रेनल फाइब्रोजेनेसिस का कार्यक्रम ऑक्सीडेटिव चयापचय को विनियमित करने वाले माइक्रोआरएनए द्वारा नियंत्रित किया जाता है

संपर्क करना:joanna.jia@wecistanche.com/ व्हाट्सएप: 008618081934791

वर्निका मिगुएला,*, रिकार्डो रामोस, लौरा गार्सिया-बरमेजॉब, डिएगो रोड्रिग्ज-पुयोलक, डी

सैंटियागो लमेसा,**

शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं का एक कार्यक्रम, Centro de Biología आण्विक "सेवरो ओचोआ" (CSIC-UAM), 28049, मैड्रिड, स्पेन

बी जीनोमिक सुविधा, Parque Científico de मैड्रिड, मैड्रिड, स्पेन

सी पैथोलॉजी विभाग, अस्पताल यूनिवर्सिटीरियो "रामन वाई काजल", आईआरवाईसीआईएस, मैड्रिड, स्पेन

डी डिपार्टमेंट ऑफ मेडिसिन एंड मेडिकल स्पेशिएलिटीज, यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल का रिसर्च फाउंडेशन "प्रिंसिपे डे ऑस्टुरियस," IRYCIS, यूनिवर्सिडैड डी अल्कालास, अल्कलैस डी हेनारेस, मैड्रिड, स्पेन

कीवर्ड: MicroRNAS, किडनी फाइब्रोसिस, फैटी एसिड ऑक्सीकरण, एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स, CPT1A, माइटोकॉन्ड्रिया

गुर्दे के कार्य के लिए सिस्टैंच शरीर सौष्ठव बहुत अच्छा है

A B S T R A C T

बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) का अत्यधिक संचय फाइब्रोटिक रोगों की पहचान है। गुर्दे में, यह प्रचलित बीमारियों का अंतिम आम मार्ग है, जिससे पुरानी गुर्दे की विफलता होती है। जबकि टीजीएफ जैसे साइटोकिन्स- मायोफिब्रोब्लास्ट परिवर्तन में एक मौलिक भूमिका निभाते हैं, हाल के काम से पता चला है कि माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और दोषपूर्ण फैटी एसिड ऑक्सीकरण (एफएओ), जो वृक्क ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के लिए ऊर्जा के मुख्य स्रोत से समझौता करते हैं, को मौलिक योगदानकर्ता होने का प्रस्ताव दिया गया है। गुर्दे की फाइब्रोसिस के विकास और प्रगति के लिए। MicroRNAs (miRNAs), जो जीन अभिव्यक्ति को ट्रांसक्रिप्शनल रूप से नियंत्रित करते हैं, को वृक्क फाइब्रोजेनेसिस नियंत्रित करने के लिए सूचित किया गया है। वृक्क फाइब्रोसिस के चयापचय विचलन में शामिल miRNAs की पहचान करने के लिए, हमने एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध (UUO) के माउस मॉडल में miRNA सरणी स्क्रीन का प्रदर्शन किया। MiR-150-5p और miR-495-3p को मानव विकृति विज्ञान से उनके लिंक, माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय में उनकी भूमिका और फैटी एसिड शंटिंग एंजाइम CPT1A के उनके लक्ष्यीकरण के लिए चुना गया था। हमने UUO और फोलिक एसिड-प्रेरित नेफ्रोपैथी (FAN) मॉडल दोनों में क्रमशः 2- और 4- miR-150-5p और miR-495-5p का फोल्ड अपग्रेडेशन पाया। , जबकि TGF - 1 ने मानव वृक्क ट्यूबलर एपिथेलियल सेल लाइन HKC -8 में अपने भावों को अपग्रेड किया। इन miRNAs ने TGF के साथ तालमेल किया- फाइब्रोसिस से जुड़े मार्करों Acta2, Col 1 1, और Fn1 को बढ़ाकर इसके प्रो-फाइब्रोोटिक प्रभाव के बारे में। जैव-ऊर्जा विज्ञान अध्ययनों ने दोनों miRNAs की उपस्थिति में HKC-8 कोशिकाओं में FAO- संबद्ध ऑक्सीजन खपत दर (OCR) में कमी दिखाई। लगातार, उनके माइटोकॉन्ड्रियल-संबंधित लक्ष्य जीन CPT1A, PGC1 और माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिलेखन कारक A (TFAM) के अभिव्यक्ति स्तर, इन miRNAs के संपर्क में आने वाले वृक्क उपकला कोशिकाओं में आधे से कम हो गए थे। इसके विपरीत, हमने माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान और ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता (ΔѰm) या माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड रेडिकल आयनों के उत्पादन में परिवर्तन का पता नहीं लगाया। हमारा डेटा समर्थन करता है कि miR-150 और miR- 495 ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाओं में गंभीर रूप से शामिल चयापचय विफलता को बढ़ाकर वृक्क फाइब्रोजेनेसिस में योगदान कर सकते हैं, जो अंततः फाइब्रोसिस की ओर ले जाता है।

1 परिचय

क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) एक नैदानिक ​​स्थिति है जहां गुर्दे की कार्यक्षमता में कमी बनी रहती है। इसे आमतौर पर अपरिवर्तनीय और प्रगतिशील माना जाता है। यह एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या का प्रतिनिधित्व करता है जो सामान्य आबादी के 12-14 प्रतिशत को प्रभावित कर सकता है [1]। यह मधुमेह मेलिटस और उच्च रक्तचाप जैसे अत्यधिक प्रचलित विकृति वाले लगभग 30-40 प्रतिशत रोगियों में मौजूद हो सकता है, जहां यह विकास और पूर्वानुमान को निर्धारित करने में योगदान देता है। रोग के एटियलजि के बावजूद, सीकेडी की प्रगति ट्यूबल-इंटरस्टिशियल और ग्लोमेरुलर फाइब्रोसिस [2] की ओर ले जाती है। ट्यूबलो-इंटरस्टिशियल फाइब्रोसिस में मैट्रिक्स प्रोटीन (ईसीएम) (मुख्य रूप से कोलेजन टाइप I और III और फाइब्रोनेक्टिन) के जमाव के माध्यम से ट्यूबलर बेसमेंट मेम्ब्रेन और पेरिटुबुलर केशिकाओं के बीच की जगह का विस्तार होता है, जो भड़काऊ कोशिकाओं, ट्यूबलर सेल लॉस और मायोफिब्रोब्लास्ट संचय के साथ होता है। [3]।

ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर- (TGF-) को एक महत्वपूर्ण सर्वव्यापी प्रो-फाइब्रोोटिक साइटोकाइन और फाइब्रोसिस [4] में मायोफिब्रोब्लास्ट भेदभाव का मास्टर नियामक माना जाता है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि फैटी एसिड ऑक्सीकरण (एफएओ) में एक वैश्विक दोष, जिससे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के लिए ऊर्जा के मुख्य स्रोत में समझौता होता है, गुर्दे की फाइब्रोसिस [5,6] के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। TGF- एक SMAD3-और PGC1A-निर्भर तरीके से FAO को दबाता है, इसलिए CPT1A [5] सहित फैटी एसिड तेज और ऑक्सीकरण के ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों को प्रभावित करता है। एफएओ में परिवर्तन के परिणामस्वरूप अंत में अंतःकोशिकीय लिपिड संचय और एटीपी की कमी होती है, जिससे फाइब्रोसिस [5,7] हो जाता है। इस प्रकार, सीकेडी में काम कर रहे चयापचय विचलन को बहाल करने के उद्देश्य से रणनीति चिकित्सीय विकल्प प्रदान कर सकती है [8]।

MicroRNAs (miRNAs) पोस्टट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन पर अपनी कार्रवाई के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति के महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में उभरे हैं। गुर्दे में, miRs को नेफ्रोजेनेसिस, होमियोस्टेसिस और बीमारी [9] में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हुए दिखाया गया है। MiRNAs फाइब्रोटिक प्रक्रियाओं को विनियमित करने में भी सक्षम हैं और उन्हें "फाइब्रोसिस" [10] कहा गया है। इसके अलावा, रीनल फाइब्रोजेनेसिस [11] को रोकने या वापस लाने के लिए एक प्रभावी चिकित्सा की कमी के कारण, miRNA मिमिक या इनहिबिटर की विवो डिलीवरी द्वारा miRNA अभिव्यक्ति के हेरफेर को CKD [12] के लिए एक आशाजनक चिकित्सीय रणनीति के रूप में प्रस्तावित किया गया है। इसके अलावा, परिसंचारी miRNAs नैदानिक ​​​​और यहां तक ​​​​कि रोगसूचक बायोमार्कर [13] का गठन कर सकते हैं।

किडनी फाइब्रोसिस का MiRNA की मध्यस्थता नियंत्रण मुख्य रूप से TGF के नियमन के माध्यम से होता है - 1 सेल-निर्भर और संदर्भ-निर्भर तरीके से सिग्नलिंग, स्मॉड पाथवे को मुख्य लक्ष्यों में से एक के रूप में उपयोग करता है [14]। पिछले काम में, हमने कई miRNAs की पहचान की है जो विशिष्ट चयापचय मार्गों [15,16] को विनियमित करके वृक्क फाइब्रोसिस पर प्रभाव डालते हैं। MiR की अति-अभिव्यक्ति -9-5p ट्यूबलर एपिथेलियल रीनल सेल डी-डिफरेंशियल को रोकता है और फाइब्रोसिस से संबंधित मेटाबॉलिक डिरेंजमेंट [16] को रिप्रोग्राम करता है, जबकि miR-33 के कार्य की हानि, या तो आनुवंशिक या औषधीय, परिणाम में वृद्धि एफएओ और ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं में लिपिड संचय की रोकथाम। यह बढ़ी हुई ऊर्जा आपूर्ति, बेहतर माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनेरगेटिक्स और प्रायोगिक रीनल फाइब्रोसिस [15] की रोकथाम से जुड़ा है। इस प्रकार, सेलुलर बायोएनेरगेटिक्स को विनियमित करने वाले miRNAs भी वृक्क फाइब्रोजेनेसिस को विनियमित करने में सक्षम हैं। इस अध्ययन में, हमने चयापचय पथों के संशोधन के माध्यम से वृक्क फाइब्रोटिक फेनोटाइप में शामिल miRNAs की पहचान करने के लिए एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध (UUO) क्रोनिक किडनी चोट मॉडल में miRNA सरणी-आधारित रणनीति को नियोजित किया है। कई माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन-संबंधित जीन (CPT1A, TFAM, PGC1A) का चयन करके, हमने miR-150 और miR-495 दोनों को miRNAs के रूप में पहचाना जो FAO- संबंधित ऑक्सीजन खपत दर (OCR) को कम करने और TGF को बढ़ावा देने में सक्षम हैं। {21}}मानव रीनल ट्यूबलर एपिथेलियल सेल लाइन एचकेसी में प्रेरित फाइब्रोजेनिक परिवर्तन-8। हमारे निष्कर्ष वृक्क फाइब्रोजेनेसिस में शामिल माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय नियामकों के रूप में miRNAs के महत्व को उजागर करते हैं।

