एक उपन्यास सह-संस्कृति मॉडल द्वारा अध्ययन किए गए मानव गुर्दे की कोशिकाओं पर नेफ्रोटॉक्सिन ओक्रैटॉक्सिन ए का प्रभाव फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति से प्रभावित होता है

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सार:गुर्दाबहुत सारे संभावित जहरीले पदार्थों से खतरा है। नेफ्रोटॉक्सिन ओक्रैटॉक्सिन ए (ओटीए) के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए हमने मानव से मिलकर एक सेल सह-संस्कृति मॉडल की स्थापना की।गुर्दे समीपस्थ नलिका कोशिकाएं और फाइब्रोब्लास्ट। हमने कोशिका के अस्तित्व पर ओटीए के प्रभाव, कोशिका मृत्यु से संबंधित जीन और/या प्रोटीन की अभिव्यक्ति, बाह्य मैट्रिक्स और ऊर्जा होमोस्टैसिस का अध्ययन किया। ओटीए प्रेरित परिगलन दोनों प्रकार की कोशिकाओं में संबंधित अन्य प्रकार की कोशिकाओं की उपस्थिति में बढ़ाया गया था, जबकि ओटीए-प्रेरित एपोप्टोसिस स्वतंत्र था। फ़ाइब्रोब्लास्ट में, लेकिन ट्यूबल कोशिकाओं में नहीं, कोशिका-चक्र से संबंधित प्रोटीन p21 की अभिव्यक्ति के संबंध में एक सह-संस्कृति प्रभाव दिखाई दे रहा था। एपिथेलियल-टू मेसेनकाइमल संक्रमण-संकेत प्रोटीन विमिन की अभिव्यक्ति संस्कृति-स्थिति से स्वतंत्र थी। OTA- प्रेरित lncRNA WISP1-AS1 की अभिव्यक्ति को सह-संस्कृति में बढ़ाया गया था। ओटीए एक्सपोजर ने ग्लूकोज-जुटाने वाले प्रभाव और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की कम अभिव्यक्ति के साथ ऊर्जा चयापचय से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन किया। साथ में हम प्रदर्शित करते हैं कि कोशिकाओं की प्रतिक्रिया कोशिकाओं की उपस्थिति में भिन्न हो सकती है जो स्वाभाविक रूप से निकट होती हैं, इस प्रकार एक सेलुलर क्रॉस-टॉक को सक्षम करती हैं। इसलिए, किसी पदार्थ की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए, मोनो-संस्कृतियों के बजाय सह-संस्कृतियों के उपयोग पर विचार करना एक लाभ होगा।

कीवर्ड:ओक्रैटॉक्सिन ए; कोश पालन; ऊर्जा उपापचय; एपोप्टोसिस-नेक्रोसिस संतुलन; माइटोकॉन्ड्रिया; गुर्दा; गुर्दे

सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे की खराबी में सुधार होगा

परिचय

अपने उत्सर्जी कार्य के कारण,गुर्दाविभिन्न प्रकार के हानिकारक उप-पदों से खतरा है जैसे कि ड्रग्स या खाद्य संदूषक, जैसे मायकोटॉक्सिन जो तीव्र या इससे भी बदतर-क्रोनिक की ओर ले जाते हैंगुर्दा रोगलगभग 10 प्रतिशत [1,2] की व्यापकता के साथ। नेफ्रोटॉक्सिक क्रिया के तंत्र को समझने के लिए इन हानिकारक परिदृश्यों को कम करने के लिए रणनीतियों को खोजने में मदद मिलती है और इस सवाल को हल करने के लिए कई अध्ययन किए गए हैं कि क्यों और कैसेगुर्देखतरे में हैं [3-5]। किसी जीव पर किसी पदार्थ के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, नैतिक चिंताओं और संगठनात्मक, महंगी और विस्तृत पूर्वापेक्षाओं के कारण पूरे जानवरों का उपयोग करना अक्सर मुश्किल होता है। इसके अलावा, मानवीय स्थिति में ज्ञान का हस्तांतरण अनिश्चितताओं से जुड़ा है। इसलिए, सेल कल्चर मॉडल स्थापित किए गए हैं और व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, और इसका लाभ यह है कि एक विशिष्ट सेल प्रकार और किसी पदार्थ या उपचार के प्रति उसकी प्रतिक्रिया का नियंत्रित परिस्थितियों में अध्ययन किया जा सकता है। यद्यपि इस दृष्टिकोण का उपयोग करके कई और महत्वपूर्ण निष्कर्ष निकाले गए हैं, कुछ नुकसान अंतर्निहित हैं: एक सेल लाइन की कोशिकाओं को अक्सर उत्परिवर्तन या अन्य-कभी-कभी कठोर-विधियों द्वारा अमर कर दिया गया है [6]। यह आसान संचालन और लंबे समय तक उपयोग की अनुमति देता है लेकिन खतरे के साथ जो एक विशिष्ट मॉडल प्रणाली में पाए जाने वाले परिणाम पूरे अंग या जीव की स्थिति में स्थानांतरित नहीं हो सकते हैं। इस कमी को दूर करने के लिए, अमर सेल लाइनों के बजाय, प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन प्राथमिक कोशिकाओं की पीढ़ी अक्सर बहुत कठिन होती है और इसके लिए उन्नत तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, प्राथमिक कोशिकाएं अक्सर लंबे समय तक जीवित नहीं रहती हैं और उन्हें विशेष व्यक्तिगत संस्कृति स्थितियों की आवश्यकता होती है। लेकिन प्राथमिक कोशिकाएं प्राकृतिक परिस्थितियों के करीब एक कदम हैं और कम से कम कभी-कभी यह पता चला है कि वे अधिक संवेदनशील हैं, उदाहरण के लिए, सेल लाइनों के रूप में विषाक्त उत्तेजनाएं [7] हैं, जिसका अर्थ है कि सेल लाइनें अधिक मजबूत हो सकती हैं। एक और नुकसान यह है कि कोशिकाओं को अक्सर मोनोकल्चर में रखा जाता है, अर्थात, अन्य प्रकार की कोशिकाओं के प्रभाव के बिना, जो उनके घर के अंग में आमतौर पर पास में होते हैं। इसलिए, यह उन कोशिकाओं की उपस्थिति में किसी पदार्थ या उपचार के लिए एक कोशिका प्रकार की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक अधिक यथार्थवादी स्थिति की ओर एक कदम हो सकता है, जो मूल अंग में निकटता में हैं।

