बहस

दुनिया भर में वृद्धों की आबादी अभूतपूर्व दर से बढ़ रही है। उम्र बढ़ना सेलुलर कार्यों में गिरावट, क्षति संचय और पुरानी बीमारियों की बढ़ती संभावना से जुड़ा है जो सिस्टम के पतन और अंततः मृत्यु का कारण बनता है [3-7]। जीवन के अंत में उम्र से संबंधित विकृति का प्रसार जीवन की गुणवत्ता और स्वास्थ्य देखभाल की लागत पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालता है। इस प्रकार, एक प्रभावी एंटी-एजिंग गतिविधि के साथ हस्तक्षेप की तत्काल आवश्यकता है जिसका उपयोग उम्र बढ़ने में देरी करने और स्वास्थ्य अवधि को बढ़ाने के लिए जीरोप्रोटेक्टर के रूप में किया जा सकता है।

सिस्टैंच का ग्लाइकोसाइड हृदय और यकृत के ऊतकों में एसओडी की गतिविधि को भी बढ़ा सकता है, और प्रत्येक ऊतक में लिपोफसिन और एमडीए की सामग्री को काफी कम कर सकता है, विभिन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन रेडिकल्स (ओएच-, एच₂ओ₂, आदि) को प्रभावी ढंग से हटा सकता है और डीएनए क्षति से बचा सकता है। ओएच-रेडिकल्स द्वारा। सिस्टैंच फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स में मुक्त कणों की एक मजबूत सफाई क्षमता होती है, विटामिन सी की तुलना में उच्च कम करने की क्षमता होती है, शुक्राणु निलंबन में एसओडी की गतिविधि में सुधार होता है, एमडीए की सामग्री कम होती है, और शुक्राणु झिल्ली समारोह पर एक निश्चित सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है। सिस्टैंच पॉलीसेकेराइड डी-गैलेक्टोज के कारण प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों के एरिथ्रोसाइट्स और फेफड़ों के ऊतकों में एसओडी और जीएसएच-पीएक्स की गतिविधि को बढ़ा सकते हैं, साथ ही फेफड़ों और प्लाज्मा में एमडीए और कोलेजन की सामग्री को कम कर सकते हैं और इलास्टिन की सामग्री को बढ़ा सकते हैं। डीपीपीएच पर एक अच्छा सफाई प्रभाव, वृद्ध चूहों में हाइपोक्सिया का समय बढ़ाना, सीरम में एसओडी की गतिविधि में सुधार करना, और प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों में फेफड़ों के शारीरिक अध: पतन में देरी करना, सेलुलर रूपात्मक अध: पतन के साथ, प्रयोगों से पता चला है कि सिस्टैंच में अच्छी एंटीऑक्सीडेंट क्षमता है और त्वचा की उम्र बढ़ने वाली बीमारियों को रोकने और उनका इलाज करने के लिए एक दवा बनने की क्षमता रखती है। साथ ही, सिस्टैंच में इचिनाकोसाइड में डीपीपीएच मुक्त कणों को साफ़ करने की एक महत्वपूर्ण क्षमता है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को साफ़ करने और मुक्त कट्टरपंथी-प्रेरित कोलेजन गिरावट को रोकने की क्षमता है, और थाइमिन मुक्त कट्टरपंथी आयन क्षति पर भी अच्छा मरम्मत प्रभाव पड़ता है।

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सेलुलर उम्र बढ़ने को परस्पर जुड़ी जटिल जैविक प्रक्रियाओं के नेटवर्क द्वारा नियंत्रित किया जाता है [8, 9]। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि उम्र बढ़ने की जैविक प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप करने से स्तनधारियों सहित मॉडल जीवों के स्वस्थ जीवनकाल में काफी वृद्धि हो सकती है [10, 14]। नवोदित यीस्ट में कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने से सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया मानव पोस्ट-माइटोटिक कोशिका उम्र बढ़ने के हस्तक्षेप को निर्धारित करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित मॉडल प्रणाली है [16-19]।