2. सामग्री और तरीके

सेल लाइन और संस्कृति शर्तें। मानव वृक्क समीपस्थ ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (HKC -8) को DMEM/F12 (Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम 1:1 (v/v)) (कॉर्निंग, न्यूयॉर्क, NY) में 15 मिमी HEPES, 5 प्रतिशत के साथ पूरक किया गया था। (वॉल्यूम/वॉल्यूम) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)

(HyClone Laboratories, Logan, UT), 1x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) (गिब्को, रॉकविल, MD), 0.5 ug/ml हाइड्रोकार्टिसोन (सिग्मा, सेंट लुइस, MO), 50 यूनिट/ एमएल पेनिसिलिन और 50 ug/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन (गिब्को, रॉकविल, एमडी) 37◦C और 5 प्रतिशत CO2 पर। यह सेल लाइन कृपया डॉ. सुज़तक की प्रयोगशाला (फिलाडेल्फिया, पेंसिल्वेनिया, यूएसए) द्वारा प्रदान की गई थी। मानव पुनः संयोजक 10 एनजी/एमएल टीजीएफ - 1 (आर एंड डी सिस्टम्स, मिनियापोलिस, एमएन) के साथ उपचार 12 घंटे के लिए एचकेसी -8 कोशिकाओं के सीरम-मुक्त भुखमरी के बाद किया गया था।

अभिकर्मक प्रक्रिया। कोशिकाओं को 70 प्रतिशत के संगम तक पहुंचने के लिए 60 मिमी संस्कृति व्यंजन में रखा गया था। उन्हें miR-150, miR-495, या mirVana™ miRNA मिमिक नेगेटिव कंट्रोल (एंबियन कंपनी, यूएसए) के 40 nM के साथ लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। . कोशिकाओं को लिपोफ़ेक्टामाइन-प्री-miRNA 37 C के साथ 6 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। इसके बाद, 10 प्रतिशत एफबीएस युक्त 5 मिलीलीटर ताजा माध्यम को संस्कृति व्यंजनों में जोड़ा गया, और बाद के प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने तक कोशिकाओं को 6 घंटे तक संस्कृति में बनाए रखा गया। टीजीएफ - 1 उपचार के साथ संयोजन के मामले में, इसे पिछले खंड अनुसार miRNAs overexpression के बाद कोशिकाओं पर लागू किया गया था।

इम्युनोब्लॉट। कोशिकाओं को पीबीएस में धोया गया, समरूप बनाया गया, और 1 0 0 μL RIPA lysis बफर में 150 mM NaCl, 0.1 प्रतिशत SDS, 1 प्रतिशत सोडियम डीओक्सीकोलेट, 1 प्रतिशत NP -40, और 25 mM Tris- में lysed किया गया। एचसीएल पीएच 7.6, प्रोटीज (पूर्ण, रोश डायग्नोस्टिक्स, मैनहेम, जर्मनी) और फॉस्फेटस इनहिबिटर (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ) की उपस्थिति में और स्क्रैपिंग द्वारा काटा गया। प्रत्येक गुर्दे के नमूने का एक चौथाई टुकड़ा (लंबाई और क्रॉसवाइज दोनों में विच्छेदन के बाद प्राप्त) को 300 उल RIPA बफर में 5 मिमी स्टेनलेस स्टील के मोतियों (क्यूजेन, वालेंसिया, सीए) के साथ टिश्यूलिसर एलटी (क्यूजेन, वालेंसिया, सीए) का उपयोग करके कंपन किया गया था। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 50 हर्ट्ज। नमूने 10 पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा स्पष्ट किए गए थे, 000 जी 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। गोली को तब त्याग दिया गया था, और सतह पर तैरनेवाला प्रोटीन लाइसेट के रूप में रखा गया था। प्रोटीन सांद्रता बीसीए प्रोटीन परख किट (थर्मो साइंटिफिक, रॉकफोर्ड, आईएल) द्वारा निर्धारित की गई थी और इसे ग्लोमैक्स®-मल्टी डिटेक्शन सिस्टम (पेमरेगा, मैडिसन, डब्ल्यूआई) में मापा गया था। कुल अर्क से समान मात्रा में प्रोटीन (10-50 कुरूप) को 8-10 प्रतिशत एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जैल पर अलग किया गया और नाइट्रोसेल्यूलोज ब्लोटिंग मेम्ब्रेन (जीई हेल्थकेयर, शिकागो, आईएल) पर 12 वी पर 20 मिनट के लिए अर्ध-शुष्क में स्थानांतरित किया गया। ट्रांस-ब्लॉट टर्बो सिस्टम (बायो-रेड, हरक्यूलिस, कैलिफ़ोर्निया)।

झिल्ली को 1 घंटे के लिए ऊष्मायन द्वारा पीबीएस में 5 प्रतिशत गैर-वसा वाले दूध के साथ अवरुद्ध किया गया था जिसमें 0। {26}}; 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात), -एसएमए (एससी -32251, सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी; 1:1000; 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात), जीएपीडीएच (एमएबी 374, मिलिपोर; 1: 15000; 1 घंटे, कमरे का तापमान ) IRDye 800 बकरी विरोधी खरगोश और IRDye 600 बकरी विरोधी माउस (1:15,000, LI-COR बायोसाइंसेज, लिंकन, NE) माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद, झिल्ली को ओडिसी इन्फ्रारेड इमेजिंग सिस्टम (LI-COR बायोसाइंसेस) के साथ तीन प्रतियों में चित्रित किया गया था। लिंकन, एनई)। ImageJ 1.48 सॉफ्टवेयर (//rsb.info.nih.gov/ij) का उपयोग करके बैंड डेंसिटोमेट्री का प्रदर्शन किया गया और GAPDH को सामान्य करके सापेक्ष प्रोटीन अभिव्यक्ति निर्धारित की गई। नियंत्रण स्थिति के मूल्यों के लिए गुना परिवर्तन सामान्य किए गए थे।

आरएनए निष्कर्षण। निर्माता के निर्देशों के अनुसार miRNeasy Mini Kit (क्यूजेन, वालेंसिया, CA) का उपयोग करके HKC -8 कोशिकाओं या माउस किडनी से कुल RNA निकाला गया। आरएनए मात्रा और गुणवत्ता 260 एनएम पर एक नैनोड्रॉप -1000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (थर्मो साइंटिफिक, रॉकफोर्ड, आईएल) द्वारा निर्धारित की गई थी।

एमआरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण। iScript™ cDNA सिंथेसिस किट (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए) का उपयोग करके कुल आरएनए के 500 एनजी के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) किया गया था। qRT-PCR को iQ™ SYBR ग्रीन सुपरमिक्स (बायो-रेड, हरक्यूलिस, CA) के साथ प्रदर्शित किया गया था, एक 96-अच्छी तरह से बायो-रेड CFX96 RT-PCR सिस्टम का उपयोग करके C1000 थर्मल साइक्लर (बायो-रेड, हरक्यूलिस) के साथ। सीए) निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार। निर्माता द्वारा प्रदान किए गए CFX96 विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक प्रवर्धन वक्र से एक सीटी मान प्राप्त किया गया था। सापेक्ष mRNA व्यंजक 2 - Ct विधि [17] का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। 18S जीन का उपयोग सामान्यीकरण उद्देश्यों के लिए किया गया था। mRNA मात्रा का ठहराव के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर अनुक्रम थे: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGGAA- TAGCCACACGCTCAG), COL1AA1 (FGTCTTGTCTGW), GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGTTGTCC, RV: CCACTCCATGCTCTA), 18 (STGACT: CAAGCAAGCTCTGCTCTA), (सीएटीजीएसीटी: CAAGCAAGCTCTGCTCTA)। नियंत्रण स्थिति के मूल्यों के लिए गुना परिवर्तन सामान्य किए गए थे।

MiRNA अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव। MiRNAs अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव miRCURY लॉक्ड न्यूक्लिक एसिड (LNA) miRCURY LNA RT किट (Exiqon, Feedback, डेनमार्क) का उपयोग करके किया गया था। RT के बाद, cDNA टेम्प्लेट को परिपक्व miR150-5p या miR-495-3p (Exiqon, Feedback, डेनमार्क) के लिए माइक्रोआरएनए-विशिष्ट LNA प्राइमरों का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया था। qRT-PCR को निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार iQ™ SYBR ग्रीन सुपरमिक्स (बायो-रेड, हरक्यूलिस, CA) का उपयोग करके C1000 थर्मल साइक्लर के साथ एक 96-अच्छी तरह से बायो-रेड CFX96 रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम में प्रदर्शित किया गया था। . सीएफएक्स मैनेजर बायो-रेड सॉफ्टवेयर (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए) का उपयोग करके प्रत्येक प्रवर्धन वक्र से तीन प्रतियों के कुओं के लिए एक सीटी मूल्य प्राप्त किया गया था। अंतर्जात नियंत्रण 5S rRNA के लिए सीटी मानों को सामान्य किया गया। प्लाज्मा miRNA का स्तर miR-103a-5p के लिए सामान्यीकृत किया गया। सापेक्ष miRNA व्यंजक 2 - Ct विधि [17] का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। नियंत्रण स्थिति के मूल्यों के लिए गुना परिवर्तन सामान्य किए गए थे।

गुर्दे की फाइब्रोसिस के माउस मॉडल। सभी प्रक्रियाओं के लिए यूरोपीय संघ के नियमों के अनुसार CBMSO में विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (SPF) पशु सुविधा में चूहे रखे गए थे। यूरोपीय संसद के निर्देश 2010/63/ईयू में निहित प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के साथ समझौते में जानवरों को संभाला गया था। मैड्रिड में Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" के स्थानीय नैतिकता समीक्षा बोर्ड, CSIC की एथिक्स कमेटी और Comunidad de मैड्रिड की रेगुलेटरी यूनिट फॉर एनिमल एक्सपेरिमेंटल प्रोसीजर द्वारा स्वीकृति प्रदान की गई थी।

