अमूर्तयद्यपि उम्र बढ़ना मानव दीर्घकालिक (कैंसर, मधुमेह, हृदय संबंधी और न्यूरोडीजेनेरेटिव) बीमारियों के लिए सबसे बड़ा जोखिम कारक है, लेकिन कैलोरी प्रतिबंध और कुछ दवाओं (पर्याप्त दुष्प्रभावों के साथ) के अलावा कुछ हस्तक्षेप ज्ञात हैं जो सीधे तौर पर उम्र बढ़ने को संबोधित करते हैं। इस प्रकार, नए विकल्पों की तत्काल आवश्यकता है जो आम तौर पर उम्र बढ़ने की प्रक्रिया में देरी कर सकते हैं और उम्र से संबंधित बीमारियों को रोक सकते हैं। सेलुलर एजिंग उम्र बढ़ने की प्रक्रियाओं का आधार है। यीस्ट सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया का कालानुक्रमिक जीवनकाल (सीएलएस) मानव पोस्ट-माइटोटिक सेलुलर उम्र बढ़ने के हस्तक्षेप की जांच के लिए अच्छी तरह से स्थापित मॉडल प्रणाली है। सीएलएस को एक स्थिर चरण में कोशिकाओं के व्यवहार्य रहने के दिनों की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया है। हमने विभिन्न रासायनिक एजेंटों और वेल प्लेटों पर नियंत्रणों के साथ इनक्यूबेट किए गए सेल संस्कृतियों में सीएलएस को मापने के लिए एक नई, सस्ती और तेज़ मात्रात्मक विधि विकसित की है। हमारा PICLS प्रोटोकॉल (1) माइक्रोप्लेट रीडर में फ्लोरोसेंट-आधारित सेल सर्वाइवल रीडिंग के लिए प्रोपीडियम आयोडाइड का उपयोग और (2) उसी प्लेट से OD600nm अवशोषण के माध्यम से कुल सेल गिनती माप वास्तविक उच्च-थ्रूपुट क्षमता प्रदान करता है। लॉजिस्टिक्स के आधार पर, बड़ी संख्या में प्लेटों को समानांतर में संसाधित किया जा सकता है ताकि कम समय में हजारों यौगिकों की स्क्रीनिंग संभव हो सके। यीस्ट सीएलएस पर रैपामाइसिन और कैलोरी प्रतिबंध के प्रभाव को मापकर विधि को मान्य किया गया था। हमने रासायनिक एजेंट स्क्रीनिंग के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग किया। हमने 2,5-एनहाइड्रो-डी-मैनिटोल (2,5-AM) की एंटी-एजिंग/न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता की खोज की है और व्यक्तिगत रूप से या अन्य एंटी-एजिंग हस्तक्षेपों के साथ इसके उपयोग का सुझाव दिया है।

सिस्टैंच का ग्लाइकोसाइड हृदय और यकृत के ऊतकों में एसओडी की गतिविधि को भी बढ़ा सकता है, और प्रत्येक ऊतक में लिपोफसिन और एमडीए की सामग्री को काफी कम कर सकता है, विभिन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन रेडिकल्स (ओएच-, एच₂ओ₂, आदि) को प्रभावी ढंग से हटा सकता है और डीएनए क्षति से बचा सकता है। ओएच-रेडिकल्स द्वारा। सिस्टैंच फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स में मुक्त कणों की एक मजबूत सफाई क्षमता होती है, विटामिन सी की तुलना में उच्च कम करने की क्षमता होती है, शुक्राणु निलंबन में एसओडी की गतिविधि में सुधार होता है, एमडीए की सामग्री कम होती है, और शुक्राणु झिल्ली समारोह पर एक निश्चित सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है। सिस्टैंच पॉलीसेकेराइड डी-गैलेक्टोज के कारण प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों के एरिथ्रोसाइट्स और फेफड़ों के ऊतकों में एसओडी और जीएसएच-पीएक्स की गतिविधि को बढ़ा सकते हैं, साथ ही फेफड़ों और प्लाज्मा में एमडीए और कोलेजन की सामग्री को कम कर सकते हैं और इलास्टिन की सामग्री को बढ़ा सकते हैं। डीपीपीएच पर एक अच्छा सफाई प्रभाव, वृद्ध चूहों में हाइपोक्सिया का समय बढ़ाना, सीरम में एसओडी की गतिविधि में सुधार करना, और प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों में फेफड़ों के शारीरिक अध: पतन में देरी करना, सेलुलर रूपात्मक अध: पतन के साथ, प्रयोगों से पता चला है कि सिस्टैंच में अच्छी एंटीऑक्सीडेंट क्षमता है और त्वचा की उम्र बढ़ने वाली बीमारियों को रोकने और उनका इलाज करने के लिए एक दवा बनने की क्षमता रखती है। साथ ही, सिस्टैंच में इचिनाकोसाइड में डीपीपीएच मुक्त कणों को साफ़ करने की एक महत्वपूर्ण क्षमता है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को साफ़ करने और मुक्त कट्टरपंथी-प्रेरित कोलेजन गिरावट को रोकने की क्षमता है, और थाइमिन मुक्त कट्टरपंथी आयन क्षति पर भी अच्छा मरम्मत प्रभाव पड़ता है।

