अंगूर और वाइन ऑक्सीकरण के संभावित मार्करों के रूप में (प्लस)-कैटेचिन-लैकेस डिमेरिक रिएक्शन उत्पादों का स्पष्ट एनएमआर संरचनात्मक निर्धारण

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सार:( प्लस )-कैटेचिन-लैकेसऑक्सीकरणडिमेरिक मानकों को हेमी-संश्लेषित किया गया था जिसमें ट्रैमेट्स वर्सीकोलर पीएच 3.6 पर एक पानी-इथेनॉल समाधान है। आठ संभावित ऑक्सीकरण डिमेरिक उत्पादों के अनुरूप आठ अंशों का पता चला था। अंश प्रोफाइल की तुलना दो अन्य ऑक्सीडाइरेक्टेस के साथ प्राप्त प्रोफाइल के साथ की गई थी:पॉलीफेनोल ऑक्सीडेजबोट्रीटिस सिनेरिया से अंगूर और लैकेस से निकाला गया। प्रोफाइल बहुत समान थे, हालांकि कुछ मामूली अंतरों ने इन एंजाइमों की प्रतिक्रियाशीलता में संभावित असमानताओं का सुझाव दिया। पांच अंशों को तब 1D और 2D NMR स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा अलग और विश्लेषण किया गया था। एसीटोन में घुलनशील नमूनों में कैडमियम नाइट्रेट के निशान को जोड़ने से फेनोलिक प्रोटॉन के एनएमआर संकेतों को पूरी तरह से हल किया गया, जिससे छह प्रतिक्रिया उत्पादों के स्पष्ट संरचनात्मक निर्धारण की अनुमति मिली, दो एनैन्टीओमर वाले अंशों में से एक। वाइनमेकिंग और वाइन एजिंग के दौरान वाइन में उनकी उपस्थिति और विकास की जांच के लिए इन उत्पादों को ऑक्सीकरण मार्कर के रूप में उपयोग किया जा सकता है।

कीवर्ड: ऑक्सीकरण मार्कर;(प्लस)-कैटेचिन; फेनोलिक एनएमआर सिग्नल; लैकेस; कैडमियम नाइट्रेट; पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज

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1 परिचय

polyphenolsप्रकृति में व्यापक रूप से मौजूद रासायनिक यौगिकों का एक परिवार है। वे चाय [1], कोको [2,3], ब्लूबेरी [4], अंगूर [5 लीटर, और वाइन [6] जैसे किण्वित उत्पादों में महत्वपूर्ण मात्रा में पाए जाते हैं। प्राथमिक ऑक्सीकरण लक्ष्य J7,8 होने के कारण, पॉलीफेनोल्स की रासायनिक संरचना लगातार विकसित होती है। ये परिवर्तन कई प्रकार के भोजन के ऑर्गेनोलेप्टिक गुणों को प्रभावित करते हैं; वे खाद्य ब्राउनिंग [9] और वाइन की संवेदी विशेषताओं के संशोधनों [10,11] जैसी घटनाओं के लिए जिम्मेदार हैं। एनोलॉजी में, यह ऑक्सीकरण घटना अंगूर या वाइन में होती है। एंजाइमेटिक ऑक्सीकरण के संबंध में, ब्राउनिंग के लिए जिम्मेदार मुख्य एंजाइम ऑक्सीडोरेक्टेस हैं, अधिक सटीक रूप से,पॉलीफेनोल ऑक्सीडेजबोट्रीटिस सिनेरिया [12] द्वारा उत्पादित अंगूर और लैकेस में मौजूद।

एंजाइमीऑक्सीकरणमुख्य रूप से अंगूर में होता है, लेकिन आगे वाइन ब्राउनिंग रासायनिक ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाओं के कारण हो सकता है |7,13] या बोट्रीटिस सिनेरिया लैकेस के कारण जो वाइन की उम्र बढ़ने के दौरान बहुत स्थिर हो सकता है। फेनोलिक सबस्ट्रेट्स पर दो ऑक्सीकरण एंजाइमेटिक गतिविधियां हो सकती हैं: मोनोफेनॉल ऑक्सीडेज गतिविधि जो मौजूदा हाइड्रॉक्सिल समूह की आसन्न स्थिति के हाइड्रॉक्सिलेशन द्वारा विशेषता है और ऑर्थो-डिहाइड्रॉक्सीबेन्जेन के ऑर्थो-बेंजोक्विनोन के ऑक्सीकरण के अनुरूप डिफेनोल ऑक्सीडेज गतिविधि।

