकता है। इस बीच, पश्चिमी धब्बा परिणामों से पता चला है कि JQ1 ने विवो (छवि 4B-C) और इन विट्रो (छवि 4E-F) में NF-κB के Cd-बढ़े हुए परमाणु प्रोटीन स्तर को काफी कम कर दिया है। इसी तरह, BRD4 नॉकडाउन ने भी Cd-प्रमोटेड NF-κB न्यूक्लियर ट्रांसलोकेशन (Fig। S2A) को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया और NRK -52 E सेल्स में NF-κB (Fig। S2B-C) के Cd-बढ़े हुए न्यूक्लियर प्रोटीन स्तर को कम किया। एक साथ लिया गया, BRD4 का निषेध Cd- प्रचारित NF-κB परमाणु अनुवाद को कम कर सकता है, यह सुझाव देता है कि BRD4 Cd जोखिम के बाद गुर्दे में NF-κB सिग्नलिंग मार्ग की सक्रियता की मध्यस्थता करता है।

3.5. सीडी रिले K310 एसिटिलीकरण स्तर बढ़ाता है

अध्ययनों ने पुष्टि की है कि BRD4 NF-κB-निर्भर ट्रांसक्रिप्शन (Morgado-Pascual et al।, 2019; Zhong et al।, 2018) को विनियमित करने के लिए अपने ब्रोमीन डोमेन के माध्यम से एसिटिलेटेड RelA K310 को बांधता है। इस प्रकार, RelA K310 के एसिटिलीकरण स्तर और दो एंजाइमों की अभिव्यक्ति का पता चला। डेटा से पता चला कि RelA-K310ac और acetylase Ep300 प्रोटीन का स्तर Cd की बढ़ी हुई सांद्रता के साथ लगातार कम होता गया, जबकि deacetylase Sirt1 प्रोटीन का स्तर धीरे-धीरे NRK -52 E कोशिकाओं (चित्र 5A-B) और चूहे के गुर्दे के ऊतकों (अंजीर) में बढ़ गया। 5सी-डी)। इसके अलावा, Ep300 और Sirt1 mRNA स्तर ने समान रुझान दिखाया (चित्र 5E-F)। ये परिणाम बताते हैं कि सीडी रिले K310 के एसिटिलीकरण स्तर को बढ़ावा देता है, इस प्रकार बीआरडी 4 ​​गुर्दे में सीडी-ट्रिगर भड़काऊ साइटोकिन्स प्रतिलेखन में शामिल हो सकता है।

3.6. Cd अपने ट्रांसक्रिप्शनल फंक्शन को बढ़ाने के लिए BRD4 बाइंडिंग को RelA-K310ac से बढ़ाता है

एसिटिलिकेशन साइटों से जुड़ना BRD4 (हुआंग एट अल।, 2009) के ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन का आधार है। यह सत्यापित करने के लिए कि क्या Cd, BRD4 फ़ंक्शन को RelA-K310ac से बढ़ाकर BRD4 फ़ंक्शन को नियंत्रित करता है, Co-IP के माध्यम से RelA-K310ac और BRD4 के बीच परस्पर क्रिया का पता लगाया गया। अंजीर। 6A में डेटा से पता चला है कि Cd ने NRK -52 E कोशिकाओं में RelA-K310ac और BRD4 के बीच बातचीत को काफी बढ़ाया है, जिसे JQ1 उपचार या BRD4 नॉकडाउन द्वारा कम किया गया था। साथ ही, चूहे के गुर्दे के ऊतकों में भी यही प्रवृत्ति देखी गई (चित्र 6B)। ये परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि Cd BRD4 के बंधन को RelA-K310ac तक बढ़ाता है, जो NF-κB-निर्भर प्रतिलेखन को बढ़ावा देता है और बाद में Cd-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया में योगदान देता है।