एंटी-एजिंग उत्पाद देखने के लिए क्लिक करें

【अधिक जानकारी के लिए: david.deng@wecistanche.com / व्हाट्सएप:86 13632399501】

कीवर्डसैक्रोमाइसेस सेरेविसिया · कालानुक्रमिक जीवनकाल · रासायनिक जांच · बुढ़ापा रोधी यौगिक · 2,5-एनहाइड्रो-डी-मैनिटॉल

परिचय

The growing fraction of the elderly (>65 वर्ष) कुल जनसंख्या के बीच (2020 में दुनिया भर में ~ 10 प्रतिशत (पहली दुनिया के देशों में 20 प्रतिशत से ऊपर) से 2050 में एक्सट्रपलेशन 16 प्रतिशत तक), साथ ही उनकी बढ़ती जीवन प्रत्याशा (पहली दुनिया के देशों में 1960 से ~ 10 साल तक) ), दुनिया को तेजी से कठिन समस्याओं का सामना करना पड़ता है [1, 2]। आम तौर पर जीवन गतिविधि को कम करने के अलावा, उम्र बढ़ना पुरानी बीमारियों के विकास के लिए सबसे बड़ा जोखिम कारक बना हुआ है, जो बाद में स्वतंत्र मानव जीवन से समझौता करता है और अंततः मृत्यु का कारण बनता है [3-7]। उम्र से संबंधित विकृति को रोकने के लिए वर्तमान चिकित्सा दृष्टिकोण व्यायाम और आहार सहित स्वस्थ जीवन शैली की सिफारिशें हैं। हालाँकि, उम्र से संबंधित बीमारियों की शुरुआत को रोकने के लिए अकेले ये हस्तक्षेप पर्याप्त नहीं हैं।

उम्र बढ़ने की विशेषता शारीरिक अखंडता, सेलुलर कार्यों में दक्षता और चयापचय संकेतन की प्रगतिशील हानि है [8]। बढ़ते प्रयासों को सेलुलर उम्र बढ़ने की प्रक्रियाओं को समझने के लिए निर्देशित किया जाता है जो अत्यधिक परस्पर जुड़े और कार्यात्मक रूप से अनावश्यक जीन और प्रोटीन इंटरैक्शन नेटवर्क को प्रभावित करते हैं [8, 9]। उम्र बढ़ने की जटिलता के बावजूद, स्तनधारियों सहित विभिन्न मॉडल प्रणालियों में हाल के शोध से पता चला है कि रैपामाइसिन दवा प्रशासन आवेदन और कैलोरी (ग्लूकोज) प्रतिबंध [10-15] जैसे एंटी-एजिंग हस्तक्षेपों द्वारा उम्र बढ़ने में देरी और स्वास्थ्य अवधि में वृद्धि संभव है। इसलिए, एंटी-एजिंग यौगिकों के भंडार का विस्तार करना, जिनका उपयोग जीरोप्रोटेक्टिंग चिकित्सीय के रूप में किया जा सकता है और उनके अवांछित दुष्प्रभावों को कम करना उन आशाजनक रणनीतियों में से एक है जो उम्र बढ़ने में देरी कर सकती है और स्वास्थ्य अवधि को बढ़ा सकती है।

हाल के शोध से पता चला है कि मानव उम्र बढ़ने में देखे गए आणविक तंत्र एकल-कोशिका खमीर [8, 10, 16, 17] सहित विभिन्न जीवों में संरक्षित होते हैं। नवोदित यीस्ट सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया सेलुलर उम्र बढ़ने में शामिल जैविक प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए सबसे अधिक अध्ययन किए गए मॉडल जीवों में से एक है। यीस्ट में उम्र बढ़ने के अध्ययन के लाभों में एक छोटी पीढ़ी का समय, एक सुव्यवस्थित जीवनकाल और उच्च-थ्रूपुट परख के लिए इसकी संवेदनशीलता शामिल है। इसलिए, यह जीव बुढ़ापा-विरोधी हस्तक्षेपों की पहचान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया। यीस्ट का उपयोग आमतौर पर दो अलग-अलग तरीकों से उम्र बढ़ने का अध्ययन करने के लिए किया जाता है: प्रतिकृति जीवनकाल (आरएलएस) और कालानुक्रमिक जीवनकाल (सीएलएस) [18]। आरएलएस एक व्यक्तिगत कोशिका के विभाजित होने की संख्या को मापता है, जो स्टेम कोशिकाओं जैसी माइटोटिक कोशिकाओं के लिए एक उम्र बढ़ने वाला मॉडल है। सीएलएस उस समय की लंबाई को मापता है जब एक गैर-विभाजित कोशिका स्थिर चरण में व्यवहार्य रहती है, जो न्यूरॉन्स जैसी पोस्ट-माइटोटिक कोशिकाओं के लिए एक उम्र बढ़ने वाला मॉडल है। पोषक तत्वों से वंचित स्थिर चरण की स्थितियों में उम्र बढ़ने वाली यीस्ट कोशिकाओं की व्यवहार्यता कम हो जाती है, और वे अंततः मर जाते हैं।