मेंगुर्दा, समीपस्थ नलिका कोशिकाएं फाइब्रोब्लास्ट से घिरी होती हैं और एक-शायद पारस्परिक-प्रभाव ग्रहण किया जा सकता है। में भी यही हाल हैकिडनी खराबपरिदृश्य जो ज्यादातर मामलों में ट्यूबलो-इंटरस्टिशियल सूजन और फाइब्रोसिस [8,9] की ओर ले जाते हैं, और गिरावट के लिए निर्णायक होते हैंगुर्दासमारोह। उनके परिवहन और एंजाइमी क्षमताओं के कारण,गुर्देसमीपस्थ नलिका कोशिकाएं विभिन्न प्रकार के संभावित विषाक्त पदार्थों जैसे, जैसे, ड्रग्स या उनके अवशेष या मायकोटॉक्सिन से खतरे में हैं। आसपास के फाइब्रोब्लास्ट की एक भूमिका कोलेजन और अन्य मैट्रिक्स घटकों की रिहाई के द्वारा बाह्य मैट्रिक्स को प्रस्तुत करना है और इसलिए ऊतक की अखंडता में भाग लेना है [10]। लेकिन वे भी-उपकला कोशिकाओं के साथ-साथ सूजन प्रक्रियाओं में या फाइब्रोटिक में शामिल होते हैंगुर्दा रोग[11] विकसित होने के जोखिम के साथवृक्कीय विफलता। 

मानव स्वास्थ्य के लिए प्रासंगिकता के साथ एक गहन अध्ययन किया गया माइकोटॉक्सिन ओक्रैटॉक्सिन ए (ओटीए) [12,13] है। यह विभिन्न प्रकार के खाद्य पदार्थों में पाया जा सकता है [12,14] और इसके संपर्क और अवशोषण से बचना लगभग असंभव है [9,15]। यह अवलोकन की ओर जाता है कि मानव रक्त में कम नैनोमोलर सांद्रता [16] में ओटीए का अक्सर पता लगाया जाता है। उजागर जानवरों में, ओटीए की ओर जाता हैकिडनी खराबऔर फाइब्रोटिक परिवर्तन [17,18]। ओटीए एक्सपोजर को मानव में शामिल माना जाता हैगुर्दा रोग[19]। मानव प्राथमिक समीपस्थ नलिका कोशिकाओं में, ओटीए का एक विषैला प्रभाव दिखाया गया है, जो मानव प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट में भी देखा जा सकता है, हालांकि यह समीपस्थ नलिका कोशिकाओं [7] की तरह प्रमुख नहीं है। ओटीए की विषाक्त क्रिया के पीछे के तंत्र को अभी भी पूरी तरह से समझा नहीं गया है और कई चल रहे अध्ययनों के अधीन हैं। विभिन्न कार्यों के साथ पड़ोसी कोशिकाएं कितनी दूर तक हस्तक्षेप करती हैं और इस तरह सेल फ़ंक्शन को संशोधित करती हैं, यह लगभग ज्ञात नहीं है, लेकिन उम्मीद की जा सकती है। पिछले अध्ययन में चूहे से युक्त सह-संस्कृति मॉडल का उपयोग किया गया थागुर्दासमीपस्थ नलिका और फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाएं, यह पता चला है कि दोनों प्रकार की कोशिकाओं के बीच एक प्रकार का क्रॉसस्टॉक होता है, जिससे अवलोकन होता है कि उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण (EMT) के रूप में OTA का प्रभाव केवल सह-संस्कृति स्थितियों के तहत होता है [20]। उस अध्ययन और अन्य से एक और निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि चूहे की कोशिकाएं मानव समीपस्थ नलिका कोशिकाओं [7,20] की तुलना में ओटीए के प्रति सहिष्णुता के संबंध में अधिक मजबूत होती हैं और इसलिए मानव स्थिति का बारीकी से मूल्यांकन करने के लिए मानव कोशिकाओं पर आधारित एक मॉडल प्रणाली की आवश्यकता होती है। ओटीए जोखिम का जोखिम।

इसलिए, वर्तमान अध्ययन में, हम सेल अस्तित्व (एपोप्टोसिस) पर ओटीए के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए मानव समीपस्थ नलिका कोशिकाओं (HK2 कोशिकाओं) और मानव फाइब्रोब्लास्ट्स (CCD -1092 SK कोशिकाओं) से मिलकर एक उन्नत सेल सह-संस्कृति मॉडल स्थापित करते हैं। , परिगलन) और कोशिका चक्र, कोशिका मृत्यु, बाह्य मैट्रिक्स और चयापचय से संबंधित कुछ अनुकरणीय रूप से चुने गए जीनों की अभिव्यक्ति। चूहे की कोशिकाओं का उपयोग करते हुए पिछले अध्ययनों के समान [20], मानव समीपस्थ नलिका कोशिकाओं को फिल्टर उपकरणों पर रखा गया था और फिल्टर को पेट्री डिश के तल पर वरीयता प्राप्त फाइब्रोब्लास्ट की एक परत के ऊपर रखा गया था ताकि उपकला कोशिकाओं के आधारभूत पक्ष का सामना करना पड़े। फाइब्रोब्लास्ट, दोनों प्रकार की कोशिकाओं के बीच एक तरह की बातचीत को सक्षम करते हैं।

परिणाम

प्रोटीन, लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज रिलीज और कैस्पेज़-3 गतिविधिसंस्कृति की स्थितियों के संभावित प्रभावों के साथ-साथ ओटीए-प्रेरित परिवर्तनों पर प्रभावों के बारे में पहली छाप प्राप्त करने के लिए, हमने सह में विकसित कोशिकाओं की गतिविधि के साथ मोनोकल्चर में विकसित कोशिकाओं के एपोप्टोसिस के लिए एक उपाय के रूप में कस्पासे -3 गतिविधि की तुलना की। -संस्कृति दो बिंदुओं के लिए 100 एनएम ओटीए के साथ या बिना इनक्यूबेट किया गया, 24 और 48 घंटे। इसके अलावा, परिगलन के लिए एक उपाय के रूप में लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) रिलीज को सेल की स्थिति पर समग्र प्रभाव देने के लिए प्रोटीन सामग्री के साथ-साथ निर्धारित किया गया था। इसलिए, समान मात्रा में कोशिकाओं को या तो वेल बॉटम (फिफिब्रोब्लास्ट्स) में या एक फिल्टर (समीपस्थ नलिका कोशिकाओं) पर रखा गया था। संगम पर पहुंचने के बाद, फिल्टर को कुओं में रखा गया था जिसमें फाइब्रोब्लास्ट स्थित थे (चित्रमय सार देखें)। जैसा कि चित्र 1क में दिखाया गया है, 24 या 48 घंटे के बाद दोनों प्रकार की कोशिकाओं में प्रोटीन सामग्री पर लगभग कोई संस्कृति-स्थिति पर निर्भर प्रभाव नहीं देखा जा सकता है (पूरक फ़ाइल S1 भी देखें)। फाइब्रोब्लास्ट्स में, ओटीए एक्सपोजर से प्रोटीन सामग्री में थोड़ी वृद्धि हुई, जबकि ट्यूबल कोशिकाओं में ओटीए ने प्रोटीन सामग्री में थोड़ी कमी दिखाई, जिससे पता चलता है कि ओटीए का ट्यूबल कोशिकाओं पर नकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है। ये प्रभाव दोनों प्रकार की कोशिकाओं में संस्कृति की स्थिति से लगभग स्वतंत्र थे