हमने सीएलएस को मापने के लिए पीआईसीएलएस नामक एक नई, तेज और सस्ती मात्रात्मक विधि विकसित की है, जिसमें (1) स्पष्ट 96-वेल प्लेटों पर मीडिया और परीक्षण यौगिकों के साथ इनक्यूबेट की गई खमीर कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है; (2) फ्लोरोसेंट डाई प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई), एक कोशिका अभेद्य जो केवल मृत कोशिकाओं में प्रवेश करती है [23-25]; और (3) मात्रात्मक कोशिका अस्तित्व रीडआउट के लिए एक माइक्रोप्लेट रीडर। ध्यान देने के लिए, OD600nm पर सेल घनत्व (और सेल वृद्धि) को मापना एक ही प्लेट से किया जा सकता है। अच्छी तरह से प्लेटों पर मृत खमीर कोशिकाओं के लिए, हमने 0.05-12 ओडी के अनुरूप इष्टतम सेल घनत्व सीमा के भीतर पीआई प्रतिदीप्ति और ओडी 600 एनएम अवशोषण के बीच एक उच्च रैखिक सहसंबंध पाया। इस पद्धतिगत दृष्टिकोण का उपयोग उच्च-थ्रूपुट परख में सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए किया जा सकता है।

PICLS के साथ कई महत्वपूर्ण नवाचार जुड़े हुए हैं: (i) PICLS वर्तमान में CLS परिमाणीकरण के लिए एकमात्र आउटग्रोथ-मुक्त विधि है। एक महत्वपूर्ण समय- और संसाधन-मांग वाले कदम को प्रोटोकॉल से हटा दिया गया है और इस प्रकार, PICLS रासायनिक एजेंटों और सीएलएस माप के लिए संवर्धन स्थितियों के लिए पहली सच्ची उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग (HTS) है। (ii) पीआईसीएलएस के पीछे का व्यवस्थित विचार आम तौर पर एक प्लेट-आधारित विधि के रूप में तैयार किया जा सकता है जहां (ए) मृत/जीवित कोशिकाओं का अंश और (बी) कोशिकाओं की कुल मात्रा एक ऑप्टिकल तीव्रता के साथ एक ही प्लेट से सीधे एक साथ निर्धारित की जाती है। माप उपकरण (आमतौर पर उपलब्ध प्लेट रीडर)। इस कार्य में, हमने वेल प्लेट्स का उपयोग किया है, लेकिन वेल प्लेट्स भी लागू होती हैं (संभवतः कल्चर की कम मात्रा के कारण कुछ कम संवेदनशीलता के साथ)। कोई भी रंग एजेंट जो मृत और जीवित कोशिकाओं को अलग करता है और जिसमें एक चैनल में प्रतिदीप्ति या अवशोषण होता है जो सामान्य सेल घनत्व माप में हस्तक्षेप नहीं करता है (उदाहरण के लिए, OD600nm पर अवशोषण के माध्यम से) का उपयोग किया जा सकता है। हमने प्रोपिडियम आयोडाइड लगाया जो मृत कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से चिह्नित करता है लेकिन यह PICLS के लिए महत्वपूर्ण नहीं है।