सीएलएस को पारंपरिक रूप से एगर प्लेट पर कॉलोनी-फॉर्मिंग यूनिट (सीएफयू) की गणना करके मापा जाता है [18]। कुल मीडिया (20 मिलीलीटर से अधिक या उसके बराबर) वाले फ्लास्क में यीस्ट कोशिकाएं एक ही रासायनिक यौगिक के संपर्क में आती हैं। अलग-अलग समय बिंदुओं पर (उदाहरण के लिए, 2, 5, और 8 दिनों के बाद), फास्क से कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने की संस्कृति के छोटे अंशों को क्रमिक रूप से पतला किया जाता है, पोषक तत्व अगर प्लेटों पर चढ़ाया जाता है, और कॉलोनी के गठन और गिनती के लिए 2-3 दिनों के लिए ऊष्मायन किया जाता है। उत्तरजीविता अंश 1 दिन के सापेक्ष प्रत्येक कालानुक्रमिक आयु बिंदु के लिए सीएफयू से निर्धारित होता है (100 प्रतिशत कोशिका अस्तित्व माना जाता है)। सीएफयू दृष्टिकोण मात्रात्मक है लेकिन कई कमियों से जुड़ा है। कालोनियों को प्रदर्शित करने के लिए इसमें कई सिलसिलेवार तनुकरण, चढ़ाना चरण और ऊष्मायन अवधि की आवश्यकता होती है। कॉलोनी की गिनती मैन्युअल या महंगे उपकरणों द्वारा की जाती है। इसके अलावा, यह विधि हजारों यौगिकों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) के लिए अनुपयुक्त और बहुत महंगी है क्योंकि इसमें परीक्षण की गई दवाओं, बड़ी मात्रा में फ्लास्क संस्कृतियों और कई अगर प्लेटों की पर्याप्त मात्रा की आवश्यकता होती है। दुर्भाग्य से, सीएलएस को मापने के लिए सीएफयू विधि और सभी हालिया वेरिएंट माइटोटिक चरण में फिर से प्रवेश करने के लिए पोस्ट-माइटोटिक कोशिकाओं की क्षमता पर गंभीर रूप से निर्भर हैं। सिद्धांत रूप में, यह पद्धति माइटोटिक गिरफ्तारी में यीस्ट को मृत कोशिकाओं से अलग नहीं कर सकती है।

सीएफयू-व्युत्पन्न तरीकों में वर्तमान तकनीकी प्रगति कोशिका अस्तित्व और वृद्धि को मापती है जो पोषक तत्वों से भरपूर संस्कृति में दवा-उजागर स्थिर चरण खमीर के तरल माध्यम में या अगर प्लेट पर स्पॉटिंग परख के आधार पर होती है [17, 19-21] . 24 घंटे के बाद, तरल माध्यम में वृद्ध कोशिकाओं की वृद्धि को OD600nm पर अवशोषण द्वारा मापा जाता है, जबकि स्पॉटिंग परख में, अगर माध्यम पर धब्बेदार वृद्ध संस्कृति की वृद्धि को 48 घंटे के बाद दृष्टिगत रूप से पहचाना जाता है। लॉजिस्टिक सुधार में वेल प्लेटों का उपयोग शामिल है जो सीमित रासायनिक या जीनोमवाइड विलोपन स्ट्रेन स्क्रीनिंग की अनुमति देता है। पूलित टैग किए गए यीस्ट विलोपन उपभेदों के लिए, व्यक्तिगत तनाव व्यवहार्यता की मात्रा निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री की आवश्यकता होती है [22]।

प्रोपीडियम आयोडाइड (पीआई) एक फ्लोरोसेंट डाई है जो केवल मृत कोशिकाओं में प्रवेश करती है और इस प्रकार, सेल व्यवहार्यता के प्रत्यक्ष परिमाणीकरण के लिए एक शक्तिशाली मार्कर है [23-25]। पहले, अध्ययनों में सीएलएस को मापने और फ्लोरोसेंट सेल काउंटर, यूवी ट्रांसिल्यूमिनेटर, या फ्लो साइटोमेट्री [26, 27] द्वारा प्राप्त छवियों का विश्लेषण करके सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए पीआई-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। हालाँकि, डेटा विश्लेषण के लिए एकाधिक नमूना प्रसंस्करण, इमेजिंग और सॉफ़्टवेयर आवश्यकताएँ महंगी और समय लेने वाली हैं, जो वास्तविक उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों में इन तरीकों को बाधित करती हैं। निषेधात्मक लागतों के कारण उच्च-थ्रूपुट सेटिंग में SYTOX ग्रीन जैसे वैकल्पिक रंगों की शुरूआत सीमित मूल्य की है [26]।

इसलिए, मौजूदा पद्धतियों से जुड़ी सीमाओं से बचने के लिए वृद्ध कोशिका की व्यवहार्यता को मापने के लिए नए तरीकों की आवश्यकता है। इस कार्य में, हम PICLS का वर्णन करते हैं, एक PI-आधारित CLS माप पद्धति जो आउटग्रोथ-स्वतंत्र है। हमारा नया दृष्टिकोण विभिन्न परीक्षण यौगिकों या विभिन्न परीक्षण मीडिया स्थितियों के साथ 96-वेल प्लेटों में यीस्ट कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने पर निर्भर करता है। हम कोशिका अस्तित्व को मापने के लिए पीआई का उपयोग करते हैं। तेज़ और कुशल रीडआउट (~15 मिनट के भीतर) एक माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा प्रदान किया जाता है, जो कि अधिकांश प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध एक कम लागत वाला उपकरण है। यह सस्ती पद्धति एंटी-एजिंग यौगिकों की पहचान करने के लिए रासायनिक एजेंटों की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है क्योंकि कई अलग-अलग यौगिकों, नियंत्रणों या तनुकरणों को आसानी से एक ही प्लेट पर रखा जा सकता है और बड़ी संख्या में प्लेटों को समानांतर में संसाधित किया जा सकता है। इसके अलावा, हमने रैपामाइसिन प्रशासन और कैलोरी प्रतिबंध जैसे ज्ञात एंटी-एजिंग हस्तक्षेपों का उपयोग करके खमीर के सीएलएस के विस्तार का निर्धारण करके अपनी पद्धति को मान्य किया। हमारी प्रयोगशाला में उपलब्ध रसायनों की एक त्वरित जांच से अप्रत्याशित रूप से पता चला कि 2,5-एनहाइड्रो-डी-मैनिटॉल (2,5-AM) खमीर के जीवनकाल को बढ़ा रहा है। हमने पारंपरिक आउटग्रोथ विधियों के साथ 2,5-AM की बुढ़ापारोधी गतिविधि की भी पुष्टि की। अन्य परीक्षण किए गए चीनी एनालॉग्स ने कोई समान प्रभाव नहीं दिया।