एकतरफा मूत्रवाहिनी बाधा (यूयूओ): यूयूओ सर्जरी प्रक्रिया पहले वर्णित [18] के रूप में की गई थी। संक्षेप में, चूहों को आइसोफ्लुरेन (प्रेरण के लिए 3-5 प्रतिशत और रखरखाव के लिए 1-3 प्रतिशत) के साथ संवेदनाहारी किया गया था और दो प्रायोगिक समूहों में विभाजित किया गया था: यूयूओ समूह और शम ऑपरेशन समूह। यूयूओ समूह में, चूहों को पेट के बाईं ओर मुंडाया गया था, त्वचा के माध्यम से एक स्केलपेल के साथ एक लंबवत चीरा बनाया गया था और त्वचा को वापस ले लिया गया था। गुर्दे को उजागर करने के लिए पेरिटोनियम के माध्यम से दूसरा चीरा लगाया गया था। बाएं मूत्रवाहिनी को सर्जिकल रेशम के साथ वृक्क श्रोणि से 15 मिमी नीचे दो बार लिगेट किया गया था और फिर मूत्रवाहिनी को दो संयुक्ताक्षरों के बीच अलग कर दिया गया था। फिर, लिगेट की गई किडनी को धीरे से उसकी सही शारीरिक स्थिति में वापस रखा गया और तरल पदार्थ के नुकसान को फिर से भरने के लिए बाँझ खारा जोड़ा गया। चीरों को सुखाया गया और चूहों को व्यक्तिगत रूप से बंद कर दिया गया। नकली ऑपरेशन एक समान तरीके से किया गया था लेकिन बिना मूत्रवाहिनी बंधाव के। Buprenorphine का उपयोग एनाल्जेसिक के रूप में किया जाता था। पहली खुराक सर्जरी से पहले 3 0 मिनट और फिर हर 12 घंटे में 72 घंटे के लिए 0.05 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर सूक्ष्म रूप से प्रशासित की गई थी। इस मॉडल में, वृक्क रक्त प्रवाह और ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर 24 घंटे के भीतर काफी कम हो जाती है और अंतरालीय सूजन (2-3 दिनों में चरम पर), ट्यूबलर फैलाव, ट्यूबलर शोष, और फाइब्रोसिस 7 दिनों के बाद स्पष्ट होते हैं। प्रक्रिया के लगभग 2 सप्ताह बाद बाधित किडनी अधिकतम शिथिलता तक पहुंच जाती है। CO2 ओवरडोज़ और नियंत्रण द्वारा चूहे की बलि दी गई और गुर्दे और रक्त के नमूनों को बाधित कर दिया गया और यूयूओ के बाद 3, 5, 7, 10 और 15 दिनों में पीबीएस के साथ छिड़काव के बाद काटा गया।

फोलिक एसिड-प्रेरित नेफ्रोपैथी (एफएएन): इस मॉडल में, किडनी फाइब्रोसिस को इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन द्वारा 25 0 मिलीग्राम फोलिक एसिड (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ) प्रति किलोग्राम शरीर के वजन में भंग कर दिया गया था। 0.3 एम सोडियम बाइकार्बोनेट (वाहन) जैसा कि पहले बताया गया है [19]। नियंत्रण जानवरों को 0.3 मिली वाहन (आईपी) प्राप्त हुआ। CO2 ओवरडोज द्वारा चूहे की बलि दी गई और एफए प्रशासन के 15 दिनों के बाद पीबीएस के साथ छिड़काव के बाद गुर्दे और रक्त के नमूने काटा गया।

माइक्रोआरएनए प्रोफाइलिंग। फाइब्रोटिक परिणाम को विनियमित करने वाले विशिष्ट miRNAs की पहचान करने के लिए, एक कस्टम miRCURY LNA माइक्रोआरएनए सरणी (एक्सिकॉन, फीडबैक, डेनमार्क) को माइक्रोआरएनए प्रोफाइलिंग के लिए मंच के रूप में चुना गया था। इस प्लेटफ़ॉर्म में सेंगर miRBase v22.1 (//microrn a.sanger.ac. UK) में मौजूद माउस miRNAs के लिए विशिष्ट कुल 175 अद्वितीय assays शामिल थे। प्रत्येक माइक्रोआरएनए के लिए, प्रचलित स्ट्रैंड को विश्लेषण के लिए चुना गया था। MiR चयन वृक्क फाइब्रोसिस, माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय, रेडॉक्स प्रक्रियाओं और सर्कैडियन लय से संबंधित अनुमानित लक्ष्य जीन पर आधारित था। यह विश्लेषण अनुक्रम-आधारित miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी, सूक्ष्म जगत [20] (www.Ebi.ac. UK/Enright-SRV/microcosm), Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org/vert{) के लिए जैव सूचना विज्ञान उपकरणों के साथ किया गया था। {9}}/) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de), miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) और miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/)। 7 दिन-यूयूओ गुर्दे के नमूनों से आरएनए निष्कर्षण के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार कुल आरएनए के 20 एनजी में मौजूद miRNA अंश को miRCURY LNA RT किट (एक्सिकॉन, फीडबैक, डेनमार्क) का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के अधीन किया गया था। परिणामी सीडीएनए का विश्लेषण miRCURY miRNA PCR पैनल्स के साथ एक Roche LightCycler 480 रियल-टाइम PCR सिस्टम में miRCURY LNA SYBR ग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स (एक्सिकॉन, फीडबैक, डेनमार्क) का उपयोग करके किया गया था। प्रत्येक नमूने का दो प्रतियों में विश्लेषण किया गया था। यह प्रक्रिया Fundacion Parque Científico de मैड्रिड (मैड्रिड, स्पेन) की जीनोमिक्स सुविधा में की गई थी। LC480 सॉफ्टवेयर का उपयोग प्रत्येक miRNA के लिए Cq मान (Cq) प्राप्त करने के लिए किया गया था। डेल्टा सीटी (ΔCt) मान की गणना अंतर्जात हाउसकीपिंग snRNAU6 में सीटी मानों को सामान्य करके की गई थी। हीट मैप को वास्तविक समय पीसीआर डेटा के साथ Ct के रूप में प्रस्तुत किया गया था। पदानुक्रमित क्लस्टरिंग Ct मानों के अनुसार बनाया गया था। डेल्टा सीटी (ΔΔCt) मूल्य की गणना प्रत्येक बाधित गुर्दे के नमूने के Ct से संदर्भ नमूना समूह (नियंत्रण गुर्दा) के Ct को घटाकर की गई थी। प्रत्येक miRNA का सापेक्ष परिमाणीकरण (RQ) या गुना-परिवर्तन 2 - Ct विधि [17] का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। पैरामीट्रिक लिम्मा परीक्षण द्वारा विभेदित रूप से व्यक्त miRNAs की पहचान की गई। कई परिकल्पनाओं के परीक्षण को ध्यान में रखते हुए, बेंजामिनी-होचबर्ग झूठी खोज दर (एफडीआर) सुधार [25] का उपयोग करके पी-मानों को समायोजित (adj।) किया गया था। परिणाम एक ज्वालामुखी भूखंड में रेखांकन किए गए थे।