चित्र 7 यीस्ट के कालानुक्रमिक जीवनकाल पर 2,5-एनहाइड्रो-डी-मैनिटॉल एनालॉग्स के प्रभाव का परीक्षण। प्रोटोट्रॉफ़िक यीस्ट स्ट्रेन (CEN.PK113-7D) को सिंथेटिक परिभाषित माध्यम में 2,{7}}निर्जल-डमैनिटोल (2,5-AM), डी-फ्रुक्टोज की विभिन्न सांद्रता के साथ उगाया गया था। , डी-मैनिटोल, डी-माल्टोज़, और डी-सोर्बिटोल 30 डिग्री पर अच्छी तरह से प्लेटों में। एक कोशिका वृद्धि OD600nm को अलग-अलग समय बिंदुओं 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे पर एक माइक्रोप्लेट रीडर और ग्राफ का उपयोग करके 2, 22 AM, फ्रुक्टोज, मैनिटोल, माल्टोज़ और सोर्बिटोल की विभिन्न सांद्रता के विरुद्ध मापा गया था। बी 2,5-AM, फ्रुक्टोज, मैनिटोल, माल्टोज़ और सोर्बिटोल इनक्यूबेटेड कोशिकाओं की विभिन्न सांद्रता का कालानुक्रमिक जीवनकाल (सीएलएस) प्रोपिडियम आयोडाइड प्रतिदीप्ति-आधारित विधि का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। विभिन्न कालानुक्रमिक आयु बिंदुओं पर कोशिका अस्तित्व की मात्रा निर्धारित की गई और वृद्धि समय बिंदु 72 घंटे को 1 दिन माना गया। सी वृद्ध कोशिकाओं का सीएलएस वाईपीडी तरल माध्यम में आउटग्रोथ विधि द्वारा निर्धारित किया गया था। विकास समय बिंदु 72 घंटे को 1 दिन माना जाता था। विभिन्न कालानुक्रमिक आयु बिंदुओं पर, एक 3-μL संस्कृति को 200μL YPD माध्यम वाली दूसरी 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित किया गया था। YPD तरल माध्यम में वृद्धि OD600nm को माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 30 डिग्री पर 24 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद मापा गया था। ग्राफ 1 दिन के सापेक्ष प्लॉट किया गया है। डी एक 96- वेल प्लेट के वाईपीडी तरल माध्यम में विकास को 30 डिग्री पर 24 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद फोटो खींचा गया था। E विभिन्न कालानुक्रमिक आयु बिंदुओं पर, YPD अगर प्लेट पर μL संस्कृतियाँ देखी गईं। 30 डिग्री पर 48 घंटे तक ऊष्मायन के बाद वृद्धि की तस्वीर ली गई। सभी डेटा को माध्य±एसडी के रूप में दर्शाया गया है; *पी<0.05, **P<0.01, and  ****P<0.0001 based on two-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparisons tests (B and C). n.s, non-significant 

हम ध्यान दें कि काले माइक्रोप्लेट्स को आमतौर पर प्रतिदीप्ति परख के लिए अनुशंसित किया जाता है क्योंकि यह सामग्री आंशिक रूप से ऑटोफ्लोरेसेंस को बुझाती है। हालाँकि, हमने स्पष्ट माइक्रोप्लेट्स में विधि का मूल्यांकन किया और काले माइक्रोप्लेट्स के समान प्रभावशीलता पाई। चूंकि ब्लैक माइक्रोप्लेट्स उच्च लागत से जुड़े होते हैं, यह बड़े पैमाने पर उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग परियोजनाओं के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ है।

हमने यीस्ट के सीएलएस पर उनके प्रभाव को पुन: उत्पन्न करके रैपामाइसिन प्रशासन और कैलोरी प्रतिबंध [10-16] जैसे ज्ञात एंटी-एजिंग हस्तक्षेपों के साथ अपनी विकसित पद्धति को मान्य किया। ये नतीजे बताते हैं कि हमारी पद्धति नए एंटी-एजिंग हस्तक्षेपों की पहचान करने के लिए प्रभावी है। हमने नए एंटी-एजिंग यौगिकों की पहचान करने के लिए रासायनिक एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए अपने नए विकसित प्रोटोकॉल का उपयोग किया है (चित्र 8)। हमने यीस्ट के सीएलएस को बढ़ाने वाले 2,{7}}एनहाइड्रो-डी-मैनिटोल (2,5-AM) की पहचान की। हमारे परिणामों के आधार पर, हम व्यक्तिगत रूप से या अन्य एंटी-एजिंग हस्तक्षेपों के साथ संयोजन में 2,{13}}AM के उपयोग का सुझाव देते हैं।