परिणाम

माइक्रोप्लेट रीडर में प्रोपीडियम आयोडाइड प्रतिदीप्ति माप का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि का विकास

हमारा नया प्रोटोकॉल, रुचि के रासायनिक यौगिकों की एक विशिष्ट सांद्रता के साथ, अच्छी तरह से प्लेटों में पोषक तत्वों से भरपूर मीडिया में रखे गए जंगली-प्रकार के खमीर कोशिकाओं या उनके उत्परिवर्ती को उजागर करने से शुरू होता है। हम कोशिका मृत्यु के मार्कर के रूप में पीआई का उपयोग करते हैं क्योंकि यह फ्लोरोसेंट डाई केवल गैर-जीवित कोशिकाओं में प्रवेश करती है [23-25]। स्थिर चरण संस्कृति में सेल व्यवहार्यता को माइक्रोप्लेट रीडर में पीआई प्रतिदीप्ति को पढ़कर निर्दिष्ट दिनों के बाद निर्धारित किया जाता है, जो बदले में, डेटा विश्लेषण के लिए इलेक्ट्रॉनिक रूप से पठनीय स्प्रेडशीट प्रदान करता है।

पहले सत्यापन के रूप में, हम दिखाते हैं कि माइक्रोप्लेट कुओं में छोटी मात्रा के साथ काम करने से क्युवेट-आधारित दृष्टिकोण के समान परिणाम मिलते हैं और माइक्रोप्लेट रीडर सेल अस्तित्व डेटा को पकड़ने के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील है। इस प्रकार, हमने यीस्ट कोशिकाओं के पीआई धुंधलापन का विश्लेषण किया। यीस्ट कोशिकाओं को कांच के फ्लास्क में उगाया गया और 15 मिनट तक 1{13}}0 डिग्री पर उबाला गया। जीवित और मृत कोशिकाओं को धोया गया और 15 मिनट के लिए पीआई (5 माइक्रोग्राम प्रति एमएल) के बिना 1 × पीबीएस (फॉस्फेट-बफर सलाइन) में इनक्यूबेट किया गया। ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को धोया गया और पीबीएस में पुनः निलंबित कर दिया गया। कोशिकाओं को माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया और प्रतिदीप्ति तीव्रता को माइक्रोप्लेट रीडर (पूरक चित्र S1) द्वारा मापा गया। इस बात की पुष्टि के बाद कि पीआई कोशिका मृत्यु के लिए एक उपयुक्त मार्कर है, विधि विकसित करने के लिए एक बाद का विश्लेषण किया गया। पीआई-सना हुआ मृत कोशिकाओं को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके क्युवेट में मापे गए अंतिम 48 OD600nm तक पीबीएस में फिर से निलंबित कर दिया गया था। इसके बाद, कोशिकाओं को पीबीएस (OD600nm 48 से 0.05) में क्रमिक रूप से पतला किया गया और एक काले 96- वेल प्लेट (कोस्टार 3603) में स्थानांतरित किया गया। ध्यान देने के लिए, काले माइक्रोप्लेट्स स्पष्ट प्लेटों की तुलना में चार गुना अधिक महंगे हैं और कम आसानी से उपलब्ध हैं, लेकिन हमने उनका उपयोग किया क्योंकि वे नमूनों और माइक्रोप्लेट सतहों से उत्पन्न होने वाले गीले ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण प्रतिदीप्ति रीडआउट के लिए अधिक उपयुक्त हैं। जेलडॉक इमेजिंग सिस्टम (छवि 1 ए) के साथ, हमने विभिन्न तनुकरणों पर मृत खमीर कोशिकाओं में पीआई धुंधलापन के समावेश की डिग्री की कल्पना की। उसी प्लेट का उपयोग करते हुए, हमने उत्तेजना 535 एनएम और उत्सर्जन 617 एनएम तरंग दैर्ध्य पर एक माइक्रोप्लेट रीडर के साथ पीआई प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा। हमने OD600nm पर PI प्रतिदीप्ति तीव्रता और सेलुलर अवशोषण के बीच एक उच्च रैखिक सहसंबंध पाया (चित्र 1B)। यह परिणाम इंगित करता है कि पीआई प्रतिदीप्ति-आधारित विधि का हमारा संस्करण सेल व्यवहार्यता की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रभावी है।

