सीरम/पीडीजीएफ-आश्रित मेलेनोजेनिक भूमिका मेलानोमा कोशिकाओं में ऑन्कोजेनिक किनेज पीएके1 के मिनट स्तर की अत्यधिक संवेदनशील किनेस परख द्वारा सिद्ध

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सारांश:हमने पहले दिखाया था कि ऑन्कोजेनिक किनसे PAK4, जो मेलानोमा और सामान्य मेलानोसाइट्स दोनों बहुत उच्च स्तर पर व्यक्त करते हैं, उनके लिए आवश्यक हैमेलानोजेनेसिस. वर्तमान अध्ययन में, अत्यधिक संवेदनशील "मैकरोनी-वेस्टर्न" (आईपी-एटीपी-ग्लो) किनेज परख का उपयोग करते हुए, हमने एक अन्य ऑन्कोजेनिक किनेज PAK1 की मेलेनोजेनिक क्षमता की जांच की, जो मेलेनोमा (बी 16 एफ 10) कोशिकाएं केवल बहुत ही मिनट के स्तर पर व्यक्त करती हैं। PAK1 जीन, मेलेनिन सामग्री को शांत करने के लिए PAK1-shRNA के साथ मेलेनोमा कोशिकाओं को संक्रमित करने के बाद,टायरोसिनेसPAK1 की गतिविधि और कीनेज गतिविधि की तुलना जंगली-प्रकार और ट्रांसफ़ेक्टेंट्स के बीच की गई। हमने पाया कि (i) PAK1 मेलानोजेनिक हार्मोन जैसे IBMX (3-isobutyl-1-मिथाइल xanthine) और -MSH (मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन), (ii) अंतर्जात PAK1 जीन को शांत करने से काफी सक्रिय है। PAK1-विशिष्ट shRNA के माध्यम से मेलेनोमा कोशिकाएं मेलेनिन सामग्री और दोनों को कम करती हैंटायरोसिनेसबेसल स्तर पर सीरम और मेलेनोजेनिक हार्मोन दोनों की उपस्थिति में गतिविधि, (iii) मेलेनोमा कोशिकाओं में बहिर्जात रूप से जोड़ा गया जंगली-प्रकार PAK1 बेसल को प्रभावित किए बिना -MSH-inducible मेलेनिन स्तर को कई गुना बढ़ा देता है, और (iv) - MSH/IBMX- प्रेरित मेलानोजेनेसिस शायद ही सीरम या PAK1 की अनुपस्थिति में होता है, यह स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि PAK1 मुख्य रूप से सीरम- और -MSH/IBMX-निर्भर के लिए आवश्यक है।मेलानोजेनेसिस, लेकिन बेसल नहीं, मेलेनोमा कोशिकाओं में। इस अध्ययन के परिणाम यह समझाने के लिए पहला वैज्ञानिक आधार प्रदान कर सकते हैं कि क्यों सौंदर्य प्रसाधनों में कई प्रकार के हर्बल पाक1-अवरोधक जैसे CAPE (कैफिक एसिड फेनिथाइल एस्टर), करक्यूमिन और शिकोनिन उपयोगी हैं।त्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वाला.

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परिचय

बालों का रंग, आंखों में जलन और त्वचा मेलेनिन नामक पिगमेंट के एक परिवार द्वारा नियंत्रित होती है। मेलेनिन का इंट्रासेल्युलर स्रोत टाइरोसिन है और एंजाइमी ऑक्सीकरण (हाइड्रॉक्सिलेशन) की एक श्रृंखला के माध्यम से मेलेनिन में परिवर्तित हो जाता है जिसमें शामिल होता हैटायरोसिनेस, टीआरपी (टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन) 1, और टीआरपी2। इन मेलेनोजेनिक एंजाइमों के लिए जीन एन्कोडिंग की अभिव्यक्ति के लिए कम से कम दो ऑन्कोजेनिक / मेलेनोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों (एमटीएफ) की आवश्यकता होती है: बीटा-कैटेनिन और एमआईटीएफ (माइक्रोफथाल्मिया-संबंधित ट्रांसक्रिप्शन कारक)। अधिकांश हर्बल यौगिकों मेंत्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वालासौंदर्य प्रसाधन या तो सीधे इन मेलेनोजेनिक एंजाइमों को रोकते हैं या एमटीएफ को डाउन-रेगुलेट करते हैं। कोजिक एसिड जैसे टायरोसिन एनालॉग पहली श्रेणी के हैं (टायरोसिनेसअवरोधक), जबकि अधिकांश अवशेष जैसे सीएपीई (कैफिक एसिड फेनेथिल एस्टर), करक्यूमिन, और शिकोनिन दूसरी श्रेणी (एमटीएफ नियामक) (1,2) से संबंधित हैं। दिलचस्प बात यह है कि सीएपीई, करक्यूमिन, शिकोनिन और कुकुर्बिटासिन सहित इनमें से कई एमटीएफ नियामकों को ऑन्कोजेनिक/उम्र बढ़ने वाले किनेज PAK1 (RAC/CDC42-सक्रिय किनेज 1) (3-5) को अवरुद्ध करने के लिए जाना जाता है। इस प्रकार, यह सबसे अधिक संभावना है कि PAK1 बालों की कोशिकाओं, आंखों की जलन, या त्वचा मेलानोसाइट्स में इन मेलेनोजेनिक / ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों की सक्रियता में शामिल है। दरअसल, कम से कम बीटा-कैटेनिन PAK1 (6) के प्रत्यक्ष सबस्ट्रेट्स में से एक है। PAK1 सक्रियण के लिए Ser 675 पर बीटा-कैटेनिन को फॉस्फोराइलेट करता है, जिससे घातक परिवर्तन होता है। इसके अलावा, बीटा-कैटेनिन MITF की सक्रियता के लिए आवश्यक है, जिसके कारणमेलानोजेनेसिसया/और मेलानोसाइट्स (7) का ऑन्कोजेनेसिस।