इंटरनेशनल यूनियन ऑफ बायोकैमिस्ट्री एंड मॉलिक्यूलर बायोलॉजी (एनसी-आईयूबीएमबी) की नामकरण समिति के अनुसार, इन एंजाइमेटिक गतिविधियों को ईसी 1- ऑक्सीडाइरेक्टेसेस के अनुरूप वर्ग एंजाइमों द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है। उनमें से, पॉलीफेनोल ऑक्सीकरण को उत्प्रेरित करने वाले ऑक्सीडोरडक्टेस के तीन मुख्य वर्ग हैं ईसी1.11.4.18.1 (मोनोफेनॉल मोनोऑक्सीजिनेज), ईसी1.11.1 (पेरोक्सीडेज/पीओडी), और ईसी 1.1.0.3 (डिफेनोल पर अभिनय करने वाले ऑक्सीडोरडक्टेस)।

यह अंतिम वर्ग विभिन्न उपवर्गों में विभाजित है, और उनमें से दो इस अध्ययन के लिए विशेष रूप से दिलचस्प दिखाई दिए: ईसी1.10.3.1 (पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज/पीपीओ) और ईसी1.10.3.2 (लैकेस) (पूरक सामग्री चित्र एस1 देखें)।

पीपीओ, लैकेस और पेरोक्सीडेज मुख्य रूप से अंगूर प्रसंस्करण के दौरान ब्राउनिंग के लिए जिम्मेदार ऑक्सीडोरक्टेस हैं [13]। पीओडी के कारण होने वाला ब्राउनिंग फलों में नगण्य होता है लेकिन पीपीओ के साथ मिलाने पर फिनोल का क्षरण बढ़ सकता है [15]। पीपीओ स्वाभाविक रूप से अंगूर में मौजूद होता है और मोनोफेनॉल के ऑक्सीकरण को कैटेचोल और कैटेचोल के भूरे रंग के रंगद्रव्य [8,13,16] को उत्प्रेरित करने में सक्षम है। बोट्रीटिस-संक्रमित अंगूरों में पाए जाने वाले लैकेसेस में व्यापक एक्शन स्पेक्ट्रम होता है|17|क्योंकि वे कई अलग-अलग सबस्ट्रेट्स के ऑक्सीकरण को उत्प्रेरित कर सकते हैं। मुख्य लैकेसेस के ऑक्सीकरण लक्ष्य 1-2 और 1-4 डाइहाइड्रॉक्सीबेन्जीन रहते हैं।

वाइन में, ऑक्सीकरण (पीपीओ या लैकेसेस) द्वारा उत्पादित बेंजोक्विनोन उनके रेडॉक्स गुणों और इलेक्ट्रॉनिक समानता के आधार पर आसानी से आगे की प्रतिक्रियाओं से गुजर सकता है [15]। वे या तो इलेक्ट्रोफाइल के रूप में कार्य कर सकते हैं और एमिनो डेरिवेटिव्स के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं [18] या ऑक्सीडेंट के रूप में कार्य कर सकते हैं और फेनोलिक सबस्ट्रेट्स के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं। उनके रासायनिक संरचना (क्विनोन या अर्ध-क्विनोन) के आधार पर, बेंज़ोक्विनोन विभिन्न ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया उत्पादों को जन्म दे सकता है। एक तटस्थ पीएच पर, (प्लस) - कैटेचिन को ए-रिंग स्थिति C5 या C7 पर क्विनोन में ऑक्सीकृत किया जाएगा और छह संभावित डिमेरिक आइसोमर्स के गठन की ओर ले जाएगा, जो बी-रिंग स्थिति C2', C5', या के बीच एक लिंकेज को दर्शाता है। ऊपरी कैटेचिन इकाई का C6' और निचली इकाई की A-रिंग स्थिति C6 या C8 [19,20]। डिहाइड्रोडिकेटचिन इस युग्मन [21] का एक प्रसिद्ध उत्पाद है। संरचनाओं की लेबलिंग स्थिति चित्र 1 में प्रदर्शित की गई है। अम्लीय परिस्थितियों में, अर्ध-क्विनोन रूप बी-रिंग (स्थिति OH3'या OH4') पर भी मौजूद हो सकते हैं और चार संभावित डिमेरिक आइसोमर्स [20,22] के साथ ले जा सकते हैं। ऊपरी कैटेचिन इकाई और निचली इकाई की ए-रिंग (स्थिति C6 या C8)। पिछले अध्ययनों [22,23] में कैटेचिन एंजाइमेटिक ऑक्सीकरण की जांच की गई थी, और संबंधित ऑक्सीकरण उत्पादों को एचपीएलसी [24] द्वारा विशेषता दी गई थी, हालांकि अधिक दुर्लभ रूप से पृथक और कभी भी पूरी तरह से एनएमआर द्वारा विशेषता नहीं थी।