As a next step, we determined the optimal range of cell density (quantified by OD600nm) so that cell density could be directly measured in 96-well   plates instead of in cuvettes. Using the black microplates with dead yeast cells from the previous experiment, we determined the correlation of  OD600nm measurements taken from the cuvettes and from the microplate directly. We found a high linear correlation between the two series of measurements in the OD600nm range of 0.05 to 12 of the cuvette (Fig.  1C). However, the trend is no longer maintained for higher OD600nm values>क्युवेट के 12 (चित्र 1डी)। इसके बाद, हमने इष्टतम OD600nm रेंज 0.05–12 के भीतर PI प्रतिदीप्ति तीव्रता और {{3}वेल प्लेट के सेल OD6{5}}0nm के बीच संबंध निर्धारित किया। हम लगभग पूर्ण रैखिक सहसंबंध देखते हैं (चित्र 1ई)। इस प्रकार, हमारा प्रोटोकॉल सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए एक मजबूत विधि का प्रतिनिधित्व करता है।

माइक्रोप्लेट रीडर में प्रोपिडियम आयोडाइड प्रतिदीप्ति माप का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता की मात्रा का ठहराव पर माइक्रोप्लेट प्रकारों का प्रभाव

यीस्ट के कालानुक्रमिक जीवनकाल पर रैपामाइसिन का प्रभाव

रैपामाइसिन यीस्ट, नेमाटोड, फल मक्खियों और चूहों [10, 14, 15, 28-30] सहित कई मॉडल जीवों के जीवनकाल को बढ़ाने के लिए प्रदर्शित प्रसिद्ध एंटी-एजिंग हस्तक्षेपों में से एक है। यह पोषक तत्व-संवेदी कॉम्प्लेक्स TORC1 (रैपामाइसिन कॉम्प्लेक्स 1 का लक्ष्य) को रोकता है। TORC1 यूकेरियोटिक कोशिकाओं में एक संरक्षित मल्टी-सबयूनिट प्रोटीन कॉम्प्लेक्स है जो कोशिका वृद्धि और प्रसार के साथ पर्यावरण में पोषक तत्वों को जोड़ता है [19, 29, 31-34]।

हमने अपने नव विकसित प्रोटोकॉल को मान्य करने के लिए यीस्ट स्ट्रेन के कालानुक्रमिक जीवनकाल (सीएलएस) पर रैपामाइसिन के प्रभाव की जांच की है। यहां और नीचे, हमने स्थिर चरण संस्कृति में कोशिका अस्तित्व पर अमीनो एसिड ऑक्सोट्रॉफी के मजबूत प्रभावों से बचने के लिए अपने प्रयोगों में प्रोटोट्रॉफ़िक यीस्ट स्ट्रेन (CEN.PK113- 7D) का उपयोग किया है [35, 36]। कोशिकाओं को सिंथेटिक परिभाषित (एसडी) माध्यम में रैपामाइसिन की विभिन्न सांद्रता के साथ वृद्ध किया गया था। कोशिका वृद्धि को विभिन्न समय बिंदुओं (24 घंटे, 48 घंटे, और 72 घंटे) पर मापा गया। हमने पाया कि 5 एनएम या उससे कम रैपामाइसिन (छवि 4 ए) के साथ ऊष्मायन के बाद कोशिका वृद्धि लगभग 24 घंटे तक संतृप्ति तक पहुंच गई। हालाँकि, 10 एनएम रैपामाइसिन के प्रशासन ने कोशिका वृद्धि को धीमा कर दिया, और संतृप्ति केवल 48 घंटे (छवि 4 ए) के बाद पहुंच गई थी। इससे पहले, सीएलएस प्रयोग [37] में रैपामाइसिन से बढ़ने वाली कोशिकाओं के लिए एक समान प्रवृत्ति देखी गई थी।

अगले चरण के रूप में, रैपामाइसिन की विभिन्न सांद्रता में विकसित कोशिकाओं के सीएलएस को मापा गया। हमने विभिन्न कालानुक्रमिक आयु समय बिंदुओं पर पीआई प्रतिदीप्ति का उपयोग करके कोशिका अस्तित्व का निर्धारण किया। वृद्धि समय बिंदु 72 घंटे को 1 दिन माना गया था। हम उत्तरजीविता ग्राफ से यह अनुमान लगा सकते हैं कि रैपामाइसिन के विभिन्न सांद्रता यीस्ट के सीएलएस को बढ़ाते हैं (चित्र 4बी)। रैपामाइसिन (5 एनएम और 1{{12%) एनएम) के साथ पूरक वृद्ध कोशिकाओं की जीवित रहने की क्षमता चौथे दिन ~75 प्रतिशत थी; हालाँकि, रैपामाइसिन के बिना ~50 प्रतिशत था। 7वें दिन, रैपामाइसिन-पूरक वृद्ध कोशिकाओं का अस्तित्व 70 प्रतिशत था; हालाँकि, रैपामाइसिन के बिना 20 प्रतिशत से भी कम हो गया था। वृद्ध कोशिकाओं का सीएलएस विस्तार रैपामाइसिन की कम सांद्रता (0.62-2.5 एनएम) पर भी देखा जा सकता है (चित्र 4बी)।