दिलचस्प रूप से, हालांकि, हाल ही में यह पता चला था कि पिगमेंटेड चूहों में प्रति सेकेंड PAK1 जीन किसी भी अल्बिनो चूहों (हांग हे एट अल।, अप्रकाशित अवलोकन) का उत्पादन करने में विफल रहता है, यह स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि बालों की कोशिकाओं और आंखों दोनों में कम से कम बेसल मेलानोजेनेसिस। irises PAK1 से स्वतंत्र है, हालांकि त्वचा के लिए PAK1 का योगदानमेलानोजेनेसिसस्पष्ट किया जाना बाकी है।

हमने पहले दिखाया है कि ऑन्कोजेनिक किनसे PAK4 (CDC 42- आश्रित किनेज 4) मेलेनोमा और सामान्य मेलानोसाइट सेल लाइनों दोनों में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, और उनके मेलानोजेनेसिस के लिए जिम्मेदार होता है, जो CREB / बीटा-कैटेनिन-MIFT- को सक्रिय करता है।टायरोसिनेसपाथवे, जबकि PAK2 (RAC/CDC42-सक्रिय kinase 2), PAK परिवार का एक और उच्च व्यक्त सदस्य, उनके मेलानोजेनेसिस (8) में कोई भूमिका नहीं निभाता है।

इस अध्ययन में, हम त्वचा में PAK1 नामक एक अन्य ऑन्कोजेनिक किनेज की विशिष्ट भूमिका के लिए पहला जैव रासायनिक साक्ष्य प्रदान करते हैंमेलानोजेनेसिस, इस तथ्य के बावजूद कि इसकी अभिव्यक्ति का स्तर मिनट है: माउस मेलेनोमा से प्राप्त मेलानोसाइट्स (B16F10) में PAK1 जीन की shRNA- प्रेरित साइलेंसिंग ने -MSH/IBMX-inducible को काफी कम कर दियामेलानोजेनेसिसबेसल स्तर तक, जबकि PAK1 जीन की अति-अभिव्यक्ति ने बेसल को प्रभावित किए बिना -MSH-inducible melanogenesis को बढ़ावा दिया। इसके अलावा, हमने पाया कि -MSH/IBMXinducible melanogenesis के लिए एक सीरम कारक की आवश्यकता होती है जो कि सबसे अधिक संभावना PDGF (प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक) है। सीरम मुक्त माध्यम में, केवल बेसलमेलानोजेनेसिसजगह लेता है।

सिस्टैंचेटायरोसिनेस की गतिविधि को कम करें

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1. सामग्री

B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं को अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (रॉकविले, एमडी, यूएसए) से खरीदा गया था। PAK1-श्योर साइलेंसिंग प्लास्मिड, आकर्षक ट्रांसफ़ेक्शन, एंडोफ्री® प्लास्मिड मैक्सी किट क्यूजेन (वेलेंसिया, सीए 91355, यूएसए) से खरीदे गए थे। प्राथमिक PAK1-एंटीबॉडीज, बायोटिनाइलेटेड सेकेंडरी एंटीबॉडीज, सिग्नलफायरटीएम ईसीएल अभिकर्मक सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (डेनवर, एमए, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। Kinase Glo अभिकर्मक और ATP (ATP _ Glo kinase किट) Promega (मैडिसन, विस्कॉन्सिन, यूएसए) से खरीदे गए थे। Lipofectamine और JM109 सक्षम कोशिकाओं को Invitrogen और Life Technology से खरीदा गया था। AG1295 और AG1478 को Calbiochem (सैन डिएगो, सीए, यूएसए) से खरीदा गया था। मानव पीडीजीएफ-बीबी सहित अन्य सभी रसायनों को सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदा गया था।

2.2. माउस PAK1-विशिष्ट shRNA के साथ स्थिर अभिकर्मक द्वारा माउस मेलानोसाइट्स (B16F10) में PAK1 जीन की साइलेंसिंग

2.2.1. कोश पालन

B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं को DMEM में 10 प्रतिशत गर्मी-सक्रिय FBS और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (10, 000 U / mL और 100 µg/mL) के साथ 37 डिग्री पर 5 प्रतिशत CO2 युक्त आर्द्र वातावरण में पूरक किया गया था।

2.2.2. माउस पाक के साथ स्थिर अभिकर्मक1-विशिष्ट shRNA

B16F10 सेल लाइन का ShRNA ट्रांसफ़ेक्शन मूल रूप से पहले वर्णित (9) समान प्रक्रिया के माध्यम से किया गया था, लेकिन माउस PAK 1- विशिष्ट shRNAs (# KM04553, Qiagen) के साथ। अभिकर्मक के लिए shRNAs के निम्नलिखित चार अलग-अलग क्लोनों का उपयोग किया गया था: क्लोन 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), क्लोन 2 (CATCAAGAGTGACAATATTCT), क्लोन 3 (GTACACACGGTTCGAGAAGAT), और क्लोन 4 (GTACCACCAGTGTCAGAAGAT) और साथ ही shCONTROL nontargeting shRNA नकारात्मक नियंत्रण (WT) के रूप में। . हालांकि, इस अध्ययन में, इस मेलानोसाइट लाइन (डेटा नहीं दिखाया गया) में माउस PAK1 जीन को शांत करने के लिए क्लोन 3 और 4 की तुलना में क्लोन 1 और 2 अधिक प्रभावी निकले। G418 (1 mg/mL) की उपस्थिति में स्थिर ट्रांसफ़ेक्टेंट्स का चयन किया गया, जो 99 प्रतिशत से अधिक गैर-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को मारता है।

2.2.3. PAK1 प्रोटीन स्तर का पश्चिमी-धब्बा विश्लेषण और ट्रांसफ़ेक्टेंट्स में PAK1 की काइनेज गतिविधि के लिए इन विट्रो परख में