चित्रा 1. प्रोटीन सामग्री (ए), कस्पासे -3 गतिविधि (बी), और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) रिलीज (सी) पर ओक्रैटॉक्सिन ए (ओटीए) और/या संस्कृति की स्थिति के प्रभाव। कोशिकाओं की खेती या तो मोनो- या सह-संस्कृति में की गई और 24 या 48 घंटे के लिए 1 0 0 एनएम ओटीए के संपर्क में आई। एन=3–6, एन=14–18 (प्रोटीन, एलडीएच) या 8–9 (कास्पेज़-3)। * एपी <0.05 गैर-ओटीए-उजागर="" कोशिकाओं="" (ओटीए="" प्रभावों="" की="" तुलना,="" प्रतिक्रिया="" बाईं="" ओर)="" या="" मोनो-संस्कृति="" में="" कोशिकाओं="" (संस्कृति="" प्रभावों="" की="" तुलना,="" सम्मान।="" दाईं="" ओर)="" को="" इंगित="" करता="" है।="" प्रोटीन="" सामग्री="" पर="" प्रभाव="" को="" और="" स्पष्ट="" करने="" के="" लिए,="" हमने="" एपोप्टोसिस="" और="" नेक्रोसिस="" का="" अध्ययन="" किया।="" फाइब्रोब्लास्ट्स="" की="" तुलना="" में,="" ओटीए="" का="" 24="" घंटे="" के="" एक्सपोजर="" के="" बाद="" ट्यूब्यूल="" कोशिकाओं="" में="" एपोप्टोसिस="" पर="" स्पष्ट="" प्रभाव="" पड़ा।="" गतिविधि="" में="" लगभग="" 2.5-गुना="" वृद्धि="" (चित्रा="" 1बी)।="" 48="" घंटे="" के="" एक्सपोजर="" के="" बाद="" भी="" वृद्धि="" देखी="" जा="" सकती="" थी="" लेकिन="" 24="" घंटे="" के="" बाद="" उतनी="" विशिष्ट="" नहीं="" थी।="" हालाँकि,="" ये="" वृद्धि="" संस्कृति="" की="" स्थितियों="" से="" लगभग="" स्वतंत्र="" थी,="" सिवाय="" इसके="" कि="" 48="" घंटे="" के="" बाद="" फाइब्रोब्लास्ट्स="" की="" उपस्थिति="" में="" ट्यूब्यूल="" कोशिकाओं="" में="" कस्पासे="" गतिविधि="" थोड़ी="" कम="" हो="" गई="" थी,="" जो="" सह-संस्कृति="" के="" एक="" मामूली="" सुरक्षा="" प्रभाव="" को="" दर्शाता="" है।="" हालांकि,="" विशेष="" रूप="" से="" ओटीए="" की="" उपस्थिति="" में,="" फाइब्रोब्लास्ट्स="" के="" लिए="" सह-संस्कृति="" का="" एक="" सुरक्षात्मक="" प्रभाव="" देखा="" जा="" सकता="" था।="" सह-संस्कृति="" में,="" एलडीएच="" रिलीज="" को="" फाइब्रोब्लास्ट्स="" और="" ट्यूब्यूल="" कोशिकाओं="" में="" स्पष्ट="" रूप="" से="" बढ़ाया="" गया="" था,="" जब="" ओटीए="" (चित्रा="" 1="" सी)="" की="" उपस्थिति="" से="" स्वतंत्र="" मोनोकल्चर="" स्थितियों="" की="" तुलना="" में।="" ट्यूब्यूल="" कोशिकाओं="" में,="" ओटीए="" ने="" विशेष="" रूप="" से="" 48="" घंटे="" के="" एक्सपोजर="" के="" बाद="" मीडिया="" में="" जारी="" एलडीएच="" की="" वृद्धि="" को="" जन्म="" दिया,="" जो="" कि="" फाइब्रोब्लास्ट="" में="" स्पष्ट="" नहीं="" था।="" एक="" साथ="" लिया="" गया,="" संबंधित="" अन्य="" सेल="" प्रकार="" की="" उपस्थिति="" ने="" नेक्रोसिस="" को="" बढ़ाया,="" लेकिन="" कम="" एपोप्टोसिस="" के="" लिए="" ताकि="" समग्र="" प्रोटीन="" सामग्री="" में="" उल्लेखनीय="" रूप="" से="" बदलाव="" न="" हो।="" एपोप्टोसिस="" और="" नेक्रोसिस="" पर="" ओटीए="" के="" प्रभाव="" भी="" ज्यादातर="" अन्य="" प्रकार="" की="" कोशिकाओं="" की="" उपस्थिति="" या="" अनुपस्थिति="" से="" स्वतंत्र="">

पश्चिमी धब्बा और mRNA अभिव्यक्ति

सीडीकेएन1ए/पी21सेल चक्र को ओटीए से प्रभावित दिखाया गया था और यह दिखाया जा सकता था कि पी 21 प्रोटीन जो कोशिका चक्र में शामिल है, ओटीए द्वारा ट्यूब्यूल कोशिकाओं [21] में अपग्रेड किया गया था। यह जांचने के लिए कि प्रोटीन, साथ ही p21 के लिए mRNA कोडिंग की अभिव्यक्ति, फ़ाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति से कितनी दूर है, हमने पश्चिमी धब्बा और RT-PCR का प्रदर्शन किया। जैसा कि आंकड़े 2ए, बी और 3 में दिखाया गया है, 100 एनएम ओटीए के 48 घंटे के एक्सपोजर ने मोनो में पी21 प्रोटीन की मात्रा में वृद्धि की, लेकिन ट्यूबल कोशिकाओं में सह-संस्कृति की स्थिति में भी। सह-संस्कृति की स्थिति के तहत फाइब्रोब्लास्ट में, ओटीए का पी 21- प्रोटीन अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं था, हालांकि अन्य सेल प्रकार की उपस्थिति से स्वतंत्र ओटीए द्वारा एमआरएनए अभिव्यक्ति को बढ़ाया गया था। दिलचस्प बात यह है कि सह-संस्कृति स्थितियों के तहत, ओटीए एक्सपोज़र ने पी 21 प्रोटीन अभिव्यक्ति को और नहीं बढ़ाया। नलिका कोशिकाओं में, उनके आरएनए अभिव्यक्ति को फ़ाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति से नहीं बदला गया था, लेकिन सह-संस्कृति में फ़ाइब्रोब्लास्ट्स में pZlmRNA अभिव्यक्ति को न केवल ओटीए-उजागर में बल्कि पहले से ही ओटीए के संपर्क में नहीं आने वाली कोशिकाओं में भी बढ़ाया गया था (पूरक फ़ाइल S1 भी देखें)। इससे पता चलता है कि अन्य प्रकार की कोशिकाओं के p रेजिनी का p21 प्रोटीन अभिव्यक्ति पर प्रभाव पड़ता है, विशेष रूप से फ़ाइब्रोब्लास्ट में।