2,5-AM फ्रुक्टोज का एक एनालॉग है, और दोनों शर्करा ग्लाइकोलाइटिक मार्ग में प्रवेश कर सकते हैं। ग्लाइकोलाइसिस एक चयापचय प्रक्रिया है जिसमें ग्लूकोज को पहले हेक्सोकाइनेज द्वारा फॉस्फोराइलेट करके ग्लूकोज {2}}फॉस्फेट (जी6पी) बनाया जाता है। फॉस्फोग्लुकोइसोमेरेज़ G6P को फ्रुक्टोज -6-फॉस्फेट (F6P) में परिवर्तित करता है जिसे आगे विभिन्न डाउनस्ट्रीम ग्लाइकोलाइटिक मध्यवर्ती में चयापचय किया जाता है, जिसमें पाइरूवेट भी शामिल है जो माइटोकॉन्ड्रियल TCA चक्र में प्रवेश करता है। ग्लूकोज की तरह, फ्रुक्टोज को भी F6P बनाने के लिए हेक्सोकाइनेज द्वारा फॉस्फोराइलेट किया जाता है। फॉस्फोफ्रुक्टोकिनेस F6P को फ्रुक्टोज -1, 6-बिस्फोस्फेट (FBP) में परिवर्तित करता है, जिसे आगे विभिन्न डाउनस्ट्रीम ग्लाइकोलाइटिक मध्यवर्ती में चयापचय किया जाता है। 2,5-AM को हेक्सोकाइनेज द्वारा फॉस्फोराइलेट करके 2,{{14}AM- 6-फॉस्फेट (2,5-AM6P) [39-41] बनाया जा सकता है। इसके अलावा, फ़ॉस्फ़ोफ़्रुक्टोकिनेज़ 2,5-AM6P को 2,{25}}AM- 1,{27}}बिस्फोस्फेट (2,5-AMBP) में परिवर्तित करता है। हालाँकि, 2,5-AMBP को आगे चलकर डाउनस्ट्रीम ग्लाइकोलाइटिक मध्यवर्ती [39-41] में चयापचय नहीं किया जा सकता है।

चूँकि 2,{1}}AM एक फ्रुक्टोज एनालॉग है, इसलिए हमने जांच की कि क्या फ्रुक्टोज भी यीस्ट के जीवनकाल को बढ़ा सकता है। हालाँकि, हमने यीस्ट के सीएलएस को बढ़ाने में फ्रुक्टोज की एंटी-एजिंग गतिविधि नहीं देखी। मैनिटोल और माल्टोज़ भी ग्लाइकोलाइसिस में प्रवेश कर सकते हैं और डाउनस्ट्रीम ग्लाइकोलाइटिक मध्यवर्ती में चयापचय कर सकते हैं। हमने यीस्ट के जीवनकाल पर मैनिटॉल और माल्टोज़ के प्रभाव की भी जांच की। फ्रुक्टोज़, मैनिटोल और माल्टोज़ भी यीस्ट के सीएलएस को बढ़ाने में असमर्थ हैं।

सोर्बिटोल के रूप में, एक और अभी तक गैर-चयापचयित चीनी को पहले बहुत उच्च सांद्रता (18 प्रतिशत 1 एम के बराबर) [20, 45] पर सीएलएस को प्रभावित करने की सूचना मिली थी, हम यह स्पष्ट करना चाहते थे कि क्या 2, {{7) की एंटी-एजिंग गतिविधि है }}एएम संस्कृति माध्यम की बढ़ी हुई परासारिता के कारण हो सकता है। हमारे प्रयोगों से पता चला है कि सोर्बिटोल कम सांद्रता पर यीस्ट के सीएलएस को बढ़ाने में विफल रहता है जो 2,{9}} AM के मामले में प्रभावी होता है। चूंकि सोर्बिटोल को यीस्ट के सीएलएस को बढ़ाने के लिए उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है, 2,5-AM का एंटी-एजिंग तंत्र ऑस्मोलेरिटी प्रभावों से स्वतंत्र है। इन निष्कर्षों से पता चला कि 2,5-AM की एंटी-एजिंग गतिविधि विशिष्ट है और समान रासायनिक संरचनाओं वाले कई अन्य एनालॉग्स के समान नहीं है।