4। चर्चा

सीडी को इसकी उच्च विषाक्तता के कारण सूजन के संभावित ट्रिगर के रूप में सूचित किया गया है, जबकि सटीक तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझा नहीं गया है (अरब-नोजारी एट अल।, 2020; घोष, 2018)। हमारे अध्ययन ने पुष्टि की कि सीडी चूहे के गुर्दे की कोशिकाओं में भड़काऊ साइटोकिन्स अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, और पाया कि बीआरडी 4, एक एपिजेनेटिक लक्ष्य जिसमें सूजन सहित सेलुलर प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला में महत्वपूर्ण कार्य हैं, सीडी-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया में योगदान देता है। आगे के प्रयोगों ने संकेत दिया कि BRD4 सीडी-प्रमोटेड NF-κB सिग्नलिंग पाथवे सक्रियण में शामिल है। इसके अलावा, Cd ने RelA K310 के एसिटिलीकरण स्तर को बढ़ाया, जिससे NF-κB-निर्भर इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ावा देने के लिए एसिटिलेटेड NF-κB RelA के लिए BRD4 बाइंडिंग बढ़ गई।

सूजन बहिर्जात रसायनों के खिलाफ प्राकृतिक रक्षा तंत्रों में से एक है, जबकि अनियंत्रित और अनुचित भड़काऊ प्रतिक्रिया सामान्य ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकती है और ऑटोइम्यून बीमारियों को प्रेरित कर सकती है (जियान एट अल।, 2018)। सूजन के सीडी-बढ़े हुए जैविक मार्कर अक्सर विभिन्न बीमारियों से जुड़े होते थे। अध्ययनों से पता चला है कि सीडी-प्रेरित सूजन एथेरोजेनेसिस (टिंकोव एट अल।, 2018) में शामिल है। इसके अलावा, सीडी ने भड़काऊ साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति को बढ़ावा दिया, जिसने फेफड़े और वृषण ऊतक क्षति में योगदान दिया और हेपेटोटॉक्सिसिटी (कोप्सामी नायडू एट अल।, 2019; अराफा एट अल।, 2014) को प्रेरित किया। ये हानिकारक प्रभाव हमारे परिणामों के अनुरूप हैं, कि सीडी-प्रेरित गुर्दे की चोट में भड़काऊ प्रतिक्रिया शामिल है। बढ़ते शोधों ने सीडी-प्रेरित सूजन की घटना तंत्र पर ध्यान केंद्रित किया है। एक अच्छी तरह से अध्ययन किए गए बीटा प्रोटीन परिवार के सदस्य के रूप में, BRD4 सूजन सहित कई जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यहाँ, JQ1 (BRD4 का एक अवरोधक) और siRNA का उपयोग BRD4 की कार्यात्मक गतिविधि को निष्क्रिय करने के लिए किया गया और पाया गया कि BRD4 के निषेध ने चूहे के गुर्दे में भड़काऊ साइटोकिन्स के सीडी-प्रेरित प्रतिलेखन को कम कर दिया, यह सुझाव देते हुए कि BRD4 सीडी-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया में भाग लेता है। . आमतौर पर यह माना जाता है कि भड़काऊ प्रतिक्रिया की घटना में BRD4 अभिव्यक्ति की विकृति एक महत्वपूर्ण घटना है। रीढ़ की हड्डी की चोट, पैथोलॉजिकल कार्डियक हाइपरट्रॉफी और सूजन से जुड़ी अन्य बीमारियों में, अव्यवस्थित BRD4 अभिव्यक्ति ने भड़काऊ साइटोकिन्स (झू एट अल।, 2020; मराज़ी एट अल।, 2018; रेन एट अल।, 2019) की अभिव्यक्ति में योगदान दिया। हालाँकि, वर्तमान प्रायोगिक स्थितियों के तहत BRD4 के अभिव्यक्ति स्तरों पर Cd का कोई प्रभाव नहीं था, जिसके कारण हमें यह विचार करना पड़ा कि क्या BRD4 अन्य मार्गों के माध्यम से Cd-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया की मध्यस्थता करता है।