साइक्लोऑक्सीजिनेज 2 (COX2)यह दिखाया गया है कि साइक्लोऑक्सीजिनेज 2 (COX2) प्रोटीन के साथ-साथ mRNA स्तर में वृद्धि हुई हैकिडनी खराब[22]। जैसा कि आंकड़े 2सी, डी और 3 में दिखाया गया है, केवल फाइब्रोब्लास्ट में ओटीए एक्सपोजर द्वारा प्रोटीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई थी। इसके अलावा, नलिका कोशिकाओं की उपस्थिति में, COX2 प्रोटीन अभिव्यक्ति को अनुपचारित के साथ-साथ ओटीए-उजागर कोशिकाओं में बढ़ाया गया था, जो नलिका कोशिकाओं के स्पष्ट प्रभाव को प्रदर्शित करता है। हालांकि, एमआरएनए अभिव्यक्ति ओटीए से प्रभावित नहीं थी और ओटीए एक्सपोजर से सह-संस्कृति का बहुत मामूली प्रभाव हुआ। इसके विपरीत, नलिका कोशिकाओं में, COX2 की mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति OTA या फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति से पूरी तरह से स्वतंत्र थी। इससे पता चलता है कि संबंधित COX2 नलिका कोशिकाएं फाइब्रोब्लास्ट को प्रभावित कर सकती हैं लेकिन फाइब्रोब्लास्ट का ट्यूबल कोशिकाओं पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है।

फ़ाइब्रोनेक्टिनकिडनी खराबअक्सर फाइब्रोसिस के साथ होता है। फाइब्रोसिस के दौरान, बाह्य मैट्रिक्स का एक संचय होता है और एक अवलोकन के अलावा दूसरे में फाइब्रोनेक्टिन प्रोटीन की मात्रा में वृद्धि होती है [23]। इसलिए, फाइब्रोनेक्टिनकोडिंग एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति का ओटीए निर्भर परिवर्तन मोनो- या सह-संस्कृति स्थितियों में निर्धारित किया गया था। जैसा कि आंकड़े 3 और 4ए, बी में दिखाया गया है, 100 एनएम ओटीए के लिए ट्यूब्यूल कोशिकाओं के 48 घंटे के जोखिम ने मोनो और सह-संस्कृति दोनों में इंट्रासेल्युलर फाइब्रोनेक्टिन की कमी का कारण बना। सह-संस्कृति में ओटीए-प्रभाव कम था। इसके अलावा, फाइब्रोनेक्टिन के लिए एमआरएनए कोडिंग की मात्रा ओटीए एक्सपोजर द्वारा संस्कृति की स्थितियों से स्वतंत्र रूप से कम हो गई थी और फाइब्रोब्लास्ट्स की उपस्थिति ने नियंत्रण और ओटीए-उजागर कोशिकाओं में एमआरएनए अभिव्यक्ति को कम कर दिया था। इसके विपरीत, फ़ाइफ़ाइब्रोब्लास्ट्स में फ़ाइफ़ाइब्रोनेक्टिन की अभिव्यक्ति लगभग न तो ओटीए द्वारा और न ही संस्कृति की स्थितियों में एक महान परिवर्तनशीलता के कारण बदली गई थी, विशेष रूप से पश्चिमी धब्बों में। मोनो-संस्कृति में ओटीए प्रेरित अभिव्यक्ति की प्रवृत्ति दिखाई दे सकती है।

विमेंटिनVimentin एक प्रोटीन है जिसकी प्रचुरता तब बढ़ जाती है जब एपिथेलियल-टू-मेसेनकाइमल संक्रमण (EMT) होता है और EMT का विकास हो सकता हैकिडनी खराब[23]। इसलिए, विमिन एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति का ओटीए-निर्भर परिवर्तन मोनो- और सह-संस्कृति स्थितियों में निर्धारित किया गया था। जैसा कि आंकड़े 3 और 4सी, डी में दिखाया गया है, 100 एनएम ओटीए के लिए ट्यूब्यूल कोशिकाओं के 48 घंटे के जोखिम ने मोनो- और सह-संस्कृति स्थितियों के तहत विमिन प्रोटीन की कम बहुतायत का नेतृत्व किया। हालांकि, फाइब्रोब्लास्ट्स की उपस्थिति में विमिन प्रोटीन की अभिव्यक्ति संस्कृति की स्थिति से स्वतंत्र थी। vimentin के लिए mRNA कोडिंग की अभिव्यक्ति को लगभग न तो OTA द्वारा और न ही संस्कृति की स्थितियों में इस अपवाद के साथ बदला गया था कि सह-संस्कृति में OTA जोखिम में मामूली वृद्धि देखी गई। फाइब्रोब्लास्ट्स में, विमिन प्रोटीन की अभिव्यक्ति ओटीए एक्सपोज़र के साथ-साथ ट्यूब्यूल कोशिकाओं की उपस्थिति से पूरी तरह से स्वतंत्र थी। इसके अलावा, विमिन-कोडिंग एमआरएनए अभिव्यक्ति लगभग नहीं बदली गई थी

कुछ चयनित जीनों की अभिव्यक्तिआगे का परीक्षण करने के लिए कि संस्कृति की स्थिति अन्य आरएनए की अभिव्यक्ति को कितनी दूर तक प्रभावित कर सकती है, हमने कुछ जीनों का चयन किया, जो एपोप्टोसिस-नेक्रोसिस, कैंसर के विकास या ऊर्जा चयापचय में भूमिका निभाते हैं (पूरक फ़ाइल S1 भी देखें)।

WISP1-AS1ओटीए द्वारा प्रेरित एक लंबा गैर-कोडिंग आरएनए (lncRNA) है जो ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन को प्रभावित करता है और एपोप्टोसिस-नेक्रोसिस संतुलन में भूमिका निभाता है और शायद कैंसर के विकास में [24]। जैसा कि चित्र 5क में देखा गया है, 100 एनएम ओटीए के 48 घंटे के जोखिम ने दोनों प्रकार की कोशिकाओं को उस lncRNA की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि के लिए प्रेरित किया। ओटीए के बिना, संबंधित अन्य सेल प्रकार की उपस्थिति का अभिव्यक्ति पर लगभग कोई प्रभाव नहीं पड़ा। हालांकि, ओटीए की उपस्थिति में, मोनो-संस्कृति की तुलना में सह-संस्कृति में इसकी अभिव्यक्ति अधिक थी।