2.2.3.1. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

नियंत्रण (WT) सेल लाइन और PAK 1- साइलेंट ट्रांसफ़ेक्टेंट्स (G 418- प्रतिरोधी) दोनों में PAK1 के अत्यंत निम्न स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए, "अनपेक्षित शोर" स्तरों को कम करके, हमने पश्चिमी का संचालन किया प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में PAK1 (#2062, सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी) के खिलाफ एक खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके धब्बा विश्लेषण। संक्षेप में, प्रत्येक क्लोन को 2 × 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह की प्लेट में, 48 घंटे के लिए पूर्वसंस्कृत किया गया था, और सेल lysates को 5 मिनट के लिए एसडीएस-पेज बफर के 25 µ एल में उबाला गया था। प्रत्येक सतह पर तैरनेवाला प्रति स्लॉट के आठ μL (कुल प्रोटीन का 15 माइक्रोग्राम युक्त) का उपयोग एसडीएस-पेज के लिए किया गया था। नाइट्रोसेल्यूलोज को PAK1 विरोधी IgG (1:1,000 प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में कमजोर पड़ने), और द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में, HRP-लिंक्ड एंटी-खरगोश IgG और एंटी-बायोटिन IgG (#7074, #) के साथ दाग दिया गया था। 7075, सेल सिग्नलिंग) का उपयोग PAK1 और -एक्टिन बैंड दोनों का पता लगाने के लिए किया गया था, जिन्हें अंततः एमर्सहम से ईसीएल सिस्टम के साथ देखा गया था। पश्चिमी धब्बा परख तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि थे।

2.2.3.2. मेलेनोमा कोशिकाओं में PAK1 के लिए "मैकरोनी-वेस्टर्न" (आईपी-एटीपी_ग्लो) किनेज परख

WT मेलानोसाइट्स और shRNA ट्रांसफ़ेक्टेंट्स (SHs) में PAK1 की काइनेज गतिविधि को एक इतालवी समूह (1{{39) द्वारा विकसित एक दशक पुरानी विधि (जिसे हमने "मैकरोनी-वेस्टर्न" गढ़ा) के पर्याप्त संशोधन (5) द्वारा मापा गया था। }}). संक्षेप में, B16F10 मेलेनोमा सेल लाइन्स (WT या SHs, 2 × 105 सेल/एमएल) 24 घंटे के लिए 6-वेल प्लेट पर पूर्व-सुसंस्कृत थे। तब कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए 100 nM -MSH या 100 µM IBMX के साथ इलाज किया गया था। 50 मिमी ट्रिस एचसीएल पीएच 7.5 और 150 मिमी NaCl और 1 प्रतिशत ट्राइटन-एक्स युक्त लसीका बफर द्वारा कोशिकाओं को बाधित किया गया था। PAK1 के इम्युनोप्रेरीगेशन (IP) के लिए, साफ किए गए सेल lysates को PAK1 IgG (1:50 कमजोर पड़ने) और प्रोटीन A-agarose मोतियों के साथ ठंडे कमरे में 1-2 h के लिए एक रोटरी मिक्सर द्वारा लगातार मिलाते हुए ऊष्मायन किया गया था। (निसिन, सुगिनामी-कू, टोक्यो, जापान)। प्रत्येक lysate से परिणामी IP (PAK1) को ATP Glo kinase परख किट (Promega) के साथ 37 डिग्री पर 1 घंटे के लिए ATP और MBP (माइलिन बेसिक प्रोटीन) की उपस्थिति में ऊष्मायन किया गया था, और शेष ATP स्तर को ATP- द्वारा मापा गया था। आश्रित लूसिफ़ेरिन-लूसिफ़ेरेज़ प्रतिक्रिया जो अंततः एक ल्यूमिनेसेंस (10) उत्पन्न करती है। अंतिम निलंबन को सेंट्रीफ्यूज किया गया था, और सतह पर तैरनेवाला को पढ़ने के लिए एक 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया था। Luminescence को MTP-880लैब माइक्रोप्लेट रीडर (कोरोना, हिताचिनाका-कु, इबाराकी, जापान) द्वारा 0.5 एस प्रति कुएं के एकीकरण समय के साथ रिकॉर्ड किया गया था।

2.3. ट्रांसफ़ेक्टेंट्स में मेलेनिन सामग्री और टायरोसिनेस गतिविधि को मापना

2.3.1. मेलेनिन सामग्री का मापन

मेलेनिन सामग्री को पहले वर्णित (11) के रूप में निर्धारित किया गया था। संक्षेप में, B16F10 कोशिकाओं (जंगली-प्रकार या PAK 1- विशिष्ट shRNA ट्रांसफ़ेक्टेंट्स) को 2 × 104 कोशिकाओं / कुएं के घनत्व पर 24-वेल प्लेट में चढ़ाया गया था। संस्कृति के 24 घंटे के बाद, 100 µM isobutyl-1-मिथाइलक्सैन्थिन (IBMX) या 100 nM -MSH जोड़ा गया और 37 डिग्री पर अतिरिक्त 72 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। कोशिकाओं को फॉस्फेट बफर के साथ दो बार धोया गया था, फिर 1 एम NaOH और 10 प्रतिशत डीएमएसओ युक्त समाधान के 500 μL के साथ लाइज़ किया गया था और मेलेनिन को घोलने के लिए 1 घंटे के लिए 80 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था, और मेलेनिन सामग्री को 490 एनएम पर मापा गया था। जंगली-प्रकार और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में मेलेनिन सामग्री की तुलना करने के लिए, जंगली-प्रकार के मेलानोसाइट्स द्वारा उत्पादित मेलेनिन की कुल मात्रा को नियंत्रण (100 प्रतिशत) के रूप में माना जाता था, और ट्रांसफ़ेक्टेंट्स द्वारा उनके अनुसार गणना की जाती थी।

2.3.2. इंट्रासेल्युलर टायरोसिनेस गतिविधि के लिए परख

टायरोसिनेसगतिविधि को पहले वर्णित (12) के रूप में निर्धारित किया गया था, एक मामूली संशोधन के साथ। B16F10 कोशिकाओं (जंगली-प्रकार या ट्रांसफ़ेक्टेंट्स) को 2 × 104 कोशिकाओं / कुएं के घनत्व पर चढ़ाया गया था, और संस्कृति के 24 घंटे के बाद, 100 µM IBMX या 100 nM -MSH को जोड़ा गया और 37 डिग्री पर अतिरिक्त 72 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। . कोशिकाओं को तब बर्फ-ठंडे फॉस्फेट बफर से धोया जाता था और फॉस्फेट बफर (पीएच 6.8) के साथ lysed किया जाता था जिसमें 1 प्रतिशत ट्राइटन-एक्स (500 μL / कुएं) होता था। प्लेटें 30 मिनट के लिए −80 डिग्री पर जमी हुई थीं। विगलन के बाद, प्रत्येक कुएं में 1 प्रतिशत एल-डोपा का 100 µ एल जोड़ा गया। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री पर ऊष्मायन के बाद, अवशोषण 490 एनएम पर मापा गया था।