हालाँकि, 2,{1}}AM जीवनकाल कैसे बढ़ाता है, इसकी जांच की जानी बाकी है। यह जांचना दिलचस्प होगा कि क्या 2,5-AM सीधे तौर पर उम्र बढ़ने के लक्षणों को नियंत्रित करता है [8]। TORC1 और AMPK उम्र बढ़ने की प्रक्रिया में शामिल ग्लूकोज-सेंसिंग कॉम्प्लेक्स हैं [32, 43]। हालाँकि, जब AMPK बाधित होता है तो TORC1 के निषेध द्वारा बढ़ाया गया कालानुक्रमिक जीवनकाल कम हो जाता है। ग्लूकोज और ग्लाइकोलाइटिक मध्यवर्ती TORC1 और AMPK [34, 46, 47] की गतिविधि को नियंत्रित करते हैं। 2,5-एएमबीपी को एल्डोलेज़ की गतिविधि को रोकने के लिए दिखाया गया है जो एफबीपी को ग्लिसराल्डिहाइड -3-फॉस्फेट (जी3पी) और डायहाइड्रॉक्सीएसीटोन फॉस्फेट (डीएचएपी) में परिवर्तित करता है [39, 40]। डीएचएपी को ट्रायोज़फॉस्फेट आइसोमेरेज़ द्वारा जी3पी में परिवर्तित किया जाता है। हाल के साक्ष्य बताते हैं कि डीएचएपी महत्वपूर्ण ग्लूकोज सिग्नल अणु है जो टीओआरसी1 [48] को सक्रिय करता है।

जब G3P और DHAP संश्लेषण प्रभावित होता है तो ग्लाइकोलाइटिक फ़क्स से समझौता हो जाता है, जिससे ATP उत्पादन कम हो जाता है। दिलचस्प बात यह है कि एएमपीके तब सक्रिय होता है जब कोशिकाओं की ऊर्जा स्थिति से समझौता किया जाता है और टीओआरसी1 [46, 47] को रोककर कोशिका वृद्धि को रोकता है। इस प्रकार, एएमपीके और टीओआरसी1 का विरोधी संबंध स्वस्थ कोशिकाओं के लिए सेलुलर होमियोस्टैसिस संतुलन सुनिश्चित करने के लिए एक कुशल चयापचय अनुकूलन है। हालाँकि, हमने कोशिका वृद्धि पर 2,{6}}AM का प्रभाव नहीं देखा (चित्र 6 और 7)। इन निष्कर्षों ने किसी भी ग्लूकोज प्रतिबंध प्रभाव को खारिज कर दिया जो कोशिका वृद्धि (छवि 5) से समझौता करता है, हालांकि, धीमी वृद्धि वाले फेनोटाइप के साथ जीवनकाल बढ़ाया गया है [49]। हालाँकि, रैपामाइसिन द्वारा जीवनकाल के विस्तार के लिए कोशिका वृद्धि की तुलना में अधिक खुराक की आवश्यकता नहीं होती है (चित्र 4)। इसलिए, हम TORC1/AMPK के माध्यम से या TORC1/AMPK से स्वतंत्र रूप से 2,{14}}AM की एंटी-एजिंग गतिविधि की संभावना को बाहर नहीं कर सकते।