जीडीएफ15ग्रोथ डिफरेंशियल फैक्टर 15 (GDF15) ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर का एक सदस्य है जो सुपरफैमिली स्ट्रेस का जवाब देता है। इसके लिए बायोमार्कर के रूप में भी चर्चा की जाती हैगुर्दा रोगया के अस्तित्व के लिए एक भविष्यवक्ता के रूप मेंगुर्दाप्रत्यारोपण के रोगी [25,26]। GDF15 के लिए mRNA कोडिंग की अभिव्यक्ति को OTA एक्सपोजर के बाद दोनों प्रकार की कोशिकाओं में बढ़ाया गया था जैसा कि चित्र 5B में दिखाया गया है। यह ओटीए-प्रेरित प्रभाव फाइब्रोब्लास्ट में इष्ट था जब ट्यूब्यूल कोशिकाएं आसपास के क्षेत्र में थीं। नलिका कोशिकाओं में, हालांकि, अभिव्यक्ति फाइब्रोब्लास्ट (चित्रा 5 बी) की उपस्थिति से स्वतंत्र थी।सीडीके2साइक्लिन-आश्रित किनसे 2 (CDK2) की पहचान भारित सहसंबंध नेटवर्क विश्लेषण द्वारा OTA- प्रेरित कोशिका चक्र विकृति [21] के एक प्रमुख नियामक के रूप में की गई थी। मोनोकल्चर में फाइब्रोब्लास्ट में सीडीके 2 के लिए एमआरएनए कोडिंग की अभिव्यक्ति ओटीए द्वारा नहीं बदली गई थी। इसके अलावा, नलिका कोशिकाओं की उपस्थिति ने mRNA अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं किया। हालांकि, ट्यूब्यूल कोशिकाओं में, ओटीए ने केवल फाइब्रोब्लास्ट (चित्रा 5सी) की उपस्थिति में थोड़ी बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का नेतृत्व किया।

ग्लाइकोजन और ग्लूकोज से संबंधित प्रोटीन: PYGM, GYS1 और GLUT1 (SLC2A1)गुर्दाग्लूकोज होमियोस्टेसिस में भी शामिल है और ग्लूकोनोजेनेसिस द्वारा या ग्लाइकोजन स्टोर्स को जुटाकर शरीर को ग्लूकोज प्रदान कर सकता है [27]। ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज (पीवाईजीएम) ग्लाइकोजन स्टोर्स के अपघटन में एक भूमिका निभाता है, जिससे ग्लूकोज [28] जुटाया जाता है। जैसा कि चित्र 6क में देखा गया है, 100 एनएम ओटीए के 48 घंटे के एक्सपोजर ने ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेज के लिए एमआरएनए कोडिंग की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि की, विशेष रूप से ट्यूब्यूल कोशिकाओं में। हालांकि, ट्यूबल कोशिकाओं में यह वृद्धि संस्कृति की स्थिति पर निर्भर नहीं थी, जबकि फाइब्रोब्लास्ट में ओटीए-प्रेरित अभिव्यक्ति ट्यूब्यूल कोशिकाओं की उपस्थिति में अधिक थी, जबकि ट्यूबल कोशिकाओं के बिना स्थिति की तुलना में ग्लाइकोजन सिंथेज़ 1 (जी ^ वाईएसएल) विपरीत प्रतिक्रिया उत्प्रेरित करता है। और जबकि फॉस्फोरिलेज़ की अभिव्यक्ति को अपग्रेड किया गया था, सिंथेज़ की अभिव्यक्ति को ट्यूब्यूल कोशिकाओं में ओटीए द्वारा और सह-सीटिल्चर (चित्रा 6 बी) में फाइब्रोब्लास्ट में विनियमित किया गया था। यह ओटीए के ग्लूकोज-जुटाने वाले प्रभाव को इंगित करता है, दिलचस्प बात यह है कि ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर GLUTl (SLC2A1) की mRNA अभिव्यक्ति को OTA द्वारा भी अपग्रेड किया गया था, (चित्र 6C), ओटीए एक्सपोजर के कारण ग्लूकोज की बढ़ी हुई मांग के विचार को रेखांकित करता है।

माइटोकॉन्ड्रिया-संबंधित प्रोटीन: NDUFB10 और MRPS16

ऐसे संकेत हैं कि ओटीए एक्सपोजर से माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता में कमी हो सकती हैगुर्दाकोशिकाएं [24] दिखा रही हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन ओटीए एक्सपोज़र से प्रभावित हो सकता है, जो फ़ाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति से अतिरिक्त रूप से प्रभावित हो सकता है। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के लिए अन्य आरएनए कोडिंग के प्रतिनिधि, हम यहां NDUFB1 0 और MRPS16 के लिए mRNAs कोडिंग की अभिव्यक्ति दिखाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल NADH के लिए NDUFBt0 कोड: ubiquinone oxidoreductase सबयूनिट B10, जो माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन परिसर I का एक हिस्सा है और हृदय में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है औरगुर्दा(एनसीबीआई जीन। ऑनलाइन उपलब्ध: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4716 (17 मार्च 2021 को एक्सेस किया गया))। माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोमल प्रोटीन S16 के लिए MRPS16 जीन कोड, जो माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन संश्लेषण में भूमिका निभाता है। जैसा कि चित्र 7 में दिखाया गया है, 24 h OTA एक्सपोज़र ने दोनों प्रकार की कोशिकाओं में दोनों mRNAs की घटी हुई अभिव्यक्ति का नेतृत्व किया। नलिका कोशिकाओं में, NDUFB10 जीन की घटी हुई अभिव्यक्ति फ़ाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति से प्रभावित नहीं थी, जबकि फ़ाइब्रोब्लास्ट में NDUFB10 अभिव्यक्ति की OTA- प्रेरित कमी को ट्यूब्यूल कोशिकाओं (चित्र 7A) की उपस्थिति में थोड़ा बचाया गया था। ट्यूब्यूल कोशिकाओं में, ओटीए द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोमल सबयूनिट के लिए जीन कोडिंग की पहले से कम की गई अभिव्यक्ति फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति में अतिरिक्त रूप से कम थी, जबकि फाइब्रोब्लास्ट्स में ट्यूबल कोशिकाओं की उपस्थिति एमआरपीएस16 एमआरएनए (चित्रा 7बी) की थोड़ी अधिक अभिव्यक्ति का कारण बनी। इससे पता चलता है कि माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन ओटीए से प्रभावित हो सकता है लेकिन ओटीए प्रभाव को अतिरिक्त रूप से संशोधित किया जा सकता है जब दो सेल प्रकार एक साथ पास होते हैं।