2.4. जंगली-प्रकार और पाक में मेलेनिन सामग्री को मापना 1--एमएसएच उपचार के बाद मेलानोसाइट्स को ओवरएक्सप्रेस करना

Myc वेक्टर (2 माइक्रोग्राम) का उपयोग करते हुए, मेलानोसाइट्स (B16F10) को या तो जंगली-प्रकार (WT) PAK1 या तथाकथित "संवैधानिक रूप से सक्रिय" (CA) PAK1 के साथ T423E उत्परिवर्तन के साथ क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। 3 दिनों की संस्कृति के बाद, प्रत्येक ट्रांसफ़ेक्ट क्लोन को आगे के प्रयोग के लिए काटा गया। मेलेनिन सामग्री पर पाक 1- के प्रभाव को पहले (8) वर्णित समान प्रक्रियाओं के माध्यम से मापा गया था। संक्षेप में, मेलानोसाइट्स, या तो जंगली-प्रकार या PAK 1- ओवरएक्प्रेशन, जो या तो जंगली-प्रकार PAK1 या उसके CA उत्परिवर्ती को व्यक्त करते हैं, को 3 दिनों के लिए 100 nM -MSH के साथ ऊष्मायन किया गया था। मेलेनिन को भंग करने के लिए 1 एम NaOH और 20 प्रतिशत डीएमएसओ युक्त समाधान के साथ कोशिकाओं को lysed किया गया था, और इसकी सामग्री 405 एनएम पर निर्धारित की गई थी।

2.5. सीरम-मुक्त माध्यम में मेलानोजेनेसिस

B16F10 कोशिकाओं (जंगली-प्रकार या PAK 1- विशिष्ट shRNA ट्रांसफ़ेक्टेंट्स) को 10 प्रतिशत FBS की उपस्थिति में एक 24-वेल प्लेट में 2 × 104 कोशिकाओं / कुएं के घनत्व पर चढ़ाया गया था। ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, संस्कृति माध्यम को सीरम-मुक्त माध्यम से बदल दिया जाता है, और मेलेनिन सामग्री को मापने के लिए 100 माइक्रोन आईबीएमएक्स या 100 एनएम-एमएसएच के साथ या बिना अतिरिक्त 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया जाता है।

2.6. सीरम आश्रित मेलेनोजेनेसिस पर पीडीजीएफ / ईजीएफ रिसेप्टर अवरोधकों का प्रभाव

2 × 104 बी16 एफ 10 कोशिकाओं को 10 प्रतिशत एफबीएस युक्त माध्यम में 24 घंटे के लिए प्रत्येक कुएं में बोया गया था, और फिर 100 एनएम-एमएसएच और अनुवर्ती युक्त ताजा माध्यम में अतिरिक्त 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था: (1) कोई सीरम नहीं, (2) अकेले 10 प्रतिशत एफबीएस, (3) 10 प्रतिशत एफबीएस प्लस 2 माइक्रोन एजी1295 (पीडीजीएफ रिसेप्टर अवरोधक), और (4) 10 प्रतिशत एफबीएस प्लस 400 एनएम एजी1478 (ईजीएफ रिसेप्टर अवरोधक), मेलेनिन सामग्री को मापने के लिए।

2.7. सांख्यिकीय विश्लेषण

डेटा को उनकी मानक त्रुटियों के साथ माध्य मान के रूप में व्यक्त किया जाता है। डंकन के मल्टीपल रेंज टेस्ट के बाद एकतरफा एनोवा द्वारा सांख्यिकीय तुलना की गई। एसएएस (रिलीज 9.2; एसएएस इंस्टीट्यूट, कैरी, एनसी, यूएसए) का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था, और 0.05 से कम या उसके बराबर पी को महत्वपूर्ण माना गया था।

मैका जिनसेंग सिस्टैंच

3। परिणाम

3.1. मेलेनोजेनिक हार्मोन द्वारा मेलेनोमा सेल लाइन (B16F10) में PAK1 का सक्रियण

दो मेलेनोजेनिक हार्मोन, -एमएसएच (मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन) और आईबीएमएक्स (3-आइसोबुटिल-1-मिथाइल ज़ैंथिन) अक्सर उत्तेजित करने के लिए उपयोग किए जाते हैंमेलानोजेनेसिसमेलेनोसाइट्स जैसे मेलेनोमा सेल लाइन B16F10. इस प्रकार, हमने पहले जांच की कि क्या ये हार्मोन इस सेल लाइन में PAK1 को सक्रिय कर सकते हैं, हालांकि PAK1 का प्रोटीन स्तर PAK2 और PAK4 (8) की तुलना में बहुत कम है। कोशिकाओं में PAK1 की kinase गतिविधि में परिवर्तन की निगरानी के लिए, हमने हाल ही में सेल से PAK1 के इम्यूनो-वर्षा (IP) को मिलाकर "मैकरोनी-वेस्टर्न" (IP ATP-Glo) kinase परख प्रोटोकॉल नामक एक अत्यधिक संवेदनशील / विशिष्ट किनेज परख विकसित की है। lysates और Promega का ATP_ग्लो काइनेज किट (5)। इस काइनेज परख का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि दोनों -MSH (100 एनएम) और IBMX (100 µM) मेलेनोमा कोशिकाओं में PAK1 को सक्रिय करते हैं, साथ ही -MSH IBMX से अधिक शक्तिशाली है (चित्र 1 में देखें)। हालांकि, हमें पाठकों को यह याद दिलाना चाहिए कि यहां दिखाया गया PAK1 का गुना सक्रियण केवल स्पष्ट है, क्योंकि इस समय लेने वाली टेस्ट ट्यूब आईपी और किनेज परख (कुल 3 घंटे से अधिक) इन मेलेनोजेनिक हार्मोन के बिना होने के दौरान, PAK1 धीरे-धीरे सामान्य हो जाएगा। समय। दूसरे शब्दों में, हम इन उत्तेजक पदार्थों के साथ इलाज किए गए सेल संस्कृति के अंत में PAK1 की सटीक किनेज स्थिति को फ्रीज नहीं कर सकते हैं, और गुना सक्रियण इन सिमुलेटरों द्वारा सेल संस्कृति के दौरान हुई PAK1 सक्रियण का केवल एक अनुमानित प्रतिबिंब है।