सीकेडी रोगियों से रक्त प्लाज्मा में miRNA विश्लेषण। चयनित miRNAs के स्तरों का विश्लेषण 100 CKD रोगियों के एक समूह से प्लाज्मा नमूनों में किया गया, जिसका विवरण नीचे दिया गया है। ईडीटीए स्प्रे-कोटेड वैक्यूटेनर्स (बीडी, फ्रैंकलिन लेक, एनजे) में परिधीय शिरापरक रक्त एकत्र किया गया था। प्लाज्मा प्राप्त करने के लिए, रक्त को 20 मिनट के लिए 4 0 0 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था, सतह पर तैरनेवाला एक नई ट्यूब में स्थानांतरित किया गया था और 20 मिनट के लिए 800 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। प्लाज्मा को एकत्र किया गया और -80 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य में जमे हुए संग्रहीत किया गया। प्लाज्मा miRNA को miRCURYTM RNA आइसोलेशन किट-बायोफ्लुइड्स और UniSp2 स्पाइक-इन RNA (Exiqon, Vedbaeck, डेनमार्क) का उपयोग करके रक्त से निकाला गया। इन नमूनों में miR-150 स्तरों का विश्लेषण miRNA अभिव्यक्ति प्रक्रिया अनुभाग के परिमाणीकरण में वर्णित के रूप में किया गया था। ऑक्सीजन की खपत दर का मापन। फैटी एसिड ऑक्सीकरण-संबंधित ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) (ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण से जुड़ा हुआ) और बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर) (लैक्टेट उत्पादन और ग्लाइकोलाइसिस से जुड़े) का अध्ययन निर्माता के निर्देशों के अनुसार सीहोरस बायोसाइंस चयापचय विश्लेषक का उपयोग करके किया गया था [26]। एचकेसी -8 कोशिकाओं को एक पी 60 प्लेट में रखा गया था और माइक्रोआरएनए ट्रांसफेक्शन ऊपर वर्णित के रूप में किया गया था जब वे 70 प्रतिशत 48 घंटे बाद संगम पर पहुंचे, एचकेसी -8 कोशिकाओं को 10 एनजी / एमएल टीजीएफ के साथ इलाज किया गया {{ 18}} 48 घंटे के लिए। फिर, कोशिकाओं को एक सीहोरसे बायोसाइंस XFe24 सेल कल्चर माइक्रोप्लेट (सीहोरस बायोसाइंस, नॉर्थ बिलरिका, एमए) में 2 × 104 कोशिकाओं प्रति कुएं पर रखा गया। सेल पालन के बाद, विकास माध्यम को सब्सट्रेट-सीमित माध्यम से बदल दिया गया था, डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) को 0.5 मिमी ग्लूकोज और 1 मिमी ग्लूटामेट के साथ पूरक किया गया था। परख माप से एक घंटे पहले, कोशिकाओं को सीओ 2 के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 प्रतिशत कार्निटाइन के साथ पूरक क्रेब्स-हेंसेलिट बफर (केएचबी) परख माध्यम के साथ जोड़ा गया था। परख से पंद्रह मिनट पहले, CPT1 अवरोधक Etomoxir (Eto) (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO) 400 μM को संबंधित कुओं में जोड़ा गया था, और कोशिकाओं को CO2 के बिना 37 C पर ऊष्मायन किया गया था। अंत में, परख से ठीक पहले, बीएसए या 200 माइक्रोन पामिटेट-बीएसए एफएओ सबस्ट्रेट (एगिलेंट टेक्नोलॉजी, सांता क्लारा, सीए, यूएसए) जोड़ा गया था। तुरंत, XF सेल मिटो स्ट्रेस टेस्ट को सीहोरसे XFe24 ऊर्जा विश्लेषक में क्रमिक रूप से माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के कई न्यूनाधिक जोड़कर बनाया गया था। सबसे पहले, एटीपी सिंथेज़ इनहिबिटर ओलिगोमाइसिन (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ) (1 माइक्रोन) का उपयोग बेसल माप के बाद किया गया था। यह ईटीसी के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह को कम करता है, जिसके परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन में कमी आती है। इसके बाद, अनकूपिंग एजेंट साइनाइड 4- (ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (FCCP) (सिग्माएल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO) (3 μM), जो प्रोटॉन ग्रेडिएंट को ध्वस्त करता है और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता को बाधित करता है, जोड़ा गया। नतीजतन, ईटीसी के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह निर्जन है, और जटिल IV द्वारा ऑक्सीजन की खपत अपने अधिकतम तक पहुंच जाती है। तीसरा और अंतिम इंजेक्शन जटिल III और I अवरोधकों एंटी-माइसीन/रोटेनोन (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ) (1 माइक्रोन) का मिश्रण है। यह संयोजन माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को बंद कर देता है और माइटोकॉन्ड्रिया के बाहर की प्रक्रियाओं द्वारा संचालित गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की गणना को सक्षम बनाता है। सबस्ट्रेट्स/इनहिबिटर उसी माध्यम में तैयार किए गए थे जिसमें प्रयोग किया गया था और संकेतित समय पर अभिकर्मक बंदरगाहों से स्वचालित रूप से इंजेक्ट किया गया था। माप 3- मिनट की अवधि (कुल 2 घंटे से अधिक) के लिए दर्ज किए गए थे और कुल प्रोटीन सामग्री के लिए मूल्यों को सामान्य किया गया था। प्रोटीन को 0.1 प्रतिशत एनपी -40- पीबीएस समाधान के साथ कुओं से निकाला गया था और बीसीए प्रोटीन परख (थर्मो साइंटिफिक, रॉकफोर्ड, आईएल) के साथ इसकी मात्रा निर्धारित की गई थी। प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए चार कुओं का उपयोग किया गया था। सीहॉर्स एक्सएफपी सेल मिटो स्ट्रेस टेस्ट का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के प्रमुख मापदंडों को निर्धारित करने के लिए किया गया था: बेसल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन, एटीपी-लिंक्ड श्वसन, प्रोटॉन रिसाव (गैर -- एटीपी-लिंक्ड ऑक्सीजन खपत), अधिकतम श्वसन, गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन , और आरक्षित श्वसन क्षमता, जैसा कि पहले बताया गया है [27]।

लूसिफ़ेरेज़ परख। मानव CPT1A 3′-UTR में miRNA-150 और miRNA-495 उम्मीदवार बाध्यकारी साइटों को चिह्नित करने के लिए, एक लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर परख जिसमें CPT1A 3′-UTR (स्विचगियर जीनोमिक्स, कार्ल्सबैड, सीए, उत्पाद शामिल है) आईडी S814347) का उपयोग किया गया था। अनुमानित miR-150 और miR-495 साइटों के बीज क्षेत्रों में साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन 3′ - UTRs के भीतर मल्टीसाइट-क्विकचेंज निर्देशित उत्परिवर्तजन किट (स्ट्रैटेगीन, ला जोला, सीए) का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। निर्माता के प्रोटोकॉल के लिए। The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CTCATGCGTGTAATCCCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG, RV: CCGCCCGCCTTGGCCTCTAGAAGTGCTGGGATTACACGCATGAG), सभी निर्माणों को यह पुष्टि करने के लिए उपयोग करने से पहले अनुक्रमित किया गया था कि वे उचित संरचना हैं। एचकेसी -8 कोशिकाओं को एपी 24-वेल प्लेट में रखा गया था और 200 एनजी pLightSwitch _ CPT1A _3 ′-UTR (बरकरार या उत्परिवर्तित निर्माण) के साथ क्षणिक रूप से सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। एनजी पीजीएल3-प्रमोटर (एसवी40 प्रमोटर के नियंत्रण में एक जुगनू ल्यूसिफरेज) (पॉमेर्गा कॉर्पोरेशन, मैडिसन, डब्ल्यूआई, यूएसए) रिपोर्टर प्लास्मिड और 40 एनएम या तो मिरवाना ™ miRNA मिमिक ऑफ miR-150, miR -495 या मिरवाना ™ मिमिक नेगेटिव कंट्रोल (एंबियन कंपनी, यूएसए) लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 (इनविट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए) का उपयोग करते हुए जब वे ऊपर वर्णित 70 प्रतिशत के संगम पर पहुँचे। प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए चार कुओं का उपयोग किया गया था। लूसिफ़ेरेज़ assays 24 घंटे बाद डुअल-लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर सिस्टम (Promega, मैडिसन, WI) का उपयोग करके किया गया। वैनिला और जुगनू लूसिफ़ेरेज़ संकेतों का पता एक ग्लोमैक्स मल्टी डिटेक्शन सिस्टम (Promega Corporation, Madison, WI, USA) का उपयोग करके लगाया गया था। जुगनू ल्यूसिफरेज गतिविधि द्वारा रेनिला ल्यूसिफरेज की गतिविधि को सामान्य किया गया था।

माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमएमपी)। एमएमपी में परिवर्तन टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर (टीएमआरएम) प्रतिदीप्ति (इनविट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) में अंतर के रूप में निर्धारित किया गया था। यह नकारात्मक रूप से आवेशित ध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया में जमा हो जाता है और नारंगी में प्रतिदीप्त हो जाता है। जब माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता एपोप्टोटिक या चयापचय रूप से तनावग्रस्त कोशिकाओं में ढह जाती है, तो टीएमआरएम अभिकर्मक पूरे सेल साइटोसोल में फैल जाता है और प्रतिदीप्ति स्तर नाटकीय रूप से गिर जाता है। HKC-8 कोशिकाओं को सुसंस्कृत और ट्रांसफ़ेक्ट किया गया जैसा कि सेल कल्चर और ट्रांसफ़ेक्शन प्रक्रिया अनुभागों में वर्णित है। इसके बाद, विकास माध्यम को फिनोल-रेड फ्री हैंक के बैलेंस्ड साल्ट सॉल्यूशन (HBSS) द्वारा 10 mM हेप्स से बदल दिया गया। 5 मिनट के लिए ओलिगोमाइसिन (5 μM) और FCCP (4 μM) के साथ उपचार सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण स्थितियों के रूप में उपयोग किए गए थे। इसके बाद, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 250 एनएम टीएमआरएम के साथ दाग दिया गया। कोशिकाओं को ट्रिप्सिन, सेंट्रीफ्यूगेड (3 000 आरपीएम, 5 मिनट) के साथ काटा गया और गोली को 200 μL एचबीएसएस में 1 प्रतिशत के साथ फिर से निलंबित कर दिया गया। बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 5 एमएम एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए)। प्रतिदीप्ति तीव्रता को BD FacsCantoTM II सिस्टम (BD Bioscience, San Jos, CA) में TMRM (FL2) [28] के लिए 570 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके प्रवाह cytometry द्वारा मापा गया था और FlowJo 10.2 सॉफ़्टवेयर (FlowJo, LLC, Ashland) के साथ विश्लेषण किया गया था। , या)। प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए, तीन प्रतियों में कम से कम 20,000 एकल का विश्लेषण किया गया।

माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड रेडिकल आयनों का उत्पादन। सुपरऑक्साइड रेडिकल आयनों के उत्पादन का मूल्यांकन मिटो-एसओएक्स™ रेड माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड रेडिकल एनियन इंडिकेटर (इनविट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था, जो कि जीवित कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड रेडिकल आयनों के लिए एक अत्यधिक चयनात्मक फ्लोरोजेनिक डाई है, निर्माता के अनुसार निर्देश। एचकेसी -8 कोशिकाओं को सुसंस्कृत और ट्रांसफ़ेक्ट किया गया जैसा कि सेल कल्चर और ट्रांसफ़ेक्शन प्रक्रिया अनुभागों में वर्णित है। इसके बाद, विकास माध्यम को फिनोल-रेड फ्री हैंक के बैलेंस्ड साल्ट सॉल्यूशन (HBSS) द्वारा 10 mM हेप्स से बदल दिया गया। 5 मिनट के लिए एंटीमाइसिन ए (150 माइक्रोन) और कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफेनिलहाइड्राजोन (सीसीसीपी) (50 माइक्रोन) के साथ उपचार को सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण स्थितियों के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इसके बाद, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 5 μM MitoSOX™ रेड के साथ दाग दिया गया। कोशिकाओं को काटा गया जैसा कि माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित खंड में वर्णित है। प्रतिदीप्ति तीव्रता को बीडी FacsCantoTM II सिस्टम (BD Bioscience, San Jos, CA) में MitoSOX™ Red (FL2) के लिए 580 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापा गया था और FlowJo 10.2 सॉफ़्टवेयर (FlowJo, LLC, Ashland,) के साथ विश्लेषण किया गया था। या)। प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए, तीन प्रतियों में कम से कम 20, 000 एकल का विश्लेषण किया गया।

माइटोकॉन्ड्रियल लेबलिंग। माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री का मूल्यांकन मिटोट्रैकर ™ ग्रीन एफएम (इनविट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था, जो निर्माता के निर्देशों के अनुसार, प्लाज्मा झिल्ली में निष्क्रिय रूप से फैलता है और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता की परवाह किए बिना सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होता है। HKC-8 कोशिकाओं को सुसंस्कृत और ट्रांसफ़ेक्ट किया गया जैसा कि सेल कल्चर और ट्रांसफ़ेक्शन प्रक्रिया अनुभागों में वर्णित है। इसके बाद, विकास माध्यम को फिनोल-रेड फ्री हैंक के बैलेंस्ड साल्ट सॉल्यूशन (HBSS) द्वारा 10 mM हेप्स से बदल दिया गया। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मिटोट्रैकर ™ ग्रीन एफएम के साथ 150 एनएम के साथ दाग दिया गया था। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं को काटा गया था जैसा कि माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित खंड में वर्णित है। प्रतिदीप्ति तीव्रता को BD FacsCantoTM II सिस्टम (BD Bioscience, San Jos, CA) में MitoTracker™ ग्रीन FM (FL1) के साथ 516 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके मापा गया था और FlowJo 10.2 सॉफ़्टवेयर (FlowJo, LLC) के साथ विश्लेषण किया गया था। , एशलैंड, या)। प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए, तीन प्रतियों में कम से कम 20, 000 एकल का विश्लेषण किया गया। प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, नाभिक को आरटी पर 5 मिनट के लिए डीएपीआई (सिग्मा, सेंट लुइस, एमओ) के साथ भी दाग ​​दिया गया था। जीवित कोशिकाओं की कल्पना एक उल्टे Zeiss LSM 710 कन्फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा एक सेल के साथ देखी गई, एक 63X / 1.2 वाटर C-अपो-क्रोमैट कोर UV-VIS-IR M27 उद्देश्य और Zeiss Zen2010B sp1 सॉफ्टवेयर (Zeiss, Oberkochen, जर्मनी) के साथ विश्लेषण किया गया। .

माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिलिपि संख्या निर्धारण। जीनोमिक डीएनए को एचकेसी -8 कोशिकाओं से डीनेसी ब्लड एंड टिश्यू किट (क्यूजेन, वेलेंसिया, सीए) का उपयोग करके निर्माता के निर्देशों के अनुसार निकाला गया था। माइटोकॉन्ड्रियल बहुतायत मानव माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए कॉपी नंबर परख किट (डेट्रायट आर एंड डी, डेट्रायट, एमआई) के साथ निर्धारित की गई थी। सापेक्ष mtDNA प्रतिलिपि संख्या को mtDNA-से-परमाणु डीएनए अनुपात के रूप में प्रस्तुत किया गया था।

मानव सीकेडी रोगी के नमूने। अस्पताल प्रिंसिपे डी ऑस्टुरियस के 100 सीकेडी रोगियों (चरण 3-4) के एक समूह को miRNA प्लाज्मा स्तरों के विश्लेषण के लिए चुना गया था। इसमें 24 महीने की अवधि में जीएफआर एमडीआरडी संकेतक [29] के आधार पर उनके गुर्दे के कार्य के विकास के अनुसार वर्गीकृत दो अलग-अलग उपसमूह शामिल थे: 50 रोगियों ने 10 प्रतिशत से कम प्रस्तुत कियागुर्दाकार्य में गिरावट जबकि उनमें से बाकी ने गुर्दा समारोह में कम से कम 40 प्रतिशत की कमी का अनुभव किया था या शुरू किया थागुर्देरिप्लेसमेंट थेरेपी (डायलिसिस)। हमने फाइब्रोसिस की डिग्री भी निर्धारित कीगुर्दाग्राफ्ट डिसफंक्शन के साथ 26 रोगियों के एक अलग समूह से बायोप्सी निम्नलिखित हैं:गुर्दाअस्पताल रामन वाई काजल से प्रत्यारोपण। सभी बायोप्सी का मूल्यांकन Banff 2007 मानदंड [30] के अनुसार किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण। जहां संकेत दिया गया था, उसे छोड़कर गैर-पैरामीट्रिक परीक्षणों का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। मान-व्हिटनी परीक्षण के साथ दो स्वतंत्र समूहों के बीच अंतर की जांच की गई, जबकि दो से अधिक समूहों की तुलना क्रुस्कल-वालिस परीक्षण से की गई। 0.05 या उससे कम का P-मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था (*/#: P < 0.05,="" **/##:="" p="">< 0.01,="" ***/###:="" पी=""><0.001)। ग्राफपैड="" प्रिज्म="" 6.0="" (ग्राफपैड="" सॉफ्टवेयर,="" ला="" जोला,="" सीए)="" का="" उपयोग="" करके="" डेटा="" का="" विश्लेषण="" किया="" गया="" था।="" डेटा="" को="" माध्य="" ±="" माध्य="" (sem)="" की="" मानक="" त्रुटि="" के="" रूप="" में="" सूचित="" किया="" जाता="">

3। परिणाम

UUO- प्रेरित फाइब्रोटिक में miRNA अभिव्यक्ति डेटागुर्दे. के चयापचय नियमन में miRNAs के योगदान को समझने के लिएगुर्देफाइब्रोजेनेसिस, 7 दिनों के यूयूओ मॉडल को डब्ल्यूटी चूहों में प्रदर्शित किया गया था। आरएनए को नियंत्रण और फाइब्रोटिक . से अलग किया गया थागुर्दानमूने और miRNA अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का एक अनुकूलित माइक्रोआरएनए सरणी में विश्लेषण किया गया था। miRNAs का चयन "इन सिलिको" विश्लेषण (विधियों अनुभाग में अधिक विवरण) के बाद माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय, रेडॉक्स प्रक्रियाओं और सर्कैडियन लय में शामिल प्रमुख एंजाइमों के उनके संभावित लक्ष्यीकरण पर आधारित था। फ़ाइब्रोोटिक और नियंत्रण की तुलना करते समय हीट मैप ने कुछ miRNAs में स्पष्ट रूप से अलग अभिव्यक्ति पैटर्न का खुलासा कियागुर्दानमूने (छवि 1 ए)। ज्वालामुखी प्लॉट विश्लेषण से पता चला है कि 175 miRNAs में से 73 अलग-अलग व्यक्त किए गए थे, 17 अप- और 56 डाउन-रेगुलेटेड, फाइब्रोटिक किडनी के नमूनों में नियंत्रण वाले (छवि 1 बी, अनुपूरक तालिका 1) की तुलना में। उनमें से, विशिष्ट miRNAs का चयन किया गया जो चयापचय मार्गों के माध्यम से गुर्दे में फाइब्रोटिक परिणाम को नियंत्रित कर सकते हैं। उस प्रयोजन के लिए, चयापचय और माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों में शामिल विशिष्ट जीनों के 3′UTR (अनट्रांसलेटेड क्षेत्र) के सिलिको विश्लेषण में, CPT1A, TFAM, PGC1A को तीन स्वतंत्र भविष्यवाणी उपकरण (टारगेटस्कैन, miRWalk और miRanda) के साथ प्रदर्शित किया गया था। चयन मानदंड में गुर्दे की अभिव्यक्ति का स्तर, लक्ष्यों की नवीनता, चयापचय मार्ग पर ज्ञान की डिग्री और जैविक महत्व भी शामिल थे। मानव विकृति विज्ञान से लिंक, गुर्दे के ऊतक अभिव्यक्ति स्तर, माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय में उनकी भूमिका और फैटी एसिड बंद करने वाले एंजाइम CPT1A के उनके संभावित लक्ष्यीकरण ने हमें तीन miRNAs, miR-150-5p, miR-495-3p और पर ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रोत्साहित किया। miR-33-5p, वृक्क फाइब्रोजेनेसिस (छवि 1C) से जुड़े चयापचय परिवर्तनों को विनियमित करने में सक्षम उम्मीदवारों के रूप में। ध्यान दें, CPT1A 3′-UTR में miR-150 के लिए एक सीड साइट और miR-495 के लिए दो सीड साइट शामिल हैं। हमने देखा कि miR-150 और miR-495 ने CPT1A 3′-UTR युक्त एक ल्यूसिफरेज रिपोर्टर परख की गतिविधि को क्रमशः ~ 15 प्रतिशत और 25 प्रतिशत कम कर दिया। miR-150 बाइंडिंग साइट (PM2) के लिए CPT1A के 3′-UTR में पॉइंट म्यूटेशन (PMs) के मामले में इस डाउनरेगुलेशन को पूरी तरह से निरस्त कर दिया गया था और दोनों miR -495 बाइंडिंग साइट्स (PM1) में आंशिक रूप से अनुपस्थित था। और PM3) (सप्लीमेंट्री अंजीर। 1A और B)। ये डेटा CPT1A के miR-150 और miR-495 के साथ सीधे संपर्क का संकेत देते हैं। MiR-33-5p एक अलग अध्ययन का विषय रहा है [15]। MiR-150-5p और miR-495-3p को फाइब्रोटिक किडनी के नमूनों में नियंत्रण वाले की तुलना में अपग्रेड किया गया था, जिसमें 3.69 (P-value: 0। 0) का गुना परिवर्तन था। ) और 1.95 (पी-वैल्यू: 0.012), क्रमशः।

MiR-150 और miR-495 मानव में TGF- प्रोफाइब्रोटिक प्रतिक्रिया को बढ़ाते हैंगुर्देट्यूबलर उपकला कोशिकाएं। मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qRT-PCR) miR-150-5p और miR-495-3p एक्सप्रेशन के परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए किया गया था, जिसे UUO में miRNA एक्सप्रेशन प्रोफाइलिंग द्वारा पहचाना गया था।गुर्दानमूने (छवि 2 ए और बी)। इसके अलावा, qRT-PCR द्वारा UUO प्रक्रिया का विश्लेषण किए जाने के 3, 5, 7, 10 और 15 दिनों के बाद गुर्दे में miR-150-5p और miR- 495-3p अभिव्यक्ति के कैनेटीक्स। इन miRNAs की अभिव्यक्ति UUO के 5 दिनों के बाद 2- गुना बढ़ गई थी और UUO (चित्र 2C और D) के 15 दिन बाद तक बनी रही। इन miRNAs के अभिव्यक्ति स्तर का मूल्यांकन फोलिक एसिड नेफ्रोपैथी (FAN) मॉडल में भी किया गया था। हमने फाइब्रोटिक में क्रमशः 4- और 2- miR-495-3p और miR-150-5p का फोल्ड अपग्रेडेशन पाया।गुर्दाFAN मॉडल से नमूने (चित्र 2E)। TGF- 1, फाइब्रोजेनेसिस के मास्टर नियामकों में से एक, ने भी HKC में miR-150 और miR-495 अभिव्यक्ति को प्रेरित किया-8 2-गुना और {{ से अधिक कोशिकाएं 6}} गुना, क्रमशः 48 घंटे के बाद, टीजीएफ-सिग्नलिंग-संबंधित घटनाओं (छवि 3ए और बी) में इन miRNAs के लिए एक संभावित भूमिका का समर्थन करते हुए। यह आकलन करने के लिए कि क्या miR-150 और miR-495 TGF- 1 द्वारा ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रो-फाइब्रोोटिक परिवर्तन में शामिल थे, मानव कोशिका रेखा HKC-8 को miR के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। -150-5p या miR-495-3p और अलग-अलग समय के लिए TGF- 1 के साथ व्यवहार किया। बढ़ते हुए miR-150-5p और miR-495-3p स्तरों ने फाइब्रोसिस से जुड़े मार्करों Acta2, Col1 1, और Fn1 के TGF- 1-प्रेरित mRNA स्तर की अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि की है। अंजीर। 3 सी और डी)। इसी तरह, miR-150-5p या miR-495-3p के overexpression ने CPT1A को बहुत कम कर दिया और -SMA प्रोटीन बहुतायत (छवि 3E और F) को बढ़ाया। ये आंकड़े बताते हैं कि ये miRNAs के रोगजनन में भाग ले सकते हैंगुर्देटीजीएफ- 1-ट्यूबलर कोशिकाओं के आश्रित एपिथेलियल डिडिफरेंशिएशन को बढ़ावा देने के साथ-साथ एफएओ में शामिल एक महत्वपूर्ण एंजाइम की अभिव्यक्ति से समझौता करके फाइब्रोसिस।