बहस

गुर्दातीव्र या क्रोनिक के जोखिम के साथ विभिन्न प्रकार के नेफ्रोटॉक्सिक पदार्थों से संकटग्रस्त हैकिडनी खराब[1]. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं पर नेफ्रोटॉक्सिक पदार्थों के प्रभाव के अध्ययन के लिए और जानवरों को संभालने को कम करने के लिए, सेल संस्कृतियों को व्यापक रूप से लागू किया गया है। इन सेल संस्कृतियों का अतिरिक्त लाभ है कि प्रयोगात्मक स्थितियों को नियंत्रित किया जा सकता है और एक परिभाषित सेल प्रकार का उपयोग करके जांच की गई पदार्थ के विशिष्ट प्रभावों को नियंत्रित किया जा सकता है। इन निर्विवाद लाभों के अलावा, कुछ विचार बने हुए हैं: उदाहरण के लिए, "होम ऑर्गन" में एक कोशिका प्रकार (जैसे, समीपस्थ नलिका कोशिकाएँ)गुर्दा) अन्य प्रकार की कोशिकाओं (जैसे, फ़ाइब्रोब्लास्ट्स) से कई गुना अन्योन्याश्रितताओं के साथ घिरा हुआ है। इसलिए, केवल एक सेल प्रकार का उपयोग करते समय देखे गए पदार्थ की प्रतिक्रिया मूल ऊतक में कोशिकाओं की उपस्थिति के समान नहीं हो सकती है। दो अलग-अलग चूहे वृक्क कोशिका प्रकारों से युक्त एक मॉडल में, यह दिखाया गया है कि ट्यूब्यूल और फ़ाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के बीच एक क्रॉस-टॉक मौजूद है, जिससे केवल दो प्रकार की कोशिकाएँ एक साथ होने पर प्रतिक्रियाएँ दिखाई देती हैं [20]। हालांकि, जब मानव वृक्क नलिका कोशिकाओं का उपयोग करके देखे गए निष्कर्षों के साथ उस कठोर के परिणामों की तुलना करते हैं तो यह उभर कर आता है कि चूहे की कोशिकाएं स्पष्ट रूप से मानव की तुलना में अधिक मजबूत होती हैं, जो एक सर्वव्यापी नेफ्रोटॉक्सिन, ओक्राफॉक्सिन ए (ओटीए) [7] के साथ उपचार के लिए उनकी प्रतिक्रिया को बताती है। इसलिए, मानव कोशिकाओं से युक्त एक सह-संस्कृति मॉडल आवश्यक है। हमने मानव समीपस्थ नलिका कोशिका रेखा HK2 और मानव फ़ाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करके ऐसा मॉडल स्थापित किया। HK2 कोशिकाओं को फिल्टर आवेषण पर उगाया जाता है और फाइब्रोब्लास्ट के साथ लाया जाता है, जो एक 6-वेल प्लेट के तल पर उगाया जाता है। एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस के रूप में बुनियादी मापदंडों को रिकॉर्ड करने के बाद, हमने इस मॉडल का उपयोग सेल चक्र, ईएमटी और सेलुलर चयापचय से संबंधित कुछ प्रोटीन और आरएनए के एक्सपेरिअन पर ओक्रैटॉक्सिन ए के प्रभाव पर प्रारंभिक डेटा को बाधित करने के लिए किया।

सेल जीवन रक्षा  प्रोटीन सामग्री के आधार पर, ऐसा लग रहा था कि न तो ओटीए और न ही संस्कृति-स्थिति का उल्लेखनीय प्रभाव था। हालांकि, एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस के बीच संबंध को दोनों प्रकार की कोशिकाओं में परिगलन की ओर स्थानांतरित कर दिया गया था जब कोशिकाओं को एक साथ सुसंस्कृत किया गया था। ओटीए को ट्यूब्यूल कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है [29] और कुछ हद तक फ़ाइब्रोब्लास्ट में भी [7]। यह वर्तमान परिणामों में भी परिलक्षित होता है। दिलचस्प बात यह है कि संबंधित अन्य सेल प्रकार की उपस्थिति ने दोनों प्रकार की कोशिकाओं में एपोप्टोसिस दरों में कमी की, लेकिन एलडीएच रिलीज को बढ़ाया। यह पहला संकेत है कि पहले से ही एक अन्य सेल प्रकार की उपस्थिति सेलुलर फ़ंक्शन को प्रभावित कर सकती है और मोनो-संस्कृति की तुलना में सह-संस्कृति में एक जहरीले पदार्थ के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया भिन्न हो सकती है।

प्रोटीन और आरएनए अभिव्यक्ति हमने कुछ अनुकरणीय प्रोटीनों के प्रोटीन और आरएनए अभिव्यक्ति के निर्धारण और उनके लिए आरएनए कोडिंग द्वारा अपने अध्ययन का विस्तार किया। जैसा कि ओटीए को सेल चक्र [21,30] को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था, सीडीकेएन1ए/पी21 की अभिव्यक्ति का अध्ययन किया गया था। डबॉर्ग एट अल [21] के निष्कर्षों के अनुसार, ओटीए ने न केवल सीडीकेएन1ए एमआरएनए बल्कि ट्यूब्यूल कोशिकाओं में सीडीकेएन1ए/पी21 प्रोटीन की भी एक बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का नेतृत्व किया। इन कोशिकाओं में, फ़ाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति ने सीडीकेएन 1 ए एमआरएनए अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं किया, जबकि फ़ाइब्रोब्लास्ट में एक स्पष्ट सह-संस्कृति प्रभाव केवल सह-संस्कृति में दिखाई देने वाले एमआरएनए बहुतायत के साथ दिखाई दे रहा था। हालांकि, एमआरएनए बहुतायत में यह वृद्धि प्रोटीन अभिव्यक्ति द्वारा पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं हुई थी, जो आगे के नियामक तंत्र का सुझाव देती है। कोशिका चक्र पर प्रभाव के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए कोशिका चक्र अध्ययन को जोड़ा जा सकता है। साइक्लिन-आश्रित किनसे 2 (CDK2) को कोशिका चक्र [21] के ओटीए-प्रेरित विकृति में एक भूमिका निभाने के लिए पाया गया था। ट्यूब्यूल कोशिकाओं में, सह-संस्कृति में ओटीए द्वारा इसकी एमआरएनए अभिव्यक्ति को बढ़ाया गया था जबकि फाइब्रोब्लास्ट ट्यूबल कोशिकाओं से प्रभावित नहीं थे। साथ में, परिणाम बताते हैं कि नलिका कोशिकाओं में कोशिका चक्र फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति से प्रभावित होता है।