3.2. माउस मेलेनोमा सेल लाइन में shRNAs द्वारा PAK1 जीन की सिलिंग

आगे जैव रासायनिक रूप से जांच करने के लिए यदि PAK1 योगदान देता हैमेलानोजेनेसिसत्वचा कोशिकाओं (मेलानोसाइट्स) में, हमने चुनिंदा रूप से PAK1 जीन को चुप कराने के लिए माउस PAK1-विशिष्ट shRNA के साथ मेलेनोमा सेल लाइन B16F10 को ट्रांसफ़ेक्ट किया।

3.2.1. मेलानोसाइट्स में साइलेंसिंग PAK1 जीन

हमारे प्रारंभिक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने सुझाव दिया कि दो अलग-अलग PAK 1- साइलेंट क्लोन (SH1 और 2) में PAK1 प्रोटीन का स्तर काफी (लगभग 75 प्रतिशत) कम हो गया है, लेकिन इस मेलेनोमा सेल लाइन की विकास दर प्रति सेकंड नहीं थी PAK1 साइलेंसिंग (डेटा नहीं दिखाया गया) से काफी प्रभावित है। हालाँकि, इस पश्चिमी धब्बा को स्कैन करके PAK1 प्रोटीन के स्तर की सटीक मात्रा का ठहराव मुश्किल था, इसका मुख्य कारण इसकी अत्यंत निम्न अभिव्यक्ति स्तरों की कल्पना करने के प्रयास में PAK1 बैंड के आसपास उच्च पृष्ठभूमि का शोर था। इसके बजाय, "मैकरोनी-वेस्टर्न" किनसे परख (5,10) का उपयोग करते हुए, हमने सत्यापित किया कि SH1 और 2 दोनों क्लोनों में PAK1 की काइनेज गतिविधि नियंत्रण (WT) कोशिकाओं में केवल 25-30 प्रतिशत के आसपास है। चित्र 2क देखें)।

3.2.2 PAK1 जीन को शांत करके मेलानोजेनेसिस में कमी

हमारा अगला महत्वपूर्ण प्रश्न यह था कि क्या PAK1 की काइनेज गतिविधि में इस तरह की कमी प्रभावित करती हैमेलानोजेनेसिस. इस प्रकार, इन क्लोनों (एसएच 1 और 2) में मेलेनिन सामग्री की तुलना जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) मेलेनोमा कोशिकाओं के साथ की गई थी, इन सभी कोशिकाओं को -एमएसएच, एक मेलेनोजेनिक इंड्यूसर के साथ 72 घंटे के लिए इलाज करने के बाद। जैसा कि चित्र 2ख में दिखाया गया है, इन PAK1-की कमी वाले मेलानोसाइट्स (SH1 और 2) में मेलेनिन की मात्रा लगभग 50 प्रतिशत ({10}} प्रतिशत) कम हो जाती है, जो बिना मेलानोजेनिक हार्मोन के WT में बेसल स्तर तक पहुंच जाती है। यह देखने के लिए कि क्या मेलेनिन सामग्री में यह कमी टायरोसिनेस गतिविधि के दमन से जुड़ी है, हमने मापाटायरोसिनेसWT की तुलना में PAK1-कमी कोशिकाओं (क्लोन SH1 और 2) में गतिविधि। जैसा कि चित्र 2C में दिखाया गया है, PAK 1- की कमी वाली कोशिकाओं में tyrosinase गतिविधि WT में केवल लगभग 45 प्रतिशत ({6}} प्रतिशत) है, फिर से बेसल (गैर-उत्तेजित) स्तर तक पहुंचती है, स्पष्ट रूप से संकेत देती है कि PAK1 -MSH-प्रेरित मेलेनिन उत्पादन के लिए आवश्यक हैटायरोसिनेसमेलानोसाइट्स में। इसके अलावा, इसी तरह से आईबीएमएक्स-प्रेरित मेलानोजेनेसिस को भी इस मेलेनोमा सेल लाइन (डेटा नहीं दिखाया गया) में PAK1 जीन को शांत करके कम किया गया था। हालांकि, निम्नलिखित दो कारकों को ध्यान में रखते हुए, यह सबसे अधिक संभावना है कि केवल आधामेलानोजेनेसिसमेलानोसाइट्स में PAK1-निर्भर है, और शेष (बड़े पैमाने पर "मूल") PAK4-निर्भर है: (i) PAK4 मेलानोसाइट्स (8) में -MSH-प्रेरित मेलानोजेनेसिस के लिए भी आवश्यक है, और (ii) PAK1 जीन का लगभग 25 प्रतिशत अभी भी इन ट्रांसफ़ेक्टेंट्स (SH1 और 2) में व्यक्त किया गया प्रतीत होता है। हालांकि, यह सख्ती से स्पष्ट किया जाना बाकी है कि क्या PAK1 हार्मोन-प्रेरक या बेसल के लिए जिम्मेदार हैमेलानोजेनेसिस.