एल्डोलेज़ पर 2,5-एएमबीपी के निरोधात्मक प्रभाव के विपरीत, यह पाइरूवेट काइनेज, अंतिम ग्लाइकोलाइसिस एंजाइम [39-41] को सक्रिय करने की सूचना है। पाइरूवेट काइनेज फॉस्फोएनोलपाइरूवेट को पाइरूवेट में बदलने को उत्प्रेरित करता है, जो एनएडी प्लस (निकोटिनमाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड) उत्पन्न करने के स्रोतों में से एक है। एनएडी प्लस एक महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट है जो कई सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है और स्वस्थ कोशिकाओं को बनाए रखने और जीवनकाल बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण कार्य करता है [50, 51]। पाइरूवेट माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिक्रियाओं के लिए प्रमुख सब्सट्रेट भी है, जो अनिवार्य रूप से कोशिका अस्तित्व और स्वस्थ उम्र बढ़ने के लिए अमीनो एसिड, न्यूक्लिक एसिड और एटीपी सहित महत्वपूर्ण तत्वों को संश्लेषित करने के लिए विभिन्न बिल्डिंग ब्लॉक मेटाबोलाइट्स उत्पन्न करता है [52-55]। दरअसल, माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि में गिरावट उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित बीमारियों से जुड़ी है [53-56]। हाल ही में, 2,5-AM को तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) कैंसर के इलाज के लिए संभावित चिकित्सीय के रूप में प्रस्तावित किया गया है [57]।

एक साइड नोट के रूप में, हमने वर्डप्ले "अचार" को ध्यान में रखते हुए अपनी नई पद्धति का नाम PICLS (PI-आधारित CLS पद्धति) रखा है। जबकि हमारे नए प्रोटोकॉल के सभी तत्वों को पहले से ही कहीं और स्वतंत्र रूप से वर्णित किया गया है, उनका "किण्वित" संयोजन माप को सरल और सस्ता बनाता है, और अंततः उच्च-थ्रूपुट-तैयार बनाता है।

निष्कर्ष में, हमने यीस्ट के कालानुक्रमिक जीवनकाल को मापने के लिए एक मात्रात्मक विधि विकसित की है और 2,5-AM को एक नवीन एंटीएजिंग यौगिक के रूप में पहचाना है। वर्तमान में 2,{4}}AM की उम्र-विरोधी गतिविधि के तंत्र की जांच के लिए एक अध्ययन चल रहा है।

सामग्री और तरीके

यीस्ट स्ट्रेन, मीडिया और रसायन

इस अध्ययन में प्रोटोट्रॉफ़िक CEN.PK113-7D स्ट्रेन आनुवंशिक पृष्ठभूमि का उपयोग किया गया था [35, 36]। मानक-समृद्ध माध्यम वाईपीडी (1 प्रतिशत बैक्टो यीस्ट अर्क, 2 प्रतिशत बैक्टो पेप्टोन, और 2 प्रतिशत ग्लूकोज), वाईपीडी अगर (2.5 प्रतिशत बैक्टो अगर), और सिंथेटिक परिभाषित (एसडी) माध्यम जिसमें अमोनियम सल्फेट के साथ 6.7 ग्राम/एल यीस्ट नाइट्रोजन बेस होता है। अमीनो एसिड (डीआईएफसीओ) और 2 प्रतिशत ग्लूकोज के बिना। रैपामाइसिन (एंज़ो) स्टॉक समाधान डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (सिग्मा) में तैयार किया गया था। किसी भी परख में डीएमएसओ की अंतिम सांद्रता 1 प्रतिशत से अधिक नहीं थी। 2,5-एनहाइड्रो-डी-मैनिटोल (सांता क्रूज़), डी-फ्रुक्टोज (सिग्मा), डी-मैनिटोल (सिग्मा), डी-माल्टोज (सिग्मा), और डी-सोर्बिटोल (सिग्मा) कार्यशील सांद्रता द्वारा ताजा तैयार किया गया पाउडर को सीधे माध्यम में घोलकर निष्फल फ़िल्टर करें।

यीस्ट वृद्धि की स्थितियाँ

वाईपीडी एगर माध्यम पर 3{4}} डिग्री पर जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से यीस्ट स्ट्रेन बरामद किया गया। यीस्ट को एसडी माध्यम में रात भर 30 डिग्री पर 220 आरपीएम पर हिलाकर उगाया गया। कालानुक्रमिक जीवनकाल प्रयोग शुरू करने के लिए रात भर में विकसित कोशिकाओं को ताजा एसडी माध्यम में OD600nm~0.2 तक पतला किया गया।