हमने अपने प्रोटोकॉल को सीधे दो पारंपरिक आउटग्रोथ दृष्टिकोणों से तुलना करके मान्य किया है जो यीस्ट के सीएलएस को मापते हैं। सबसे पहले, हमने जीवनकाल पर रैपामाइसिन के प्रभाव को मापने के लिए तरल माध्यम में आउटग्रोथ परख की। कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने वाली कोशिकाओं के अस्तित्व की निगरानी अलग-अलग आयु बिंदुओं पर एक ताजा 96- वेल प्लेट में YPD माध्यम के 200μL में एक 3-μl संस्कृति को स्थानांतरित करके की गई थी। आउटग्रोथ इनोकुलम में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या से मेल खाती है (चित्र 4सी)। OD600nm अवशोषण के माध्यम से पंजीकृत वृद्ध कोशिका वृद्धि को माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। उत्तरजीविता अंश की गणना 1 दिन के सापेक्ष प्रत्येक आयु-बिंदु के लिए वृद्धि OD600nm अवशोषण से की गई थी (100 प्रतिशत कोशिका अस्तित्व माना जाता है)। उत्तरजीविता ग्राफ चित्र 4D में दिखाया गया है।

इसी तरह, हमने अगर माध्यम पर परख करके विकास का संचालन किया। हमने वाईपीडी एगर प्लेट पर 3-μl एजिंग कल्चर देखा और इसे 48 घंटे तक इनक्यूबेट किया। वाईपीडी एगर प्लेट पर वृद्ध कोशिकाओं के बढ़ने की कल्पना जेलडॉक इमेजिंग सिस्टम (चित्र 4ई) द्वारा की गई थी। जैसा कि अपेक्षित था, हम वाईपीडी तरल और एगर आउटग्रोथ परख दोनों के तहत रैपामाइसिन द्वारा जीवनकाल विस्तार के रुझान देख सकते हैं जो हमारे नए प्रोटोकॉल के साथ निर्धारित समानांतर हैं।

इन परिणामों से पता चलता है कि हमारा एचटीएस प्रोटोकॉल पुन: उत्पन्न करता है कि रैपामाइसिन सेलुलर जीवनकाल को बढ़ाता है। इसके अलावा, हम इस पद्धति की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए Z-कारक का आकलन करते हैं [38]। आम तौर पर, 0.5-1.0 की सीमा में जेड-कारक उत्कृष्ट एचटीएस परख के संकेतक हैं। वृद्ध कोशिकाओं के पीआई प्रतिदीप्ति के साथ रैपामाइसिन की विभिन्न सांद्रता के लिए जेड-फैक्टर निर्धारित किया गया था (पूरक छवि एस 2)। हमारी फंडिंग, 5 एनएम रैपामाइसिन के लिए एक Z-फैक्टर {{10}}.70 और 10 एनएम रैपामाइसिन के लिए 0.74 इस HTS विधि को उच्च गुणवत्ता वाली श्रेणी में रखता है। इस प्रकार, हमारा प्रोटोकॉल संभावित एंटी-एजिंग यौगिकों की पहचान करने के लिए पर्याप्त मजबूत है।

यह पता लगाने के लिए कि क्या यह विधि विभिन्न यीस्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि में प्रभावी है, हमने BY4743 स्ट्रेन के सीएलएस पर रैपामाइसिन के प्रभाव का परीक्षण किया। सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया BY4743 स्ट्रेन हिस्टिडीन, ल्यूसीन और यूरैसिल के लिए ऑक्सोट्रोफिक है। BY4743 स्ट्रेन को ऑक्सोट्रोफिक घटकों के साथ पूरक एसडी माध्यम में रैपामाइसिन की विभिन्न सांद्रता में उगाया गया था। पीआई प्रतिदीप्ति (अनुपूरक चित्र S3) का उपयोग करके वृद्ध कोशिकाओं के अस्तित्व को निर्धारित किया गया था। हमने पाया कि रैपामाइसिन ने BY4743 कोशिकाओं की व्यवहार्यता को उसी तरह से मात्रात्मक रूप से बढ़ा दिया जैसे CEN.PK113-7D ने। इस प्रकार, इन परिणामों से पता चलता है कि हमारी विधि विभिन्न खमीर उपभेदों में प्रभावी है।