NF-κB भड़काऊ प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण नियामक कारक है और कई भड़काऊ मध्यस्थों (लॉरेंस, 2009) की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए जिम्मेदार है। अध्ययनों में बताया गया है कि BRD4 NF-κB सिग्नलिंग मार्ग के नियमन में शामिल है। हुआंग एट अल। (2017) ने सुझाव दिया कि BRD4 ने P38 और JNK-MAPK मार्गों के माध्यम से IKK की मध्यस्थता वाले NF-activationB सक्रियण को विनियमित किया। वांग एट अल। (2019a) ने पाया कि BRD4 नॉकडाउन या JQ1 उपचार ने माइक्रोग्लिया में लिपोपॉलेसेकेराइड (LPS) -सक्रिय NF-κB सिग्नलिंग मार्ग को अवरुद्ध कर दिया। मेंग एट अल। (2014) ने प्रदर्शित किया कि JQ1 उपचार ने LPS-उपचारित RAW 264.7 कोशिकाओं में NF-κB की सक्रियता को रोककर भड़काऊ साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति को अवरुद्ध कर दिया। इन रिपोर्टों ने संकेत दिया कि BRD4 कई सूजन मॉडल में NF-κB की सक्रियता की मध्यस्थता करता है जबकि BRD4 को रोकना सूजन-रोधी के लिए एक प्रभावी चिकित्सीय दृष्टिकोण है। वर्तमान अध्ययन में, BRD4 के निषेध ने Cd-उजागर चूहे के गुर्दे के ऊतकों और NRK -52 E कोशिकाओं में NF-κB के परमाणु अनुवाद को अवरुद्ध कर दिया, यह सुझाव देते हुए कि BRD4 Cd-सक्रिय NF-κB सिग्नलिंग मार्ग की मध्यस्थता करता है।

आमतौर पर, NF-κB को विभिन्न उत्तेजनाओं द्वारा सक्रिय करने और नाभिक में स्थानांतरित होने के बाद, BRD4 K310 साइट पर एसिटिलेटेड NF-κB RelA से जुड़ जाता है, जो नाभिक में इसकी स्थिरता और ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को बढ़ाता है (हजमिर्जा एट अल।, 2018)। इस प्रकार RelA K310 का एसिटिलीकरण स्तर भड़काऊ प्रतिक्रिया पर BRD4 के नियामक कार्य को प्रभावित करता है। हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में, deacetylase Sirt1 ने BACE1 अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए RelA K310 डीसेटाइलेशन की मध्यस्थता की, जिसने न्यूरोनल अमाइलॉइड (फ्लोरेस-लियोन एट अल।, 2019) के उत्पादन में योगदान दिया। ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं में, फोटोडायनामिक थेरेपी ने डीएसेटाइलेज़ Sirt1 को नियंत्रित किया और एसिटाइलस एपी 300 को सक्रिय किया, जिससे रिले-के 310 एसी के स्तर में वृद्धि हुई और प्रो-सर्वाइवल नाइट्रिक ऑक्साइड (फाहे एट अल।, 2019) का उत्पादन बढ़ा। हमारे अध्ययन में पाया गया कि Cd, Ep300 की अभिव्यक्ति को बढ़ाकर और Sirt1 अभिव्यक्ति को कम करके RelA K310 के एसिटिलीकरण स्तर को बढ़ावा देता है, यह दर्शाता है कि Cd, RelA K310 के एसिटिलीकरण स्तर को बढ़ाकर नियामक कार्य BRD4 को प्रभावित करता है।

विशेष रूप से, हमारे परिणामों से पता चला है कि सीडी-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया को कम करने में JQ1 उपचार BRD4 नॉकडाउन की तुलना में अधिक प्रभावी था। JQ1 का BRD4 के साथ एक उच्च बंधन संबंध है और यह गुणसूत्र के लिए BRD4 बाइंडिंग को लगभग पूरी तरह से अवरुद्ध कर सकता है, जबकि siBRD4 केवल BRD4 प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ हस्तक्षेप कर सकता है ताकि लक्ष्य साइट पर BRD4 बाइंडिंग को कम किया जा सके, यह सुझाव देते हुए कि BRD4 मध्यस्थता Cd- ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया पर निर्भर हो सकता है। एसिटिलेटेड NF-κB RelA के साथ बाइंडिंग। हाल के अध्ययनों ने एक समान नियामक तंत्र दिखाया है: NF-κB परमाणु अनुवाद और सक्रियण के बाद, BRD4 ने NF-κB (हुआंग एट अल।, 2009) के ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण को सक्रिय करने के लिए एसिटिलेटेड रिले के साथ बातचीत की। RelA-BRD4 को विभिन्न भड़काऊ उत्तेजना स्थितियों में NF-κB लक्ष्य प्रमोटरों के लिए भर्ती किया गया था, जबकि JQ1 उपचार ने BRD4 को एसिटिलेटेड NF-κB RelA के लिए बाध्य करके काम किया, इस प्रकार NF-κB (Zou et al।, 2014) की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को कम किया। हमारे परिणामों से पता चला है कि BRD4 का निषेध चूहे के गुर्दे में BRD4 और RelA-K310ac के बीच Cd-संवर्धित अंतःक्रिया को रोकता है, हमारे उपरोक्त परिणामों का समर्थन करता है जो BRD4 को रोकते हैं, NF-κB की Cd- प्रेरित ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को दबाते हैं, यह दर्शाता है कि Cd BRD4 बाइंडिंग को एसिटिलेटेड में बढ़ाता है। NF-κB RelA भड़काऊ साइटोकिन्स के प्रतिलेखन को बढ़ाने के लिए।