इस कार्य का उद्देश्य सबसे पहले यूएचपीएलसी-एमएस द्वारा डिमेरिक (प्लस) -कैटेचिन ऑक्सीकरण उत्पादों के प्रोफाइल की तुलना तीन ऑक्सीडोरडक्टेस अर्क की उपस्थिति में करना था, अर्थात, अंगूर से निकाले गए पीपीओ, बोट्रीटाइज्ड स्वीट वाइन में मौजूद फंगस बोट्रीटिस सिनेरिया से लैकेस। [14], और ट्रैमेट्स वर्सिकलर से लैकेस।

दूसरा उद्देश्य ट्रैमेट्स वर्सिकलर से लैकेस के साथ प्राप्त एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा कुछ डिमेरिक ऑक्सीकरण उत्पादों की संरचनाओं को अर्ध-संश्लेषण और विशेषता देना था।

2. परिणाम और चर्चा

2.1. डिमेरिक रिएक्शन प्रोडक्ट्स प्रोफाइल की तीन अलग-अलग ऑक्सीडोरडक्टेस और (प्लस) के साथ तुलना - कैटेचिन

(प्लस) - कैटेचिन को पहले मॉडल वाइन सॉल्यूशन में पीएच 3.6 पर ट्रैमेट्स वर्सिकलर से लैकेस की उपस्थिति में ऑक्सीकृत किया गया था। डिमेरिक अंश को अवशिष्ट (प्लस) -कैटेचिन और अन्य बहुलक अंशों से अलग करने के बाद, आठ प्रमुख अंशों को यूएचपीएलसी-यूवी-एमएस द्वारा एकत्र और विश्लेषण किया गया था, जो अवधारण समय क्रम (तालिका 1) को बढ़ाने में एन 1 से एन 8 तक नोट किया गया था। सकारात्मक मोड में इलेक्ट्रोस्प्रे मास स्पेक्ट्रा ने आयन चोटियों [एम प्लस एच] प्लस को एम / जेड 579 पर एन 1 से एन 6 के लिए दिखाया, काल्पनिक रूप से दो कैटेचिन इकाइयों के बीच एक बंधन द्वारा गठित एक डिमर के अनुरूप, और [एम प्लस एच] प्लस पर N7 और N8 के लिए m/577, काल्पनिक रूप से एक अतिरिक्त लिंकेज के गठन का सुझाव देता है।