फ़ाइब्रोब्लास्ट में COX2 की अभिव्यक्ति के लिए एक और सह-संस्कृति प्रभाव देखा गया। फ़ाइब्रोब्लास्ट्स के लिए ट्यूब्यूल कोशिकाओं की उपस्थिति ने स्पष्ट रूप से बढ़ी हुई प्रोटीन अभिव्यक्ति (चूहे की कोशिकाओं [20] में देखे गए परिणामों के समान) को जन्म दिया, जो कि ट्यूब्यूल कोशिकाओं के लिए दिखाई नहीं दे रही थी, जो कोई संस्कृति-निर्भरता नहीं दिखाती थी। यह इंगित करता है कि सूजन में फाइब्रोब्लास्ट की भूमिकागुर्दा रोगमोनो-संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट्स का उपयोग करके अध्ययनों से कम करके आंका जा सकता है। मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन विमिन संवैधानिक रूप से फाइब्रोब्लास्ट में व्यक्त किया जाता है और उपकला कोशिकाओं में उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) के दौरान तेजी से व्यक्त किया जाता है [10]। हालांकि यह दिखाया गया है कि लंबे समय तक ओटीए एक्सपोजर से ट्यूब्यूल कोशिकाओं में कोलेजन III या फाइब्रोनेक्टिन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति हो सकती है [7], वर्तमान अध्ययन में ट्यूब्यूल कोशिकाओं में ईएमटी-संकेत प्रोटीन विमिन की अभिव्यक्ति ओटीए एक्सपोजर के बाद भी कम थी, स्वतंत्र संस्कृति की स्थितियों का। इसके अलावा, फाइब्रोनेक्टिन एमआरएनए और प्रोटीन की अभिव्यक्ति कम थी और बढ़ी नहीं थी। इसके अलावा, फ़ाइब्रोब्लास्ट्स में, कोई भी परिवर्तित अभिव्यक्ति प्रदर्शन योग्य नहीं थी, ताकि ये निष्कर्ष ओटीए द्वारा प्रेरित ईएमटी के पक्ष में तर्क न दें, जैसा कि दूसरों द्वारा दिखाया गया है [31]।

सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे की कार्यक्षमता में सुधार होगा

आगे के परीक्षण के लिए कि क्या सह संस्कृति ओटीए से प्रेरित तनाव के सेलुलर उत्तर को प्रभावित कर सकती है, हमने एपोप्टोसिस-नेक्रोसिस, कैंसर विकास और ऊर्जा चयापचय से संबंधित कुछ अनुकरणीय आरएनए की अभिव्यक्ति का निर्धारण किया। लंबे समय तक गैर-कोडिंग आरएनए कई सेलुलर नियामक प्रक्रियाओं और उनके पटरी से उतरने और गुर्दे की फाइब्रोसिस या कैंसर [32] में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। WISP1-AS1 OTA द्वारा प्रेरित एक लंबा गैर-कोडिंग RNA है और वृक्क ट्यूमर कोशिकाओं [24] में व्यक्त किया जाता है। हमने पाया कि ओटीए द्वारा सेल प्रकारों और सह-संस्कृति दोनों में इसके अपग्रेडेशन ने अपग्रेडेशन को बढ़ाया। यह एपोप्टोसिस-नेक्रोसिस संतुलन और संभवतः ट्यूमर के गठन पर WISP 1- AS1 के प्रभाव को बढ़ाने की अनुमति देता है। सह-संस्कृति में देखी गई बढ़ी हुई एलडीएच रिलीज को कम से कम आंशिक रूप से डब्ल्यूआईएसपी 1- एएस 1 की बढ़ी हुई सामग्री द्वारा समझाया जा सकता है, जिसे ओटीए-प्रेरित नेक्रोसिस [24] के लिए आवश्यक दिखाया गया था।

WISP1-AS1माइटोकॉन ड्रिया [24] सहित चयापचय में भूमिका निभाने का भी संदेह था। गैस्ट्रिक एपिथेलियम कोशिकाओं में, ओटीए को माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन [33] का कारण दिखाया गया था। के लियेगुर्दाकोशिकाओं में, विवादास्पद परिणाम हैं कि क्या ओटीए एक्सपोजर का माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता पर प्रभाव पड़ता है या नहीं [21,24]। एक कम माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता बिगड़ा हुआ माइटोकॉन्ड्रिया का परिणाम हो सकता है या माइटोकॉन्ड्रियल क्षति को आगे बढ़ा सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की कम अभिव्यक्ति से बिगड़ा हुआ कार्य हो सकता है या इसके बाद परिवर्तित माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता हो सकती है। बिगड़ा हुआ माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन सेल को ऊर्जा आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए वैकल्पिक रास्तों का उपयोग करने के लिए मजबूर करता है। अनुचित माइटोकॉन्ड्रियल योगदान के तहत ऊर्जा आपूर्ति को ग्लाइकोलाइसिस के बढ़े हुए उपयोग से लैक्टेट के उत्पादन में वृद्धि के द्वारा बनाए रखा जा सकता है। हालांकि, HEK293 कोशिकाओं में, एक मानव भ्रूणगुर्दासेल लाइन, यह पाया गया कि ओटीए ने ग्लाइकोलाइसिस को कम करने के लिए प्रेरित किया और ग्लूटामाइन से लैक्टेट उत्पादन के कारण लैक्टेट की बढ़ी हुई मात्रा lncRNA WISP1-AS1 [24] की अभिव्यक्ति पर निर्भर थी। इसके विपरीत, गैस्ट्रिक एपिथेलिया कोशिकाओं में, यह दिखाया जा सकता है कि ओटीए एक्सपोजर ग्लाइकोलाइसिस और कम ट्राइकारबॉक्सिक एसिड चक्र गतिविधि [34] की ओर ग्लूकोज चयापचय की पुन: प्रोग्रामिंग की ओर जाता है। हम यहां दिखा सकते हैं कि (1) ओटीए दो प्रतिनिधि रूप से चुने गए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की कम एमआरएनए अभिव्यक्ति की ओर जाता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन संश्लेषण (एमआरपीएस 16) और ऊर्जा उत्पादन (एनडीयूएफबी 10) में भूमिका निभाते हैं और (2) ग्लाइकोजन-हैंडलिंग एंजाइमों को विनियमित किया गया था। इस तरह से बढ़ाया गया ग्लूकोज जुटाया जा सकता है (GYS1 डाउन और PYGM अप)। इसके अतिरिक्त, एक उच्च GLUT1 परिवहन क्षमता प्रेरित प्रतीत होती है। हालाँकि, ये OTA- प्रेरित परिवर्तन संस्कृति की स्थिति से लगभग स्वतंत्र थे।