यीस्ट के कालानुक्रमिक जीवनकाल पर ग्लूकोज का प्रभाव

हमने यीस्ट के कालानुक्रमिक जीवनकाल पर कैलोरी प्रतिबंध के प्रभाव की जांच करके अपनी पद्धति को भी मान्य किया। खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं [11, 13, 16] सहित मॉडल जीवों में उम्र बढ़ने में देरी करने और जीवन काल को बढ़ाने के लिए कैलोरी प्रतिबंध स्थापित हस्तक्षेपों में से एक है। यीस्ट के सीएलएस पर कैलोरी प्रतिबंध के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, हम संस्कृति माध्यम में ग्लूकोज सामग्री को कम करते हैं। हमने सेल को तीन अलग-अलग एसडी माध्यम स्थितियों में विकसित किया, जिसमें 0.25 प्रतिशत, 0.5 प्रतिशत और 2 प्रतिशत ग्लूकोज शामिल था। हमने विभिन्न समय बिंदुओं (24 घंटे, 48 घंटे, और 72 घंटे) पर कोशिका वृद्धि को मापा। सभी संस्कृतियाँ 24 घंटे के बाद विकास संतृप्ति तक पहुँच गईं (चित्र 5ए)। कोशिका वृद्धि 2 प्रतिशत ग्लूकोज की तुलना में 0.25 प्रतिशत और 0.5 प्रतिशत कम थी (चित्र 5ए)। हमने पीआई प्रतिदीप्ति विधि (चित्र 5 बी) का उपयोग करके विभिन्न ग्लूकोज सांद्रता के तहत विकसित कोशिकाओं के लिए कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने की उत्तरजीविता को मापा। हम उत्तरजीविता ग्राफ से अनुमान लगाते हैं कि ग्लूकोज प्रतिबंध यीस्ट के सीएलएस को बढ़ाता है। हमने समवर्ती रूप से आउटग्रोथ एसेज़ (चित्र 5सी, डी, और ई) द्वारा सीएलएस के विस्तार की भी पुष्टि की, जिससे यीस्ट के सीएलएस को निर्धारित करने के लिए हमारी नई विधि को और अधिक मान्य किया गया। BY4743 स्ट्रेन के CLS विस्तार पर ग्लूकोज प्रतिबंध का प्रभाव PICLS विधि (पूरक चित्र S3) द्वारा भी दिखाया गया था। इस प्रकार, यीस्ट के सीएलएस को मापने के लिए हमारा दृष्टिकोण एंटी-एजिंग हस्तक्षेपों की पहचान करने के लिए रासायनिक एजेंटों और संवर्धन स्थितियों की स्क्रीनिंग के लिए एक उपन्यास, तेज और कम लागत वाली विधि का प्रतिनिधित्व करता है।

नव विकसित विधि का उपयोग करके रासायनिक एजेंटों की जांच करके 2,5-निर्जल-डी-मैनिटोल को एक नवीन एंटी-एजिंग यौगिक के रूप में पहचाना गया।

नए प्रोटोकॉल को विकसित करने और मान्य करने के बाद, हमने एंटी-एजिंग यौगिकों (पूरक छवि एस 4 और पूरक तालिका 1) की पहचान के लिए सैकड़ों रासायनिक एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए इस पद्धति का उपयोग किया। आश्चर्यजनक परिणामों में से एक के रूप में, हमें यीस्ट के सीएलएस को बढ़ाने के लिए यौगिक 2,{4}}एनहाइड्रो-डी-मैनिटॉल (2,5-AM) के संकेत मिले। चित्र 6 में, हम इस यौगिक के लिए विस्तृत अनुवर्ती प्रयोगों के परिणाम प्रस्तुत करते हैं। हमने वेल प्लेट पर विभिन्न सांद्रता में 2,{12}AM की एंटीएजिंग गतिविधि का परीक्षण किया। सबसे पहले, हमने कोशिका वृद्धि पर 2,{15}}AM का प्रभाव निर्धारित किया। यीस्ट कोशिकाओं को एसडी माध्यम में 2,5-AM की अलग-अलग सांद्रता के साथ ऊष्मायन किया गया था। कोशिका वृद्धि को विभिन्न समय बिंदुओं (24 घंटे, 48 घंटे, और 72 घंटे) पर मापा गया। हमने पाया कि 2,{23}}AM (चित्र 6ए) की सभी परीक्षण की गई सांद्रता के लिए 24 घंटे के बाद कोशिका वृद्धि समान संतृप्ति स्तर पर पहुंच गई। फिर, हमने पीआई प्रतिदीप्ति विधि का उपयोग करके 2,{26}}AM की विभिन्न सांद्रता के साथ पूरक कालानुक्रमिक रूप से वृद्ध कोशिकाओं के अस्तित्व को मापा। पहले की तरह, सीएलएस विश्लेषण के लिए 72 घंटे की वृद्धि संस्कृति को पहला दिन माना गया था। उत्तरजीविता ग्राफ को विभिन्न कालानुक्रमिक आयु समय बिंदुओं के लिए प्लॉट किया गया है (चित्र 6बी)। हमने पाया कि 2,5-AM सीएलएस को एकाग्रता-निर्भर तरीके से बढ़ाता है। चौथे दिन 2,{34}}AM (8 मिमी) के साथ पूरक वृद्ध कोशिकाओं का अस्तित्व ~80 प्रतिशत था; हालाँकि, 2 के बिना, 5- AM ~ 50 प्रतिशत था। 7वें दिन, 2,{43}}AM पूरक वृद्ध कोशिकाओं की उत्तरजीविता ~75 प्रतिशत थी; हालाँकि, 2 के बिना, {{46}AM को घटाकर 20 प्रतिशत से भी कम कर दिया गया था। 2,5-AM की बुढ़ापारोधी गतिविधि को आउटग्रोथ एसेज़ (चित्र 6सी, डी, और ई) द्वारा भी सत्यापित किया गया था।