MiR-150 और miR-495 माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनेरगेटिक्स परिवर्तनों को प्रेरित करते हैं और महत्वपूर्ण माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में शामिल जीन की अभिव्यक्ति को कम करते हैं। miR-150-5p या miR-495-3p के प्रशासन द्वारा प्रेरित चयापचय परिणामों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए हमने मानव के बायोएनेरगेटिक्स प्रोफाइल का अध्ययन किया।गुर्देट्यूबलर उपकला कोशिकाएं।

अंजीर। 1. UUO- प्रेरित फाइब्रोसिस में miRNA अभिव्यक्ति डेटा। (ए) विपरीत और बाधित के सापेक्ष miRNA अभिव्यक्ति दिखाने वाला हीट मैपगुर्देC57/BL6-J चूहों को 7 दिनों के लिए UUO प्रक्रिया के अधीन किया गया (n=6)। स्केल बार हरे से लाल (उच्च से निम्न अभिव्यक्ति) तक होता है और संख्याएं Ct मानों का प्रतिनिधित्व करती हैं। बाईं ओर अध्ययन के लिए चुने गए miRNAs को इंगित किया गया है। (बी) यूयूओ-मॉड्यूलेटेड miRNAs का ज्वालामुखी प्लॉट विश्लेषण। Log10 सापेक्ष परिमाणीकरण (RQ) और ऋणात्मक ( - ) log10 समायोजित (adj.) P-मान क्रमशः x- और y-अक्ष पर प्लॉट किए जाते हैं। प्रत्येक miRNA को एक बिंदु द्वारा दर्शाया जाता है। 175 miRNAs में से 73 ने फ़ाइब्रोोटिक नमूनों में एक परिवर्तित अभिव्यक्ति दिखाई (adj. P-मान 0.05 से अधिक या उसके बराबर)। आगे के विश्लेषण के लिए चयनित miRNAs पर प्रकाश डाला गया है। (सी) miR-150-5p और miR-495-3p को जीन CPT1A, TFAM और PGC1A के सिलिको लक्ष्यीकरण में उनकी शक्ति के आधार पर चुना गया था। इन जीनों के 3'UTR में प्रत्येक चयनित माइक्रोआरएनए, संरक्षित बीज लक्ष्य स्थलों के लिए, उनके गुना परिवर्तन और महत्व (adj. P-value) को दर्शाया गया है।

चित्र 2. miR-150-5p और miR-495-5p in . के अभिव्यक्ति स्तरगुर्देUUO और FAN मॉडल से। (ए, बी) क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण में miR-150-5p (A) और miR-495- 3p (B) एक्सप्रेशनगुर्देपहले माइक्रोआरएनए सरणी के साथ विश्लेषण किए गए नमूनों में यूयूओ के 7 दिन बाद चूहों से। (सी-ई) क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण miR-150-5p और miR-495-3p अभिव्यक्ति के बाद FAN मॉडल (C) और 3, 5, 7, 10 और 15 दिन बाद miR-150-5p (D) और miR{{10}}p (E) के लिए UUO। बार ग्राफ़ प्रति समूह 6 (ए, बी, ई) और 3 (सी और डी) चूहों से गुना परिवर्तन अभिव्यक्ति स्तर ± सेमी के माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><0.001 उनकी="" संगत="" नियंत्रण="" स्थितियों="" की="" तुलना="" में;="" #p=""><0.05, ##p=""><0.01 नियंत्रण="" की="" तुलना="">गुर्देएक ही प्रायोगिक उपचार के साथ चूहों से।

टीजीएफ- 1 का उपयोग प्रो-फाइब्रोटिक संबंधी परिवर्तनों में शामिल मॉडल साइटोकाइन के रूप में किया गया था। इन कोशिकाओं की बायोएनेरगेटिक्स स्थिति निर्धारित करने के लिए, एफएओ-संबंधित ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) और एचकेसी -8 कोशिकाओं के बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर) को यौगिकों के साथ अनुक्रमिक उपचार के दौरान मापा गया था जो माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि को नियंत्रित करते हैं। , एक Seahorse XF24 एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइज़र (मेथड्स सेक्शन में अधिक विवरण) का उपयोग करना। TGF के साथ 48 घंटे के बाद - 1, HKC -8 miR की उपस्थिति में कोशिकाओं -150-5 p ने बेसल, OCR युग्मित ATP पीढ़ी, ATP से जुड़े श्वसन और अधिकतम श्वसन में लगातार कमी दिखाई, जो FCCP-संवेदनशील OCR (चित्र 4A) से संबंधित है। ओएक्सपीएचओएस में हानि एचकेसी -8 कोशिकाओं में एटीपी सामग्री में कमी से एमआईआर -150-5 पी (छवि 4 सी) से अधिक व्यक्त की गई थी। हमने यह नहीं देखा कि इन miRNAs ने ECAR (डेटा नहीं दिखाया गया) में बदलाव को प्रेरित किया। इसके अनुरूप, उनके माइटोकॉन्ड्रियल के mRNA अभिव्यक्ति स्तर-

संबंधित लक्ष्य जीन CPT1A, PGC1 और माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर A (TFAM), miRNA मिमिक NC- उपचारित कोशिकाओं (छवि 4E) की तुलना में miR -150 मिमिक के साथ उपचारित कोशिकाओं में आधे से कम हो गए थे। miR-495-3p के साथ समान प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग करने वाले अध्ययनों से समान परिणाम प्राप्त हुए (चित्र 4B, D, F)। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान, mtDNA कॉपी नंबर और MitoTrackerTM ग्रीन एफएम के साथ माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला द्वारा निर्धारित किया गया था, जिसे miRNA -150 और miRNA - 495 द्वारा बेसल स्थितियों और TGF- उपचार के तहत महत्वपूर्ण रूप से संशोधित नहीं किया गया था। इस पैरामीटर में घटती प्रवृत्ति मूल रूप से देखी गई थी (सप्लीमेंट्री अंजीर। 2 ए, बी, सी)। कुल मिलाकर, ये डेटा समर्थन करते हैं कि miR-150 और miR-495 a . को बढ़ावा देते हैं

माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन की हानि के माध्यम से ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं में प्रो-फाइब्रोटिक क्रिया।

MiR-150 और miR-495 माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता (ΔѰm) और माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड रेडिकल को नहीं बदलते हैं

अंजीर। 3. MiR-150 और miR-495 TGF को बढ़ाते हैं- 1-मानव में निर्भर प्रो-फाइब्रोटिक प्रतिक्रियागुर्देट्यूबलर उपकला कोशिकाएं। (ए, बी) एमआईआर का आरटी-पीसीआर विश्लेषण {0} पी (ए) और एमआईआर -495-3 पी (बी) एचकेसी में अभिव्यक्ति -8 कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया 1{{24 संकेतित समय के लिए }} एनजी/एमएल टीजीएफ- 1। (सी, डी) एमआईआर-एनसी और मिमिक एमआईआर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से अल्फा-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (-एसएमए), अल्फा 1 प्रकार -1 कोलेजन (कर्नल 1 1), फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) के एमआरएनए स्तर -150-5p (C) या miR-495-3p (D) को qRT-PCR द्वारा Sybr ग्रीन का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। कोशिकाओं को टीजीएफ - 1 (1 0 एनजी / एमएल) के साथ इलाज किया गया था, जहां miRNA ओवरएक्प्रेशन के बाद संकेत दिया गया था (विधियां अनुभाग भी देखें)। (ई, एफ) एमआईआर-एनसी और मिमिक miR-150-5p (E) या miR{{20}}p (F) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में CPT1A और -SMA स्तर प्रोटीन स्तर को दर्शाने वाले इम्युनोब्लॉट्स संकेतित समय बिंदु। GAPDH का उपयोग सामान्यीकरण उद्देश्यों के लिए किया गया था। बार ग्राफ (दाएं पैनल) 3 स्वतंत्र प्रयोगों से गुना परिवर्तन अभिव्यक्ति ± सेमी के माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। *P < {{30}}.05,="" **p=""><0.01, ***p=""><0.001 उनकी="" संगत="" नियंत्रण="" स्थितियों="" की="" तुलना="" में;="" #p=""><0.05, ##p=""><0.01, ###p=""><0.001 समान="" प्रायोगिक="" स्थिति="" के="" साथ="" mir-nc="" से="" उपचारित="" कोशिकाओं="" की="" तुलना="">

अंजीर। 4. MiR-150 और miR-495 TGF को बढ़ाते हैं 1-HKC में FAO दमन को प्रेरित करते हैं-8। (ए, बी) एचकेसी -8 कोशिकाओं के ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया

40 nM miR-NC और मिमिक miR-150-5p (A) या miR-495-3p (B) और 10 ng/ml TGF{{5} के संपर्क में } miRNA overexpression के बाद (विधियों अनुभाग भी देखें)। बार ग्राफ (दाएं पैनल) बेसल, प्रोटॉन-रिसाव, एटीपी-लिंक्ड, अधिकतम और आरक्षित क्षमता और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन स्थितियों से जुड़े ओसीआर की दरों को दिखाते हैं। प्रोटीन मात्रा द्वारा सामान्यीकरण के बाद डेटा का प्रतिनिधित्व किया जाता है। (सी, ई) एचकेसी में एटीपी स्तर -8 कोशिकाओं को miR-NC और मिमिक miR-150-5p (C) या miR-495-3p (E) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। (D, F) HKC में CPT1A, PGC1A और TFAM का mRNA स्तर -8 कोशिकाओं को miR-NC और मिमिक miR-150-5p (D) या miR-495-3p (F) से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया Sybr ग्रीन का उपयोग करके qRT-PCR द्वारा निर्धारित किया जाता है। दंड आलेख 4 स्वतंत्र प्रयोगों का माध्य ± sem दिखाते हैं। *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><0.001 उनकी="" संगत="" नियंत्रण="" स्थितियों="" की="" तुलना="" में;="" #p=""><0.05, ##p=""><0.01, ###p=""><0.001 समान="" प्रायोगिक="" स्थिति="" के="" साथ="" mir-nc="" से="" उपचारित="" कोशिकाओं="" की="" तुलना="">

आयनों का उत्पादन। प्रोटॉन पंप (कॉम्प्लेक्स I, III और IV) द्वारा उत्पन्न माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (ΔΨm) ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के दौरान ऊर्जा भंडारण की प्रक्रिया में एक आवश्यक घटक है। बढ़े हुए m से माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स गड़बड़ी हो सकती है, जबकि इसकी कमी से एटीपी उत्पादन में कमी आती है, जिससे सेल व्यवहार्यता से समझौता होता है [254]। सुपरऑक्साइड रेडिकल आयन (O2•-) एक मुक्त रेडिकल है जो कि माइटोकॉन्ड्रिया में इलेक्ट्रॉन रिसाव के परिणामस्वरूप उत्पन्न हो सकता है जो ETC के कई चरणों के भीतर हो सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स के भीतर O2•- की उत्पत्ति भी गंभीर रूप से NADH/NAD प्लस और CoQH2/CoQ अनुपात और स्थानीय O2 एकाग्रता [255] पर निर्भर करती है। इसके अतिउत्पादन से विभिन्न तंत्रों के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स होमियोस्टेसिस का नुकसान हो सकता है, एक ऐसी स्थिति जो एकेआई और सीकेडी [201] सहित कई रोग संबंधी राज्यों से संबंधित है। TMRM डाई और सुपरऑक्साइड रेडिकल आयनों के उत्पादन के साथ MitoSOX डाई के साथ ΔѰm की जांच की गई। सबसे पहले, हमने इन assays को FCCP और CCCP के साथ कोशिकाओं के उपचार द्वारा क्रमशः TMRM और MitoSOX के लिए, और Oligomycin और Antimycin A को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, TMRM और MitoSOX के लिए, मानव सेल लाइन HKC {{7} में मान्य किया। }. TMRM परख के मामले में, ओलिगोमाइसिन उपचार ने नियंत्रण डाई की तुलना में TMRM के प्रतिदीप्ति माध्य में 3- गुना वृद्धि को प्रेरित किया, जबकि FCCP उपचार के परिणामस्वरूप 9-गुना कमी आई। एंटीमाइसिन ए और सीसीसीपी ने मिटोक्स परख (सप्लीमेंट्री अंजीर। 3 ए और बी) में क्रमशः एक 35- गुना वृद्धि और एक 2- गुना कमी का उत्पादन किया। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय पर miR-150 और miR-495 प्रभाव ने इन मापदंडों में परिवर्तन को ट्रिगर किया, HKC-8 कोशिकाओं को miR-150-5p या miR{{17} के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। }p मिमिक या संबंधित miR-NC। TMRM या MitoSOX जांच के प्रतिदीप्ति परिमाणीकरण में कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर चयनित miRs और miR-NC (सप्लीमेंट्री अंजीर। 3C) के साथ उपचार की स्थिति के बीच नहीं पाया गया।

सीकेडी रोगियों के प्लाज्मा और गुर्दे के नमूनों में MiR-150 और miR-495 स्तर प्रभावित नहीं होते हैं। हमने सीकेडी के रोगियों से प्लाज्मा और गुर्दे की बायोप्सी में चयनित miRNAs की अभिव्यक्ति का आकलन किया। 26 रोगियों (अस्पताल रामन वाई काजल) से गुर्दे की बायोप्सी के विश्लेषण में फाइब्रोसिस की डिग्री और miR-150-5p और miR-495-3p स्तरों के बीच क्रमशः कोई संबंध नहीं दिखा (सप्लीमेंट्री अंजीर। 4A और B) . MiR -150-5 p के परिसंचारी प्लाज्मा स्तर, दोनों की उच्चतम गुर्दे की अभिव्यक्ति के साथ miRNA, 100 CKD रोगियों (अस्पताल प्रिंसिपे डी ऑस्टुरियस) के एक समूह में भी निर्धारित किए गए थे। नमूना उपलब्धता में सीमाओं के कारण, हम इस कोहोर्ट में miR- 495-3p के सीरम मान निर्धारित करने में असमर्थ थे। इन रोगियों को पहले 24 महीनों की अवधि में उनके गुर्दे के कार्य के विकास के आधार पर दो उपसमूहों में विभाजित किया गया था ताकि 50 रोगियों ने गुर्दे की कार्यक्षमता में 10 प्रतिशत से भी कम गिरावट पेश की, जबकि बाकी ने गुर्दे में कम से कम 40 प्रतिशत की कमी का अनुभव किया। समारोह। MiR -150-5 p के प्लाज्मा स्तरों की qRT-PCR मात्रा का ठहराव रोगियों के दो उपसमूहों (सप्लीमेंट्री अंजीर। 4C) में एक अंतर अभिव्यक्ति की ओर एक स्पष्ट रुझान नहीं दिखाता है।

4। चर्चा

पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं के प्रमुख नियामकों के रूप में miRNAs की खोज ने गुर्दे की बीमारी [31] सहित लगभग हर नैदानिक ​​​​सेटिंग में चिकित्सीय एजेंटों के रूप में उनके उपयोग पर अनुसंधान को बढ़ावा दिया है। गुर्दे की फाइब्रोसिस, एटियलजि की स्वतंत्रता के साथ क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) का एक अत्यधिक प्रचलित परिणाम है, और इसकी उपस्थिति विकास का एक स्पष्ट भविष्यवक्ता है। इसलिए, किडनी फाइब्रोसिस [32,33] से जुड़े miRNAs की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रयास समर्पित किया गया है। इस अध्ययन में, हमने मेटाबॉलिक डिरेंजमेंट की बढ़ती महत्वपूर्ण भूमिका पर ध्यान केंद्रित कियागुर्देक्षतिऔर हमने दो miRNAs, miR-150 और miR-495 की पहचान की, जो पहले दृश्य में अज्ञात अभिनेता थे। इसके अलावा, हमने पाया कि वे टीजीएफ के साथ तालमेल करके और वसायुक्त से संबंधित प्रमुख चयापचय मार्गों को संशोधित करके सेलुलर बायोएनेरगेटिक्स पर गहरा प्रभाव डालते हैं।अम्ल ऑक्सीकरण.

एपिथेलियल चोट फैटी में दोष के साथ सह-अस्तित्व में हैअम्लऑक्सीकरण, ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के लिए ऊर्जा का मुख्य स्रोत [5]। यह ट्यूबलर फ़ंक्शन हानि को प्रेरित करने, सेल चक्र गिरफ्तारी को ट्रिगर करने और महत्वपूर्ण प्रो-फाइब्रोोटिक साइटोकिन्स की रिहाई को बढ़ावा देने के लिए प्रेरित करता है जो अंतरालीय मायोफिब्रोब्लास्ट [5,34] को सक्रिय करने में योगदान कर सकता है। माउस में MiR-150 और miR-495 एक्सप्रेशन बढ़ाए गएरेशेदारगुर्देऔर मेंमानव गुर्दाटीजीएफ- के साथ उपचार के बाद उपकला कोशिकाओं (एचकेसी -8), प्रो-फाइब्रोटिक प्रतिक्रिया में उनकी भागीदारी का सुझाव देते हैं। रुचि की, जीनोमिक क्षेत्रों के सिलिको विश्लेषण में miR-150 और miR-495 के लिए कोडिंग, TGF- सिग्नलिंग और यूयूओ क्षति में शामिल अन्य मार्गों से संबंधित प्रतिलेखन कारकों के लिए बाध्यकारी साइटों की पहचान की अनुमति देता है (खोज में) miR-150 और miR-495 के लिए Genecards.org)। दोनों miR-150 और miR-495 ने अपने लक्ष्य जीन CPT1A, PGC1 और TFAM के अभिव्यक्ति स्तर को कम कर दिया, जो उपचार के बाद घटी हुई बेसल, ATP-लिंक्ड और अधिकतम OCR और ATP सामग्री में परिलक्षित हुआ। एमआईआर-150 और एमआईआर-495। यह प्रभाव एचकेसी -8 कोशिकाओं में एक उन्नत टीजीएफ-प्रो-फाइब्रोटिक प्रतिक्रिया के साथ था। हमने पाया कि टीजीएफ- माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए में कमी आई है। MiRNA-150 और miRNA-495 के साथ उपचार के बाद, बेसल स्थितियों में माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री में घटती प्रवृत्ति देखी गई, भले ही महत्व तक नहीं पहुंच पाया। यह पीजीसी 1 या टीएफएएम की भूमिका से स्वतंत्र एक तंत्र की ओर इशारा करता है और सबसे अधिक संभावना सीपीटी 1 ए डाउनरेगुलेशन से जुड़े चयापचय प्रभाव से संबंधित है जो miRNAs की उपस्थिति से प्रभावित मुख्य चर है। गुर्दे की बीमारी में माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनेरगेटिक्स में परिवर्तन महत्वपूर्ण हैं [35]। ध्यान में रखते हुए, हमने हाल ही में दिखाया है कि CPT1A एक स्वस्थ ट्यूबलर डिब्बे के संरक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण एंजाइम है, क्योंकि इसकी अधिकता किडनी फाइब्रोसिस [6] से बचाती है। हालांकि, पीजीसी1