निष्कर्ष में, हमने दिखाया है कि सह-संस्कृति स्थितियों के तहत, कोशिकाओं की प्रतिक्रिया मोनो-संस्कृति में देखी गई प्रतिक्रियाओं से भिन्न हो सकती है, हालांकि यहां अध्ययन किए गए सभी पैरामीटर संस्कृति-निर्भर नहीं थे। हालांकि, यहां प्रस्तुत निष्कर्षों के आधार पर, यदि संभव हो तो सह-संस्कृति के उपयोग को प्राथमिकता दी जानी चाहिए, इस प्रकार केवल एक सेल प्रकार का अध्ययन किए जाने पर होने वाले प्रभावों की निगरानी करने की संभावना से बचना चाहिए। सवाल यह है कि कोशिकाएं एक दूसरे के बीच कैसे संवाद करती हैं। एक चूहे के सह-संस्कृति मॉडल के अध्ययन से एक COX2-आश्रित तंत्र [20] का पता चला और चूहों में, रेटिनोइक एसिड कोशिकीय क्रॉस-टॉक में भाग लेता प्रतीत होता है।गुर्दाकोशिकाएं [35]। इसके अतिरिक्त, यह प्रश्न बना रहता है कि क्या, क्यों और कैसे ओटीए सेलुलर ऊर्जा चयापचय और उसमें माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका में हस्तक्षेप करता है।

एलडीएच और कैस्पासे का निर्धारण-3 गतिविधियां और प्रोटीन सामग्रीलसीका के लिए, कोशिकाओं को दो बार बर्फ-ठंडे पीबीएस बफर में धोया गया, एकत्र किया गया और MOPStriton बफर (2 0 मिमी 3- (एन-मॉर्फोलिनो) प्रोपेनसल्फोनिक एसिड, पीएच 7.4, 0 में एकत्र किया गया। 1 प्रतिशत ट्राइटन X100)। सेल लाइसेट्स में प्रोटीन सामग्री बाइसीनोनिक एसिड [36,37] का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। मीडिया या सेल में एलडीएच गतिविधि परिगलन के लिए एक उपाय के रूप में बर्गमेयर [38] के अनुसार निर्धारित की गई थी जैसा कि [20] में विस्तार से वर्णित है। कैसपेज़ -3 एपोप्टोसिस के उपाय के रूप में गतिविधि को फ्लोरिजेनिक कैस्पेज़ -3 सब्सट्रेट (डीईवीडी-एएफसी) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था जैसा कि [39] में वर्णित है। संक्षेप में, 60 µ l सेल lysate को 65 µ l रिएक्शन बफर (20 mmol/L piperazine -1, 4- bis (2ethanesulfonic acid (PIPES), 4 mmol/L EDTA, 0.2 प्रतिशत {{26}) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। }[(3-कोलेमिनोप्रोपाइल)डाइमिथाइलैमोनियो]-1-प्रोपेनसल्फेट (CHAPS), 10 mmol/L dithiotreitol (DTT), pH 7.4) जिसमें 42 µmol/L DEVD-AFC (एस्पग्लू-वैल-एएसपी {{ 36}}अमीनो-4-trifluoromethylcoumarin, end-concentration) 37 डिग्री सेल्सियस पर। क्लीवेड उत्पाद (एएफसी) की प्रतिदीप्ति 400 एनएम उत्तेजना और 505 एनएम उत्सर्जन पर मापा गया था। ज्ञात एएफसी का उपयोग करके एक अंशांकन वक्र द्वारा क्लीव्ड एएफसी की मात्रा निर्धारित की गई थी। सांद्रता।

आरटी-पीसीआर  ट्राईजोल अभिकर्मक (लाइफ टेक्नोलॉजीज, डार्मस्टैड, जर्मनी) का उपयोग करके कुल राइबोन्यूक्लिक एसिड (आरएनए) का अलगाव किया गया था। कोशिकाओं को धोया गया और उसके बाद ट्राईजोल अभिकर्मक के साथ लाइस किया गया और एक प्रतिक्रिया ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया गया। क्लोरोफॉर्म और सेंट्रीफ्यूजेशन (12,000× g) जोड़ने के बाद, ऊपरी चरण को एकत्र किया गया और बर्फ-ठंडे आइसोप्रोपेनॉल के साथ मिलाया गया। सेंट्रीफ्यूजेशन (12, 000 × g) के बाद सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया और गोली को 75 प्रतिशत इथेनॉल से दो बार धोया गया और अंत में पानी में घोल दिया गया। उनके निर्देशों के अनुसार इंविट्रोजन (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) से एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया गया था। SYBR ग्रीन अभिकर्मक (Invitrogen) का उपयोग करके रीयल-टाइम PCR का प्रदर्शन किया गया। प्राइमरों को माइक्रोसिंथ एजी, बाल्गच, स्विटजरलैंड द्वारा संश्लेषित किया गया था। प्राइमरी सीक्वेंस को तालिका 1 में दिखाया गया है। जीन एक्सप्रेशन के फोल्ड चेंज की गणना 2∆∆Ct विधि द्वारा EEF2 और RPS17 की अभिव्यक्ति को संदर्भ के रूप में उपयोग करके की गई थी। गैर-उपचारित एचके 2 कोशिकाओं (गैर-प्रकाशित परिणाम) के साथ इलाज किए गए ओटीए की तुलना करते समय आरएनए अनुक्रमण डेटा में इन दो जीनों की अभिव्यक्ति कम बदली हुई (यदि बिल्कुल भी) निकली।

पश्चिमी धब्बा  सोडियमडोडेसिलसल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) द्वारा प्रोटीन को अलग करने के बाद, प्रोटीन को एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थानांतरित किया गया था। इसके बाद, टीआरआईएस-बफर खारा (3 मिमी टीआरआईएस बेस, 14 0 मिमी NaCl, 0.17 मिमी ट्रिस में गैर-वसा वाले सूखे दूध के 5 प्रतिशत समाधान द्वारा झिल्ली की मुक्त बाध्यकारी साइटों को अवरुद्ध कर दिया गया था। -एचसीएल, पीएच 7.4) जिसमें 0.1 प्रतिशत ट्वीन20 है। टीआरआईएस खारा प्लस 5 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (टीआरआईएस-बीएसए, कमजोर पड़ने के लिए तालिका 2 देखें) में पतला पहला एंटीबॉडी जोड़ा गया था और झिल्ली रातोंरात ऊष्मायन किया गया था। धोने के बाद, टीआरआईएस-बीएसए में प्रतिदीप्ति-युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी को 90 मिनट के लिए जोड़ा गया था। दूसरे एंटीबॉडी के प्रतिदीप्ति को LICOR डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग करके दर्ज किया गया था।

सिस्टैन्च से किडनी/गुर्दे के दर्द में सुधार होगा