कालानुक्रमिक जीवनकाल विश्लेषण

जैसा कि पहले बताया गया है, कालानुक्रमिक जीवन काल (सीएलएस) प्रयोग कुल 2{8}}{{10}} µL यीस्ट कल्चर के साथ कुल प्लेटों में किए गए थे [58]। सेलुलर इनोकुलम को रैपामाइसिन की क्रमिक रूप से दोगुनी-पतली सांद्रता (0-10 एनएम) युक्त 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित किया गया था। कैलोरी प्रतिबंध परख के लिए, सेलुलर इनोकुलम को एसडी माध्यम में 2 प्रतिशत, 0.5 प्रतिशत और 0.25 प्रतिशत ग्लूकोज युक्त तैयार किया गया था और अच्छी तरह से प्लेटों में स्थानांतरित किया गया था। इसी तरह, सेलुलर इनोकुलम को 2,{18}}एनहाइड्रो-डी-मैनिटोल, डी-फ्रुक्टोज, डी-मैनिटोल, की क्रमिक रूप से दोगुनी-पतली सांद्रता (0-8 मिमी) युक्त अच्छी प्लेटों में स्थानांतरित किया गया था। डी-माल्टोज़, और डी-सोर्बिटोल। कोशिकाओं को 30 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया और वृद्धि को अलग-अलग समय बिंदुओं पर मापा गया। सीएलएस परख के लिए विकास समय बिंदु 72 घंटे को 1 दिन माना गया था। कोशिका अस्तित्व को तीन अलग-अलग दृष्टिकोणों द्वारा विभिन्न आयु समय बिंदुओं पर निर्धारित किया गया था: (i) प्रोपीडियम आयोडाइड प्रतिदीप्ति-आधारित विधि, (ii) YPD तरल माध्यम में वृद्धि, और (iii) स्पॉटिंग परख।

(i) प्रोपिडियम आयोडाइड प्रतिदीप्ति-आधारित विधि:प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) प्रतिदीप्ति-आधारित दृष्टिकोण विकसित करने की विस्तृत प्रक्रियाएं परिणाम अनुभाग में उल्लिखित हैं। सीएलएस परख के लिए, अलग-अलग उम्र के समय बिंदुओं पर μl यीस्ट कोशिकाओं को दूसरी 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित किया गया। कोशिकाओं को धोया गया और अंधेरे में 15 मिनट के लिए PI (5 μg/ml) के साथ 100 μl 1×PBS में इनक्यूबेट किया गया। मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों का नियंत्रण शामिल किया गया था। सकारात्मक नियंत्रण (कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 100 डिग्री पर उबाला गया) पीआई-सना हुआ था और उसी 96- वेल प्लेट में संसाधित किया गया था। पीआई-सना हुआ कोशिकाओं के बिना नमूने नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करते हैं। ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को धोया गया और 100 μl पीबीएस में पुनः निलंबित कर दिया गया। नमूने की प्रतिदीप्ति रीडिंग (535 एनएम पर उत्तेजना, 617 एनएम पर उत्सर्जन) और OD600nm को माइक्रोप्लेट रीडर (बायोटेक) द्वारा मापा गया था। प्रत्येक नमूने की प्रतिदीप्ति तीव्रता OD600nm के साथ सामान्यीकृत की गई थी। प्रत्येक नमूने की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता को बिना दाग वाले नकारात्मक नमूने के पृष्ठभूमि संकेत से घटा दिया गया था। सकारात्मक नियंत्रण नमूने (उबली हुई मृत कोशिकाओं) की प्राप्त प्रतिदीप्ति तीव्रता को 0 प्रतिशत कोशिका अस्तित्व माना गया। हमने कोशिका की मृत्यु की पुष्टि की और उसे माध्यम में बढ़ने की अनुमति दी। कोशिका अस्तित्व ओ विभिन्न आयु समय बिंदुओं के नमूनों की गणना एक सकारात्मक नियंत्रण नमूने (उबले हुए कोशिकाओं) के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता को सामान्य करके की गई थी।