ये आठऑक्सीकरणपिछले कार्यों [25,26] में एक टैनिन अंश के रासायनिक विध्रुवण के बाद अंशों को संभावित रूप से देखा गया था और संभवतः वही हो सकता है जो पहले से ही गयोट एट अल द्वारा वर्णित हैं। [20], भले ही प्रायोगिक स्थितियां थोड़ी भिन्न हों। दरअसल, इस पिछले अध्ययन में, आठ अंशों को प्राप्त करने के लिए pH3 और 6 पर एक कच्चे पीपीओ अर्क का उपयोग किया गया था। वर्तमान अध्ययन में, मॉडल वाइन समाधान में पीएच 3.6 पर तीन अलग-अलग एंजाइमों की तुलना की गई थी। तीन अलग-अलग एंजाइमों (ट्रैमेट्स वर्सीकोलर से लैकेस, बोट्रीटिस सिनेरिया से लैक-केस, और अंगूर से निकाले गए पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज) के साथ प्राप्त प्रमुख ऑक्सीकरण अंशों का एलसी-एमएस तुलनात्मक विश्लेषण तालिका 2 में प्रस्तुत किया गया है। आठ अंशों में से प्रत्येक के लिए, अवधारण समय विभिन्न एंजाइमों के साथ लगभग समान थे, और समान एम/जेड एमएस विश्लेषण के साथ निर्धारित किए गए थे। ये परिणाम इस परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि प्रत्येक एंजाइम के लिए समान अंश प्राप्त किए गए थे, जिसमें गयोट एट अल द्वारा परिकल्पित समान संरचनाओं वाले उत्पाद शामिल थे। [20]। लोपेज़-सेरानो और रोस बार्सेल6 [27] ने दो अलग-अलग एंजाइमों के साथ (प्लस) -कैटेचिन ऑक्सीकरण उत्पादों का तुलनात्मक अध्ययन भी किया: पेरोक्सीडेज और पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज, दोनों स्ट्रॉबेरी से निकाले गए। उन्होंने निष्कर्ष निकाला कि दो एंजाइमों से प्राप्त उत्पाद गुणात्मक रूप से समान थे। M/z=578 Th और Rt=15 के साथ N4' नामक एक अतिरिक्त यौगिक बोट्रीटिस सिनेरिया और निकाले गए पीपीओ से लैकेस के साथ प्रयोगों में देखा गया था, लेकिन ट्रैमेट्स वर्सिकलर से लैकेस के साथ नहीं, जो संभावित अंतरों का सुझाव देता है। इन एंजाइमों के लिए प्रतिक्रियाशीलता में।

2.2. 1H-NMR फेनोलिक और एलीफैटिक OH सिग्नल पर भौतिक-रासायनिक मापदंडों का अध्ययन और अनुकूलन

प्रोसायनिडिन डिमर का संरचनात्मक लक्षण वर्णन एनएमआर विश्लेषण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। विशेष रूप से, HMBC और/या ROESY सहसंबंध स्पेक्ट्रा [28,29] (आंकड़े S2 और S3) का उपयोग करके इकाइयों के बीच सटीक संबंध स्थिति निर्धारित की जा सकती है। ईथर-प्रकार (COC) बांड के मामले में, हाइड्रॉक्सिल सिग्नल प्रोटॉन का एट्रिब्यूशन आवश्यक है। यह सीसी लिंकेज के मामले में भी महत्वपूर्ण हो सकता है यदि कुछ स्निग्ध या सुगंधित प्रोटॉन ओवरलैप होते हैं या यदि कुछ प्रमुख सहसंबंध गायब हैं। हालांकि, एक कामोत्तेजक विलायक में भी, पॉलीफेनोल्स के हाइड्रॉक्सिल प्रोटॉन अक्सर व्यापक संकेतों के रूप में दिखाई देते हैं जिससे कोई संरचनात्मक जानकारी प्राप्त नहीं की जा सकती है [30]। इस मुद्दे को के निशान जोड़कर अस्थायी रूप से संबोधित किया गया था

नमूना समाधान में सीडी (एनओ 3) 2। दरअसल, 'ओएच समूहों के एच व्यापक संकेत इन ओएच प्रोटॉन और विलायक या विलेय में अन्य प्रोटॉन के बीच अंतर-आणविक आदान-प्रदान के कारण होते हैं। इंटरमॉलिक्युलर बॉन्ड को कम करके, नमूनों में कैडमियम नाइट्रेट की उपस्थिति इन एक्सचेंजों को कम कर सकती है, इस प्रकार ओएच प्रोटॉन संकेतों की तीक्ष्णता में सुधार होता है।