2,5-AM एक शर्करा अणु है जो ग्लाइकोलाइसिस मार्ग में प्रवेश कर सकता है। यह केवल अपस्ट्रीम ग्लाइकोलाइटिक चरणों में हाइड्रोलाइज्ड होता है जो कोशिकाओं में गैर-चयापचयित 2, {{3}AM -1, 6-बिस्फोस्फेट (2, 5-AMBP) के संचय का कारण बनता है [39-41 ]. यह जांचने के लिए कि क्या सीएलएस प्रयोग के समान सांद्रता में 2,5-AM को ग्लाइकोलाइसिस एंजाइमों द्वारा संसाधित किया गया है, हमने एसएनएफ1 जीन विलोपन तनाव की बढ़ती संवेदनशीलता की जांच की। एसएनएफ1 एक सेलुलर ऊर्जा सेंसर है और यूकेरियोट्स में अत्यधिक संरक्षित एएमपी-सक्रिय प्रोटीन किनेज (एएमपीके) है [42, 43]। जिन यीस्ट कोशिकाओं में एएमपीके गतिविधि की कमी होती है, वे गैर-चयापचय ग्लाइकोलाइटिक मध्यवर्ती [44] की उपस्थिति में एक हाइपरसेंसिटिव ग्रोथ फेनोटाइप से जुड़े होते हैं। हमने 2,5-AM की विभिन्न सांद्रता के साथ snf1Δ विलोपन तनाव की वृद्धि को मापा। हमने पाया कि 2,5-AM वाइल्ड-टाइप स्ट्रेन (पूरक छवि S5) की तुलना में snf1Δ विलोपन स्ट्रेन के विकास को रोकता है। यह देखा गया विकास फेनोटाइप इंगित करता है कि 2, 5-AM ग्लाइकोलाइसिस से गुजरता है और गैर-चयापचय ग्लाइकोलाइटिक मध्यवर्ती में हाइड्रोलाइज्ड हो जाता है।

2,5-AM शर्करा की मात्रा फ्रुक्टोज [39] का एक एनालॉग है। यह स्पष्ट करने के लिए कि क्या अन्य शर्करा भी सीएलएस को प्रभावित करती है, हमने यीस्ट उम्र बढ़ने पर फ्रुक्टोज, मैनिटोल और माल्टोज के प्रभाव की जांच की। हमने सोर्बिटोल को भी शामिल किया है जो एक गैर-चयापचयित चीनी है जो कि संस्कृति माध्यम की ऑस्मोलैरिटी को बढ़ाकर खमीर कोशिकाओं के सीएलएस को बढ़ाने के लिए रिपोर्ट की गई है [20, 45]। सबसे पहले, हमने कोशिका वृद्धि पर फ्रुक्टोज़, मैनिटोल, माल्टोज़ और सोर्बिटोल के प्रभाव का परीक्षण किया। यीस्ट कोशिकाओं को एसडी माध्यम में 2,{7}}AM के समान फ्रुक्टोज, मैनिटोल, माल्टोज़ और सोर्बिटोल की विभिन्न सांद्रता के साथ ऊष्मायन किया गया था। 2,{9}}AM की तरह, फ्रुक्टोज, मैनिटोल, माल्टोज और सोर्बिटोल इनक्यूबेटेड कोशिकाएं 24 घंटे के बाद विकास संतृप्ति तक पहुंच गईं (चित्र 7ए)। इसके बाद, हमने दिन 1, दिन 7, दिन 14, और दिन 21 पर कालानुक्रमिक रूप से वृद्ध कोशिकाओं की उत्तरजीविता को मापा। 2,{17}}AM के विपरीत, फ्रुक्टोज, मैनिटोल, माल्टोज़ और सोर्बिटोल अनुपूरण ने कोशिकाओं के जीवनकाल को नहीं बढ़ाया। ख़मीर (चित्र 7बी, सी, डी, ई, और अनुपूरक चित्र. एस6)। उल्लेखनीय रूप से, 2,5-AM कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने के अंतिम चरण में भी जीवनकाल बढ़ाता है। 2,{23}AM (8 mM) अनुपूरक वृद्ध कोशिकाएं 21वें दिन जीवित (~65 प्रतिशत) रहती हैं। हालांकि, 2,{28}}AM अनुपूरण के बिना वृद्ध कोशिकाओं का अस्तित्व 10 प्रतिशत से कम था।

हमें बहुत आश्चर्य हुआ, हमने पाया कि परीक्षण की गई कम सांद्रता पर सोर्बिटोल सीएलएस (छवि 7 बी, सी, डी, ई, और पूरक छवि एस 6) को बढ़ाने में असमर्थ है। हमने अनुमान लगाया कि सीएलएस को बढ़ाने के लिए उच्च सोर्बिटोल सांद्रता की आवश्यकता हो सकती है। हमने 1 एम सोर्बिटोल सहित उच्च सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण किया, जो एकाग्रता पहले सीएलएस (1 एम के बराबर 18 प्रतिशत) को प्रभावित करने की रिपोर्ट की गई थी [2 0, 45]। पिछली रिपोर्टों के अनुरूप, हम यह भी पाते हैं कि बहुत उच्च सोर्बिटोल सांद्रता (0.5 और 1 एम के बीच) यीस्ट के सीएलएस को बढ़ाती है (पूरक छवि एस7), जाहिर तौर पर माध्यम की ऑस्मोलैरिटी को बढ़ाकर। दिलचस्प बात यह है कि बहुत कम सांद्रता (2 एमएम) पर सीएलएस में 2,{12}}एएम की वृद्धि से पता चलता है कि इसकी एंटीएजिंग गतिविधि का तंत्र ऑस्मोटिक से अलग है। इन परिणामों से पता चलता है कि 2,{16}}AM की एंटी-एजिंग गतिविधि इस चीनी यौगिक के लिए विशिष्ट है और कई अन्य, समान रूप से संरचित रसायनों के लिए नहीं देखी गई है।

【अधिक जानकारी के लिए: david.deng@wecistanche.com / व्हाट्सएप:86 13632399501】