इसके अलावा, हमने पुष्टि की है कि अंतर्जात PAK1 इस मेलेनोमा सेल लाइन में IBMX और -MSH जैसे मेलानोजेनिक इंड्यूसर द्वारा महत्वपूर्ण रूप से सक्रिय है (चित्र 1 देखें), लेकिन थ्र 423 पर इसके ऑटोफॉस्फोराइलेशन में कोई महत्वपूर्ण बदलाव के बिना, जैसा कि एंटी-पीपीएके 1 द्वारा आंका गया है। एंटीबॉडी (डेटा नहीं दिखाया गया)।

3.3. अधिक व्यक्त PAK1 द्वारा -MSH-inducible melanogenesis में वृद्धि

अभिकर्मक द्वारा मेलानोसाइट्स (B16F10 सेल लाइन) में जंगली-प्रकार (WT) PAK1 जीन की अधिकता से, हमने खुलासा किया कि बहिर्जात रूप से जोड़ा गया PAK1 जीन -MSH-inducible मेलेनिन स्तर को कई गुना बढ़ा देता है (चित्र 3 के बाईं ओर देखें, तुलना करें) लेन 2 और 4), जबकि यह स्वतंत्र "बेसल" मेलेनिन स्तर को मुश्किल से प्रभावित करता है (चित्र 3 के बाएं पैनल में लेन 1 और 3 की तुलना करें), यह सुझाव देते हुए कि PAK1 मुख्य रूप से -MSH/IBMX-निर्भर में योगदान देता हैमेलानोजेनेसिस, और बहिर्जात उत्तेजक (ओं) के बिना बेसल मेलानोजेनेसिस नहीं।

3.4. -MSH/IBMX-inducible melanogenesis पर सीरम प्रभाव

अधिक दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया कि -MSH/IBMX द्वारा मेलानोजेनेसिस को शामिल करने के लिए PAK1 के अलावा 10 प्रतिशत FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम) की आवश्यकता होती है। जैसा कि चित्र 4ए में दिखाया गया है, सीरम-मुक्त माध्यम में, या तो -एमएसएच या आईबीएमएक्स ने शायद ही कभी प्रेरित किया होमेलानोजेनेसिसWT कोशिकाओं में, हालांकि अकेले 10 प्रतिशत FBS (बिना -MSH/IBMX) ने प्रेरित कियामेलानोजेनेसिसउल्लेखनीय रूप से (लगभग 60 प्रतिशत)। दिलचस्प बात यह है कि सीरम की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एसएच ट्रांसफेक्टेंट्स (पीएके 1- की कमी वाली कोशिकाओं) में मेलानोजेनेसिस सीरम की अनुपस्थिति में डब्ल्यूटी कोशिकाओं के समान स्तर था (चित्र 4बी देखें), यह सुझाव देता है कि सीरम-निर्भर मेलानोजेनेसिस PAK1 की भी आवश्यकता है। इस धारणा का समर्थन करने में, सीरम अकेले ही WT कोशिकाओं में PAK1 की काइनेज गतिविधि को सक्रिय करता है, लेकिन WT कोशिकाओं में PAK1 के -MSH-निर्भर सक्रियण के लिए सीरम की आवश्यकता होती है (चित्र 4C देखें)।

मेलेनोजेनिक सीरम कारक की रासायनिक प्रकृति के बारे में जो अकेले PAK1 को सक्रिय करता है, हम अनुमान लगाते हैं कि यह निम्नलिखित कारणों से PDGF (प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक) है: (i) एक दशक से अधिक समय पहले हमने दिखाया है कि PDGF एकमात्र विकास कारक है। सीरम जो पीडीजीएफ रिसेप्टर (13,14) द्वारा ईजीएफ (एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर) रिसेप्टर के लेन-देन के माध्यम से पीएके 1 को सक्रिय करता है, और हाल ही में अन्य ने साबित किया है कि या तो पीडीजीएफ या ईजीएफ अकेले वास्तव में उत्तेजित करता हैमेलानोजेनेसिसमेलानोसाइट्स (15,16)।

3.5. सीरम / पीडीजीएफ-आश्रित मेलेनोजेनेसिस के लिए ईजीएफ रिसेप्टर की आवश्यकता होती है

इस मेलेनोजेनिक सीरम कारक की विशिष्ट रासायनिक प्रकृति की पहचान करने के प्रयास में, हमने सीरम-निर्भर पर AG1295 (PDGF रिसेप्टर के लिए विशिष्ट अवरोधक) या AG1478 (EGF रिसेप्टर के लिए विशिष्ट अवरोधक) के प्रभाव का परीक्षण किया है।मेलानोजेनेसिसमेलानोसाइट्स में। जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है, या तो 2 µM AG1295 या 400 nM AG1478 सीरम-निर्भरता को दृढ़ता से कम कर देता हैमेलानोजेनेसिसमूल (सीरम-मुक्त) मेलेनोजेनेसिस के बराबर स्तर तक। चूंकि PDGF सीरम में प्रचुर मात्रा में मौजूद होता है, लेकिन EGF नहीं और AG1295 EGF रिसेप्टर को बाधित नहीं करता है, जबकि AG1478 PDGF रिसेप्टर (13) को बाधित नहीं करता है, यह सबसे अधिक संभावना है कि सीरम में PDGF अपने रिसेप्टर को सक्रिय करता है जो बदले में EGF रिसेप्टर को ट्रांस-एक्टिवेट करता है। अंततः PAK1 को सक्रिय करता है जो सीरम-निर्भर मेलानोजेनेसिस के लिए आवश्यक है (विस्तार के लिए, चित्र 6 देखें)। इस धारणा के आधार पर, हम बाद में PAK1 की सक्रियता के लिए -MSH और सीरम / PDGF के बीच स्पष्ट तालमेल अंतर्निहित सबसे संभावित तंत्र पर चर्चा करेंगे, जिससे मजबूत मेलानोजेनेसिस होगा।

अंत में, यह इंगित करने योग्य होना चाहिए कि -MSH के बिना "बेसल" मेलेनिन सामग्री को T423E उत्परिवर्तन (चित्र 3, लेन 5 के बाएं पैनल देखें) के रूप में PAK1 के अति-व्यक्त CA (संवैधानिक रूप से सक्रिय) उत्परिवर्ती द्वारा महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदला गया था। अगर यह या तो एक डीएन (प्रमुख नकारात्मक) या निष्क्रिय उत्परिवर्ती था। वास्तव में, -MSH ने WT PAK1 के फॉस्फोराइलेशन को थ्र 423 पर बिल्कुल भी प्रेरित नहीं किया (डेटा नहीं दिखाया गया)। इस प्रकार, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि थ्र 423 पर PAK1 के ऑटो-फॉस्फोराइलेशन का PAK1 के -MSH- प्रेरित सक्रियण से कोई लेना-देना नहीं है, जो मजबूत होता हैमेलानोजेनेसिसमेलेनोमा कोशिकाओं में। चूंकि PAK1 के T423E उत्परिवर्ती को अत्यधिक ऑन्कोजेनिक (6) के रूप में जाना जाता है, शायद थ्र 423 पर ऑटो-फॉस्फोराइलेशन "मेलेनोजेनिक" से "ऑन्कोजेनिक" सिग्नलिंग में एक स्विच की सेवा कर सकता है।