2.2.1. कैडमियम मिलाने का प्रभाव

फ्रीज-सुखाने के बाद, पांच अंश N2, N3, N4, N6, और N8 एसीटोन-डीजी में घुलनशील थे। फिर, 1डी प्रोटॉन एनएमआर स्पेक्ट्रा 25 डिग्री से पहले (चित्रा 2ए) और कैडमियम की छोटी मात्रा (चित्रा 2बी) को जोड़ने के बाद हासिल किया गया था। शुद्ध एसीटोन-डी में, सभी अंशों के फेनोलिक ओएच प्रोटॉन व्यापक चोटियों के रूप में दिखाई देते हैं। कैडमियम के जुड़ने के बाद, इन प्रोटॉन ने भिन्न N6 और N8 के मामले में अत्यधिक हल किए गए संकेत दिखाए, जबकि भिन्न N2, N3 और N4 के लिए संकेत केवल थोड़े तेज थे। यह भी उल्लेख किया जाना चाहिए कि सीडी सामग्री में वृद्धि का ओएच सिग्नल रिज़ॉल्यूशन पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, क्योंकि जब नमूनों में सीडी की क्रमिक छोटी मात्रा को जोड़ा गया (डेटा नहीं दिखाया गया) तो पीक लिनिविथ की कोई तीक्ष्णता या व्यापकता नहीं देखी गई।

उत्पादों N2, N3 और N4 से अत्यधिक हल किए गए फेनोलिक OH संकेतों को अतिरिक्त सुखाने और पुन: घुलनशीलता (चित्रा 2C,D) के लिए धन्यवाद प्राप्त किया गया था।

भिन्नों के बीच सीडी जोड़ पर व्यवहार के अंतर को आणविक अंतःक्रियाओं की ताकत से समझाया जा सकता है: एन 6 और एन 8 की तुलना में एन 2, एन 3 और एन 4 के मामले में मजबूत, इन बंधनों को तोड़ने के लिए एक और कदम आवश्यक है।

किसी भी स्थिति में अत्यधिक हल किए गए फेनोलिक ओएच सिग्नल प्राप्त करने के लिए सीडी का उपयोग करते समय यह अतिरिक्त कदम महत्वपूर्ण कदम हो सकता है, जो भी नमूनों की उत्पत्ति, संश्लेषण प्रतिक्रिया, या प्राकृतिक पॉलीफेनोलिक उत्पाद हैं।

के असंदिग्ध संरचनात्मक लक्षण वर्णन से संबंधित एक पिछला कार्यविशेषता रहेकैडमियम नाइट्रेट जोड़ने के लिए अत्यधिक हल किए गए ओएच फेनोलिक एनएमआर संकेतों का उपयोग करने वाले डिमर को 1996 में प्रकाशित किया गया था [30]। हमारी जानकारी के लिए, तब से इस पद्धति का उपयोग करने वाला कोई अन्य शोध पत्र प्रकाशित नहीं हुआ है। बाद में इस लक्ष्य तक पहुँचने के लिए अन्य जाँचें की गईं, या तो पिक्रिक एसिड डोज़्ड परिवर्धन [31] या कम अधिग्रहण तापमान [32] का उपयोग करके। जैसा कि ऊपर वर्णित है, सीडी जोड़ के साथ ओएच शिखर तीक्ष्णता पर निर्णायक प्रभाव प्राप्त करने के लिए आवश्यक आगे के कदम द्वारा इसे समझाया जा सकता है। हालांकि, कैडमियम महान मूल्य का प्रतीत होता है, क्योंकि कम तापमान पर पिक्रिक एसिड या एनएमआर स्पेक्ट्रा अधिग्रहण के विपरीत, सटीक मात्रा में जोड़ने की आवश्यकता के बिना अत्यधिक हल किए गए संकेत प्राप्त किए जा सकते हैं।

2.2.2. तापमान का प्रभाव

तापमान में 25 डिग्री सेल्सियस से 15 डिग्री तक की कमी से फेनोलिक ओएच या स्निग्ध ओएच संकेतों की तीक्ष्णता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। फिर भी, विनिमेय प्रोटॉन चोटियों के डाउनफील्ड बदलाव ने हमें कुछ अतिव्यापी फेनोलिक और स्निग्ध ओएच संकेतों को अलग करने की अनुमति दी, जिससे उनकी पहचान अधिक स्पष्ट हो गई (चित्र 3)। तापमान में कमी से, प्रोटॉन विनिमय दर कम हो गई थी, और कोई तेज स्निग्ध ओएच चोटियों [31] की उम्मीद कर सकता है। अच्छी तरह से हल किए गए स्निग्ध ओएच संकेतों को प्राप्त करने के लिए 15 डिग्री का तापमान स्पष्ट रूप से कम नहीं है। हालाँकि, इसने हमें नमूने N3 और N6 में दो स्निग्ध OH प्रोटॉन और नमूना N8 में एक के प्रतिध्वनि को स्पष्ट रूप से पहचानने की अनुमति दी। नमूना N2 के स्पेक्ट्रम ने दो OH स्निग्ध प्रोटॉन संकेतों को भी प्रदर्शित किया, जो 15 डिग्री (चित्र 2E) की तुलना में 25 डिग्री C पर अधिक भिन्न थे। नमूना N4 के मामले में, स्निग्ध OH से उत्पन्न होने वाले संकेत केवल आंशिक रूप से दिखाई दे रहे थे स्पेक्ट्रा, चाहे तापमान 25 डिग्री या 15 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया था, लगातार अतिव्यापी होने के कारण (चित्र 2ई)।