जहां Iij(535nm∕617nm) प्लेट निर्देशांक i और j के साथ कुएं पर 535 एनएम पर उत्तेजना और 617 एनएम पर उत्सर्जन के साथ मापी गई फ्लोरोसेंट तीव्रता है, आईडी(535nm∕617nm) 100 प्रतिशत मृत कोशिका के लिए मापी गई फ्लोरोसेंट तीव्रता है पीआई से सना हुआ कोशिकाएं, आईसी (535एनएम∕617एनएम) पीआई के बिना कोशिकाओं के लिए मापा गया फ्लोरोसेंट तीव्रता है, और संबंधित ओडी मान कोशिकाओं की संख्या के लिए सामान्यीकरण 600 एनएम पर संबंधित कोशिकाओं के लिए मापा गया अवशोषण है।

(ii) वाईपीडी तरल माध्यम में वृद्धि:विभिन्न आयु समय बिंदुओं के यीस्ट स्थिर कल्चर (3-μL) को 200μL YPD माध्यम वाली दूसरी 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित किया गया और 30 डिग्री पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। वृद्ध कोशिकाओं की वृद्धि (OD600nm) को माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा मापा गया था। जैसा कि पहले वर्णित है [19, 20, 58] प्रत्येक आयु बिंदु के लिए कोशिका अस्तित्व की मात्रा 1 दिन (100 प्रतिशत कोशिका अस्तित्व मानी जाती है) के सापेक्ष निर्धारित की गई थी।

(iii) स्पॉटिंग परख:विभिन्न आयु समय बिंदुओं के यीस्ट स्थिर संस्कृति (3 μL) को वाईपीडी एगर प्लेट पर देखा गया और 30 डिग्री पर 48 घंटे तक इनक्यूबेट किया गया। वाईपीडी एगर प्लेट पर वृद्ध कोशिकाओं की वृद्धि को बायोरैड जेलडॉक इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके चित्रित किया गया था।

डेटा विश्लेषण

ग्राफपैड प्रिज्म v.9.3.1 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सभी परिणामों जैसे माध्य मान, मानक विचलन, सहसंबंध (आर 2), महत्व और रेखांकन का सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। परिणामों की सांख्यिकीय रूप से तुलना सामान्य एक-तरफ़ा एनोवा और दो-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके की गई, जिसके बाद डननेट के पोस्ट हॉक परीक्षण या सिडक के पोस्ट हॉक परीक्षण द्वारा गुणकों की तुलना की गई। सभी ग्राफ़ प्लॉट में, P मान को *P के रूप में दिखाया गया है<0.05,  **P<0.01, ***P<0.001, and ****P<0.0001 were considered significant. n.s, non-significant.

स्वीकृतियाँलेखक के एमए और एफई दो पेटेंट आवेदनों (10202201534पी और 10202201536यू) के आविष्कारक हैं जिनमें इस पेपर में वर्णित कार्य का हिस्सा शामिल है।

लेखक का योगदानएमए ने परियोजना की कल्पना की, प्रयोग किए और डेटा का विश्लेषण किया। एफई ने परियोजना की सह-कल्पना की, डेटा का मूल्यांकन किया और एक रणनीति तैयार की। एमए और एफई ने पेपर लिखा, और सभी लेखकों ने पेपर की समीक्षा की और इसके अंतिम संस्करण पर सहमति व्यक्त की।

अनुदानइस कार्य को बायोइनफॉरमैटिक्स इंस्टीट्यूट (बीआईआई), ए*स्टार कैरियर डेवलपमेंट फंड (सी210112008), और ग्लोबल हेल्दी लॉन्गविटी कैटलिस्ट अवार्ड्स अनुदान (एमओएच-000758–00) द्वारा समर्थित किया गया था।

घोषणाओं

प्रतिस्पर्धी रुचियांलेखक गण घोषित करते हैं कि कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

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संदर्भ

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