4। चर्चा

मेलानोसाइट/मेलेनोमा कोशिकाओं में PAK1-आश्रित और PAK4-आश्रित मेलानोजेनेसिस दोनों पर हमारे अवलोकन से, दो संभावित दिलचस्प मुद्दों को इंगित किया जाना चाहिए: (i) PAK1 की "विशिष्ट" मेलेनोजेनिक गतिविधि ( केवल सूक्ष्म रूप से व्यक्त) मेलेनोमा कोशिकाओं में PAK4 (अत्यधिक व्यक्त) की तुलना में कहीं अधिक होना चाहिए। (ii) ऐसा प्रतीत होता है कि PAK1 मुख्य रूप से सीरम-प्रेरित मेलानोजेनेसिस के लिए जिम्मेदार है, जबकि PAK4 मुख्य रूप से आंतरिक (बेसल) के लिए जिम्मेदार है।मेलानोजेनेसिस. दूसरे शब्दों में, हालांकि PAK4-की कमी चूहों में भ्रूण के लिए घातक है, जबकि PAK1-की कमी अकेले "अल्बिनो" चूहों का उत्पादन करने में विफल रहती है, मूल त्वचा के रंग में स्पष्ट अंतर (मूलभूत)मेलानोजेनेसिस) उदाहरण के लिए काले और गोरे लोगों के बीच कम से कम आंशिक रूप से PAK4 के अभिव्यक्ति स्तर में अंतर का प्रतिबिंब हो सकता है, साथ ही मेलेनोजेनिक के स्तर में अंतर भी हो सकता है।टायरोसिनेसs.

विवो में, HRM-2 (रंजित लेकिन बाल रहित) चूहों का उपयोग करते हुए, हमने हाल ही में दिखाया है कि 10 μM PF3758309 (PAK1/PAK4-अवरोधक) युक्त क्रीम उनकी त्वचा में यूवी-प्रेरित मेलेनोजेनेसिस को कम कर देती है। बेसल स्तर, हालांकि यह अभी भी स्पष्ट किया जाना बाकी है कि क्या PAK4 या PAK1 मेलानोजेनेसिस (8) के यूवी-प्रेरण के लिए जिम्मेदार है। चूंकि PAK1 इंड्यूसिबल के लिए जिम्मेदार है, लेकिन बेसल, मेलानोजेनेसिस के लिए नहीं, यह परीक्षण के लायक होगा यदि PAK1 यूवी-इंड्यूसिबल में महत्वपूर्ण योगदान देता हैमेलानोजेनेसिस(सन टैनिंग) साथ ही, यह समझने की कोशिश में कि क्या विभिन्न प्रकार के हर्बल PAK1 सौंदर्य प्रसाधनों में अवरोधक सन-स्क्रीनिंग एजेंटों के लिए उपयोगी हैं या नहीं। दिलचस्प बात यह है कि PAK1 को यूवी विकिरण और अन्य डीएनए-हानिकारक एजेंटों (17) द्वारा सक्रिय होने की सूचना दी गई थी।

यह दिखाया गया है कि -MSH Tyr kinase JAK2 (18) को सक्रिय करता है, जो बदले में PAK1 को Tyr 285 पर फॉस्फोराइलेशन द्वारा सक्रिय करता है, (Thr 423 के बजाय), जिससे PIX-PAK1 इंटरैक्शन (19) होता है। यह समझा सकता है कि क्यों न तो -MSH- PAK1 की निर्भर सक्रियता और न ही मेलानोजेनेसिस में थ्र 423 पर PAK1 का ऑटोफॉस्फोराइलेशन शामिल है। इस प्रकार, हमने हाल ही में जांच की कि क्या PAK 1- निर्भर मेलानोजेनेसिस एक शक्तिशाली हर्बल JAK 2- द्वारा अवरुद्ध है। कड़वे तरबूज (गोया) से cucurbitacin I (CBI) नामक अवरोधक जो सीधे JAK2 (20) को रोकता है, और पाया कि CBIमेलानोजेनेसिसमेलेनोजेनिक हार्मोन की उपस्थिति में 70 प्रतिशत से अधिक, इस संभावना का सुझाव देते हैं कि सीबीआई न केवल PAK1 बल्कि PAK4 (5) को भी ब्लॉक करती है। इस संदर्भ में, यह ध्यान देने योग्य होगा कि हर्बल PAK 1- CAPE, करक्यूमिन, शिकोनिन और FTY 720 जैसे अवरोधक केवल माउस या मानव त्वचा कोशिकाओं में -MSH- प्रेरित मेलेनोजेनेसिस को रोक सकते हैं। उनकी सांद्रता में भी 50 प्रतिशत जहां PAK1 लगभग पूरी तरह से अवरुद्ध (1,2) है, जबकि सिंथेटिक पैन-PAK-अवरोधक PF3758309, PAK1 और PAK4 दोनों को बाधित करते हुए, समाप्त कर देता हैमेलानोजेनेसिसत्वचा कोशिकाओं में लगभग 90 प्रतिशत 300 एनएम (8) पर। दूसरे शब्दों में, मेलानोसाइट्स में -MSH- प्रेरित मेलानोजेनिक सिस्टम PAK 1- विशिष्ट ब्लॉकर्स को पैन PAK-ब्लॉकर्स से अलग कर सकता है। अब तक किसी भी हर्बल PAK4-विशिष्ट अवरोधकों (PAK के अलावा4-विशिष्ट siRNAs) की पहचान नहीं की गई है। हालांकि, अमेज़ॅन के जंगलों में उगाए गए एक कड़वे पेड़ से व्युत्पन्न ग्लौकारुबिनोन नामक एक बहुत ही शक्तिशाली क्वैसिनोइड को हाल ही में PAK1 और PAK4 दोनों को अवरुद्ध करने के लिए दिखाया गया है, इन विट्रो और विवो (21) दोनों में अग्नाशयी कैंसर कोशिकाओं के विकास को रोकता है। इस प्रकार, यह परीक्षण करना बहुत रुचि का होगा कि क्या यह हर्बल PAK-अवरोधक त्वचा कोशिकाओं के मेलेनोजेनेसिस को लगभग पूरी तरह से दबा देता है जैसा कि PF3758309 करता है।