2.3. डिमेरिक मानकों की संरचनात्मक विशेषता-एनएमआर स्पेक्ट्रम विश्लेषण

भिन्न N2, N3, N4, N6, और N8 के NMR स्पेक्ट्रा ने दिखाया कि ऑक्सीकरण उत्पाद उच्च शुद्धता के थे क्योंकि इन उत्पादों की तुलना में अन्य ज्ञात यौगिकों की संकेत तीव्रता 10 प्रतिशत से कम थी।

सभी स्पेक्ट्रा में, कैटेचिन इकाइयों के विशिष्ट चार एलएच रासायनिक बदलाव क्षेत्रों को प्रतिष्ठित किया जा सकता है (चित्रा 2सी): पाइरन रिंग्स (सी रिंग्स) के स्निग्ध प्रोटॉन के संकेत 2.3 से 5 तक के क्षेत्र में पाए जाते हैं।0 पीपीएम, और रेसोरिसिनॉल रिंग्स (ए रिंग्स) और कैटेकोल रिंग्स (लाता है) के एरोमैटिक सिग्नल प्रोटॉन क्रमशः 5.5 से 6.3 पीपीएम और 6.3 से 7.1 पीपीएम तक। ए और बी दोनों रिंगों के ओएच फिनोल सिग्नल 7.1 से 10 पीपीएम तक दिखाई दिए। दोनों अंशों के एनएमआर स्पेक्ट्रा ने निरंतर तीव्रता अनुपात में कैटेचिन इकाइयों के अलग-अलग सिग्नल सेटों की उपस्थिति को दिखाया: डिमर की उपस्थिति के अनुसार भिन्न एन 2, एन 3, एन 6 और एन 8 के स्पेक्ट्रा में संकेतों के दो सेट देखे गए थे, और N4 स्पेक्ट्रा में चार सेट, जो एक टेट्रामर, दो डिमर या विभिन्न ओलिगोमर्स के मिश्रण के अनुरूप हो सकते हैं, यानी एक ट्रिमर प्लस एक मोनोमर। अंश N4 में मौजूद उत्पादों के oligomerization की डिग्री निर्धारित करने के लिए, एक 'H DOSY प्रयोग किया गया था जिसमें दोनों अंशों N4 और N2 के विभाज्य युक्त मिश्रण का उपयोग किया गया था। सभी संकेतों के प्रसार गुणांकों ने समान मान प्रदर्शित किए (चित्र 4), जो अंश N4 में कैटेचिन के दो डिमर की उपस्थिति को दर्शाता है।