सारांश में, हमारे अध्ययन ने चूहे के गुर्दे में सीडी-ट्रिगर भड़काऊ प्रतिक्रिया में बीआरडी 4 ​​के नियामक तंत्र का खुलासा किया: (1) बीआरडी 4 ​​सीडी-प्रेरित एनएफ-κB परमाणु अनुवाद और सक्रियण की मध्यस्थता करता है। (2) सीडी रिले K310 एसिटिलेशन स्तर को बढ़ाता है और एसिटिलेटेड NF-κB RelA के लिए BRD4 बाइंडिंग को बढ़ाता है, जो NF-κB-निर्भर इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, BRD4 के निषेध ने Cd- उन्नत भड़काऊ साइटोकिन स्तरों को काफी कम कर दिया, यह सुझाव देते हुए कि लक्षित BRD4 में Cd- प्रेरित नेफ्रैटिस सहित भड़काऊ रोगों के इलाज के एक प्रभावी साधन के रूप में विकसित होने की क्षमता है।

क्रेडिट ऑथरशिप कंट्रीब्यूशन स्टेटमेंट

झोंगगुओ गोंग: अवधारणा, कार्यप्रणाली, विज़ुअलाइज़ेशन, औपचारिक विश्लेषण, सत्यापन, जांच, औपचारिक विश्लेषण, डेटा क्यूरेशन, लेखन - मूल मसौदा। गैंग लियू: अवधारणा, कार्यप्रणाली, विज़ुअलाइज़ेशन, डेटा क्यूरेशन, लेखन - मूल मसौदा, परियोजना प्रशासन, वित्त पोषण अधिग्रहण। वेनजिंग लियू: सॉफ्टवेयर, संसाधन, कार्यप्रणाली, औपचारिक विश्लेषण। हुई ज़ू: परियोजना प्रशासन, पर्यवेक्षण। रुइलोंग सॉन्ग: सॉफ्टवेयर, औपचारिक विश्लेषण, पर्यवेक्षण। होंगयान झाओ: सॉफ्टवेयर, औपचारिक विश्लेषण, पर्यवेक्षण। यान युआन: पर्यवेक्षण। जियानहोंग गु: पर्यवेक्षण। जियानचुन बियान: फंडिंग अधिग्रहण, पर्यवेक्षण। जियाकियाओ झू: लेखन - समीक्षा और संपादन, पर्यवेक्षण। ज़ोंगपिंग लियू: लेखन - समीक्षा और संपादन, पर्यवेक्षण,

परियोजना प्रशासन, वित्त पोषण अधिग्रहण, संकल्पनाकरण।

प्रतिस्पर्धी हित की घोषणा

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई ज्ञात प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या व्यक्तिगत संबंध नहीं हैं जो इस पेपर में रिपोर्ट किए गए कार्य को प्रभावित करने के लिए प्रकट हो सकते हैं।

स्वीकृति

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या 31872533, 31902329, 32072933), चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (नंबर 2016वाईएफडी050128), और जिआंगसू उच्च शिक्षा के प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम विकास की परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था। संस्थान (पीएडीपी)। ELIXIGEN में एक या अधिक उच्च योग्य देशी अंग्रेजी बोलने वाले संपादकों द्वारा पांडुलिपि को उचित अंग्रेजी भाषा, व्याकरण, विराम चिह्न, वर्तनी और समग्र शैली के लिए संपादित किया गया था।

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