इस अध्ययन का प्रमुख उद्देश्य PAK1 की विशिष्ट मेलेनोजेनिक भूमिका पर ध्यान केंद्रित करना था, न कि विस्तार से जांच करना कि PAK1 मेलेनोजेनिक एंजाइम और MTF सहित मेलेनोजेनिक सिग्नलिंग मार्ग को कैसे सक्रिय करता है। हालाँकि, यह सबसे अधिक संभावना है कि PAK1 सेर 675 पर फॉस्फोराइलेटिंग द्वारा सीधे बीटा-कैटेनिन को सक्रिय करता है, जिससे MITF की सक्रियता होती है जो कि मेलेनोजेनिक एंजाइमों के लिए जीन एन्कोडिंग की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है, जैसे किटायरोसिनेस(टायर)।

हाल ही में हमने पाया कि PAK4 (CDC42-आश्रित किनसे 4) भी इसमें शामिल हैमेलानोजेनेसिसदो प्रतिलेखन कारकों, CREB और बीटा-कैटेनिन को सक्रिय करके एक ही मेलेनोमा सेल लाइन के, जो दोनों MIFT सक्रियण (8) के लिए आवश्यक हैं। चूंकि CREB को LIM kinase (22,23) द्वारा सक्रिय होने के लिए जाना जाता है, जो बीटा-कैटेनिन की तरह, PAK1 और PAK4 (6,18) दोनों के सामान्य प्रत्यक्ष सबस्ट्रेट्स में से एक है, यह सबसे अधिक संभावना है कि PAK1 और PAK4 समान CREB साझा करते हैं। / बीटा-कैटेनिन-एमआईटीएफ मेलेनोजेनिक एंजाइम जीन को सक्रिय करने के लिए सिग्नलिंग मार्ग।

हालाँकि, PAK1 के -MSH/IBMX-निर्भर सक्रियण की ओर जाने वाले विस्तृत सिग्नल मार्ग, PAK4 के सक्रियण के लिए अग्रणी लोगों से काफी भिन्न हो सकते हैं, मुख्यतः क्योंकि पूर्व में सीरम कारक (PDGF) शामिल है। अकेले सीरम PAK1 (13) को सक्रिय करने में सक्षम है और PAK1 के -MSH/IBMX पर निर्भर सक्रियण को भी बढ़ाता है। दूसरे शब्दों में, PAK1 सक्रियण और दोनों में सीरम और इन मेलेनोजेनिक हार्मोन के बीच एक स्पष्ट तालमेल हैमेलानोजेनेसिस.

यह तालमेल कैसे हो सकता है, इस बारे में हमारी कार्य परिकल्पना निम्नलिखित है। PAK1 सक्रियण के लिए प्रमुख सिग्नलिंग मार्ग ऑन्कोजेनिक EGFR (एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर) -RAS-PI 3 kinase-RAC/CDC42-PAK1 कैस्केड है। हालाँकि, यह कैस्केड अकेले पूर्ण सक्रियण के लिए पर्याप्त नहीं है। इसे PIX नामक एक अन्य कारक की आवश्यकता होती है, एक SH3 एडेप्टर प्रोटीन जो PAK1 नामक 18 अमीनो एसिड के प्रो-रिच मोटिफ के माध्यम से सीधे PAK1 को बांधता है। PIX-PAK1 इंटरैक्शन को JAK2, एक Tyr-kinase नामक तीसरे प्रोटीन की आवश्यकता होती है, जो Tyr 285 पर PAK1 को फॉस्फोराइलेट करता है। RAS प्रोलैक्टिन के माध्यम से JAK2 को अप-रेगुलेट करता है। हमारे और अन्य (13-16) द्वारा पिछले कुछ निष्कर्षों के अनुसार, पीडीजीएफ (प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक) प्रमुख मेलेनोजेनिक सीरम कारक है जो -एमएसएच / आईबीएमएक्स-प्रेरित के लिए आवश्यक है।मेलानोजेनेसिस, क्योंकि यह अपने रिसेप्टर (PDGFR) Tyr-kinase को सक्रिय करता है जो बदले में EGFR (एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर=ErbB1) Tyr-kinase को ट्रांस-एक्टिवेट करता है, जिससे ऑन्कोजेनिक RAS-PI3 kinase-RAC के माध्यम से PAK1 का सक्रियण होता है। /सीडीसी42 मार्ग (13)। इस प्रकार, अकेले सीरम में PDGF PAK1 को सक्रिय कर सकता है और मेलेनोजेनेसिस को आधे रास्ते तक प्रेरित कर सकता है। हालाँकि, PAK1-आश्रित मेलानोजेनेसिस के पूर्ण सक्रियण के लिए, -MSH/IBMX को JAK2 को एक cAMP-निर्भर मार्ग (जिसमें PKA शामिल हो सकता है) के माध्यम से सक्रिय करने की आवश्यकता होती है जो अंततः PIX-PAK1 इंटरैक्शन को सुरक्षित करता है (विस्तार के लिए, चित्र 6 देखें)।

अंत में, यहां हम सबसे पहले जैव रासायनिक साक्ष्य प्रस्तुत करते हैं जो यह बता सकता है कि कॉस्मेटिक क्रीम में विभिन्न प्रकार के हर्बल PAK1-ब्लॉकर्स जैसे CAPE, करक्यूमिन और शिकोनिन कैसे योगदान दे सकते हैं"त्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वाला"प्रभाव। मानव मेलानोसाइट्स के साथ अनुरूप अध्ययनों की एक श्रृंखला आगे के प्रमाण या पुष्टि के लिए प्रतीक्षित है।

मैका जिनसेंग सिस्टैंच

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