और टीएफएएम जीन भी माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और बायोजेनेसिस [36] से निकटता से संबंधित हैं। इन जीनों की बिगड़ा हुआ अभिव्यक्ति सीकेडी से जुड़ा हुआ है, जबकि इसका संरक्षण गुर्दे की अखंडता में योगदान देता है जैसा कि क्षति के कई मॉडलों में दिखाया गया है। इस प्रकार, हान एट अल। पाया गया कि पीजीसी 1 के ट्यूबलर गेन-ऑफ-फंक्शन ने नॉच-प्रेरित किडनी फाइब्रोसिस के खिलाफ चूहों की रक्षा की और इस मॉडल से जुड़े माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को उलट दिया [37]। इसी तरह, नलिका कोशिकाओं में Tfam की पुन: अभिव्यक्ति ने Notch- प्रेरित चयापचय और प्रो-फ़ाइब्रोोटिक रिप्रोग्रामिंग [38] को रोका। इस प्रकार, यह बोधगम्य है कि miR-150 और miR-495 से प्रेरित इन माइटोकॉन्ड्रियल जीन की घटी हुई mRNA अभिव्यक्ति भी क्षतिग्रस्त उपकला फेनोटाइप में योगदान करती है।

एपिथेलियल सेल क्षति से जुड़े ओसीआर में हमने जो गिरावट देखी, वह पिछली रिपोर्टों के अनुसार है, जिसमें miR-33 और miR-9 [15,16] के साथ हमारे अध्ययन शामिल हैं। जबकि कांग एट अल। यह भी बताया कि किडनी फाइब्रोसिस [5] के मानव और माउस मॉडल में ग्लूकोज ऑक्सीकरण कम था, हमारे डेटा से पता चलता है कि ओसीआर में माइक्रोआरएनए-मध्यस्थता में कमी ईसीएआर में प्रति भिन्नता को प्रेरित नहीं करती है, यह सुझाव देती है कि फाइब्रोटिक स्थितियों में ग्लाइकोलाइटिक शटडाउन सबसे अधिक निर्भर करता है। बिगड़ा हुआ ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के बजाय फाइब्रोटिक उत्तेजनाओं पर। कई miRNAs को माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के प्रमुख संशोधक के रूप में पहचाना गया है, जिसमें आर्किटेपल प्रो-फ़ाइब्रोोटिक miRNA, miR-21 [39] शामिल हैं। miR-21 द्वारा PPAR- अभिव्यक्ति के दमन को एक तंत्र के रूप में लागू किया गया है जिसके द्वारा यह miRNA अपनी प्रो-फाइब्रोटिक क्रिया करता है। FAO को बाधित करने के अलावा, miR-21 के लिए लक्ष्य जीन ने संकेत दिया कि यह miRNA माइटोकॉन्ड्रियल प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को शांत करता है। अन्य उदाहरणों में मीर-9 [16], miR-33 [15] और miR-30e [40,41] शामिल हैं। हालाँकि, हमारे ज्ञान के लिए, किडनी फाइब्रोसिस के संदर्भ में CPT1A, PGC1 और TFAM जीन के माइक्रोआरएनए विनियमन को संबोधित करने वाली कुछ रिपोर्टें हैं। दिलचस्प बात यह है कि माइक्रोआरएनए -214 जो रीनल फाइब्रोसिस के दौरान एपिथेलियल-टू-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) को बढ़ावा देता है, सीधे कोलन कैंसर कोशिकाओं में टीएफएएम को लक्षित करता है [42]। यह दमन miR-590-3p [43] के लिए भी सूचित किया गया था। miR -29 परिवार, अंग फाइब्रोसिस में ECM उत्पादन के सर्वोत्तम-विशेषज्ञ नियामकों में से एक, कार्डियक होमियोस्टेसिस को संरक्षित करते हुए सीधे PGC1 को लक्षित करता है। इस प्रकार, miR-29 की पैथोलॉजिकल साइलेंसिंग PGC1 अपग्रेडेशन की ओर ले जाती है, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस में गहरा परिवर्तन होता है जो हृदय रोग में योगदान देता है [44]। जबकि हमारा डेटा किडनी फाइब्रोसिस में miR-150 और miR-495 की भूमिका का स्पष्ट रूप से समर्थन करता है, इस विवाद की पुष्टि के लिए विवो अध्ययन में आगे आवश्यक होगा।

माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) की अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए, हमने दो विशेषताओं पर ध्यान केंद्रित किया: m और सुपरऑक्साइड रेडिकल आयन उत्पादन। हमने देखा कि miR-150 और miR-495 ने इन मापदंडों को नहीं बदला। सेल व्यवहार्यता के लिए एक स्थिर ΔѰm की आवश्यकता होती है और इसका परिमाण सेल प्रकारों के बीच भिन्न होता है [45]। इसका रखरखाव कड़ाई से ठीक है क्योंकि m में वृद्धि से रेडॉक्स अवस्था में गड़बड़ी हो सकती है, जबकि इसकी कमी से एटीपी उत्पादन में कमी आती है और एपोप्टोसिस को ट्रिगर कर सकता है। हमारे अध्ययन में, m में परिवर्तन को cationic फ्लोरोसेंट डाई TMRM के साथ निर्धारित किया गया था, जबकि माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड रेडिकल आयनों के उत्पादन को फ्लोरोजेनिक डाई MitoSOX Red से मापा गया था। गुर्दे के कार्य को प्रभावित करने वाली स्थितियों में इन उपकरणों का उपयोग साहित्य में विशिष्ट नहीं है। फिर भी, हमारे अध्ययन में परिवर्तन की अनुपस्थिति के कारण, हमने रेडॉक्स हार्मोन का मूल्यांकन करने के लिए अन्य रणनीतियों का गहराई से पालन नहीं किया, और इसलिए, हम इस बात को बाहर नहीं कर सकते कि ये miRNAs न्यूक्लियोफिलिक टोन या कई घटकों के कार्य को बदल सकते हैं। आदि

नैदानिक ​​​​सेटिंग में, miR-150 को TGF- सिग्नलिंग [46,47] को संशोधित करके ल्यूपस नेफ्रैटिस में एक प्रो-फाइब्रोोटिक miRNA के रूप में सुझाया गया है, जबकि miR-495 डायबिटिक कार्डियक में एक सुरक्षात्मक भूमिका से जुड़ा था। फाइब्रोसिस [48]। सीकेडी में उनकी संभावित भागीदारी का पता लगाने के लिए, हमने दो अलग-अलग रोगी समूहों में उनके सीरम और पैरेन्काइमल स्तरों का मूल्यांकन किया। miRNAs के सीरम स्तर को CKD प्रगति [49,50] के लिए संभावित बायोमार्कर के रूप में प्रस्तावित किया गया है। इस प्रकार, सीरम परिसंचारी miR-21 के स्तर और miR-29c की प्रचुरता मूत्र एक्सोसोम में गुर्दे की फाइब्रोसिस के साथ सहसंबंधित होती है, जो बायोमार्कर [51, 52] के रूप में उनकी संभावित भूमिका का सुझाव देती है। हालाँकि, miR-150 और miR-495 का स्तर CKD रोगियों के प्लाज्मा या गुर्दे के नमूनों में भिन्न नहीं था। प्रजातियों और सेल प्रकारों के बीच अलग-अलग माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति पैटर्न फाइब्रोटिक ऊतक [53] में miR -150 और miR -495 स्तरों में अंतर की अनुपस्थिति की व्याख्या कर सकते हैं। जबकि कुछ मामलों में रिपोर्ट किए गए माइक्रोआरएनए प्लाज्मा स्तर गुर्दे के ऊतकों में प्रतिबिंबित हो सकते हैं, संचार प्रणाली के लिए miRNAs के स्राव से संबंधित अन्य तंत्र या अन्य अंगों द्वारा इस स्राव के असंतुलन पर भी विचार किया जाना चाहिए [13,54]।

कुल मिलाकर, हमारे परिणाम इस बात का समर्थन करते हैं कि miR-150 और miR-495 प्रचार करते हैंगुर्देउपकलाकक्षCPT1A, PGC1 और TFAM माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन-संबंधित जीन के दमन द्वारा व्यक्त ऊर्जा की कमी के माध्यम से सबसे अधिक संभावना है। वे विवो में अपनी भूमिका के साथ-साथ नैदानिक ​​या रोगसूचक बायोमार्कर के रूप में उनकी संभावित उपयोगिता को आगे बढ़ाने के लिए एक आधार उधार देते हैं।

लेखक का योगदान

एसएल ने अनुसंधान की कल्पना और निर्देशन किया। VM ने अधिकांश प्रयोगों का डिज़ाइन, प्रदर्शन और विश्लेषण किया। आरआर ने माइक्रोआरएनए सरणी विश्लेषण में सहायता की। डीआरपी और एलजीबी ने सीकेडी रोगियों के दो अलग-अलग समूहों में अध्ययन किया। सभी लेखकों ने परिणामों की चर्चा में मदद की और SL और VM ने पांडुलिपि लिखी।

प्रतिस्पर्धी हित की घोषणा

लेखकों का कोई रुचियों का टकराव नहीं है।

स्वीकृतियाँ

इस कार्य को स्पेन के विज्ञान मंत्रालय के SAF2015-66107-R और PID2019-104233RB-I00 (SL), PI17/ 01513 (DRP) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, जिसे यूरोपीय संघ द्वारा सह-वित्त पोषित किया गया था। क्षेत्रीय विकास कोष, इंस्टिट्यूट डी सालुद कार्लोस III रेडिनरेन आरडी12/0021/0009 और आरडी16/ 0009/0016 (एसएल और डीआरपी), एफआईएस पीआई17/00625 (डीआरपी), कोमुनिदाद डी मैड्रिड "नोवेलरेन" बी2017/बीएमडी3751 (एसएल और डीआरपी), स्पेनिश सोसाइटी ऑफ नेफ्रोलॉजी (फंडासिन सेनेफ्रो 2017) से एसएल और फंडासीन को अनुदान सहायतागुर्दे"इगो अल्वारेज़ डी टोलेडो" (श्रीलंका) सभी स्पेन से। CBMSO को Fundacion "Ramn Areces" से संस्थागत समर्थन प्राप्त होता है। VM को स्पेन के विज्ञान मंत्रालय के FPI प्रोग्राम (BES- 2013-065986) की प्रीडॉक्टोरल फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।