पूरी तरह से हल किए गए ओएच फिनोल संकेतों के लिए धन्यवाद जो विश्वसनीय मात्रात्मक परिणाम प्रदान करते हैं, कैटेचिन इकाइयों के बीच संबंध का प्रकार सीधे शिखर सतह क्षेत्र एकीकरण से घटाया जा सकता है। इस प्रकार, दोनों भिन्नों, N3 और N6 के लिए, एक OHफिनोल की कमी (या तो रिसोरसिनॉल या कैटेचोल रिंग से संबंधित) और एक रेसोरिसिनॉल एरोमैटिक प्रोटॉन की कमी ने ईथर प्रकार के एक इंटरफ्लेवेनिक लिंकेज (IFL) का संकेत दिया, जिसका अर्थ है कि एक ए में एक विपक्ष। या B रिंग और A रिंग में C6 या C8 स्थिति। नमूना N2 के मामले में, दो सुगंधित प्रोटॉन की कमी थी, एक B रिंग का और एक A रिंग का, जिसका अर्थ CA-CB IFL था। अंश N4 के 1D 'H स्पेक्ट्रम ने दिखाया कि B रिंग के दो प्रोटॉन की कमी थी, साथ ही A रिंग के दो प्रोटॉन भी थे। अंश N4 की डिमर इकाइयों के बीच के बंधन इस प्रकार दोनों CC प्रकार के होते हैं। भिन्न N8 का स्पेक्ट्रम अन्य चार से काफी भिन्न था। कुछ संकेत कैटेचिन इकाइयों के विशिष्ट थे, जिसमें तीन ओएच फिनोल, एक सुगंधित ए रिंग और एक बी रिंग प्रोटॉन की कमी थी, साथ ही साथ एक स्निग्ध ओएच भी था। दूसरी ओर, कुछ अन्य एनएमआर संकेत कैटेचिन इकाई के असामान्य हैं: मिथाइलीन के साथ 13 सी रासायनिक बदलाव (~ 40 पीपीएम) और एक कीटोन समूह (~ 192 पीपीएम)।

C, A और B रिंगों के प्रोटॉन स्पिन सिस्टम को 'H 1D और 1H 2D TOCSY स्पेक्ट्रा (नहीं दिखाया गया) दोनों का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। दो एबीएमएक्स सी-रिंग स्पिन सिस्टम (कैटेचिन के विशिष्ट) अंश एन 2, एन 3, एन 6, और एन 8 के स्पेक्ट्रा में और चार अंश एन 4 के लिए देखे गए थे। भिन्नों के स्पेक्ट्रा में N2, N3, N6, और N8, दो मेटा-युग्मित युगल (J~2Hz) और सुगंधित ए रिंग क्षेत्र में एक को क्रमशः गैर-लिंक्ड कैटेचिन इकाई के ए रिंग प्रोटॉन को सौंपा गया था। और C6-या C8-लिंक्ड कैटेचिन इकाई के A वलय अवशिष्ट प्रोटॉन में। N4 के स्पेक्ट्रा में, दो डिमर की उपस्थिति के कारण, चार मेटा-युग्मित डबल और दो सिंगलेट्स का पता लगाया गया और ऊपर वर्णित अनुसार असाइन किया गया। बी रिंग प्रोटॉन सिस्टम भी इन स्पेक्ट्रा से आसानी से निर्धारित किए गए थे और हमें अंश एन 3 और एन 6 के डिमर के लिए दो एबीएम प्रोटॉन स्पिन सिस्टम की पहचान करने की अनुमति दी थी, जबकि एक एबीएम और एक एबी प्रोटॉन स्पिन सिस्टम डिमर एन 2 और एक एबीएम के लिए पाए गए थे। डिमर N4 के लिए एक AM प्रोटॉन स्पिन सिस्टम। डिमर N8 ने कैटेचिन मोनोमर के विशिष्ट केवल एक एबीएम बी-रिंग स्पिन सिस्टम का प्रदर्शन किया।

2.3.1. भिन्न N2, N3, N4 और N6 के डिमर्स के IFL की रिंग स्थिति का निर्धारण

ए रिंग ऑफ डिमर्स (यानी, C6A-या C8A-पोजिशन) पर स्थित ब्रिज की स्थापना के लिए CA-लिंक्ड कैटेचिन यूनिट के अवशिष्ट HA प्रोटॉन के एट्रिब्यूशन की आवश्यकता होती है। अत्यधिक हल किए गए फेनोलिक ओएच संकेतों के लिए धन्यवाद, एक आसान प्रारंभिक बिंदु ए रिंग-लिंक्ड इकाइयों के दो ओएचफेनॉल प्रोटॉन की पहचान थी, यानी ए रिंग जो कि

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 पीपीएम） जिन्हें क्रमशः सी7ए और सी8ए के लिए आसानी से जिम्मेदार ठहराया गया था। एक बार C6A और C8A असाइन किए जाने के बाद, अवशिष्ट HA प्रोटॉन को सीधे HSQC स्पेक्ट्रा के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इस प्रकार यह पाया गया कि यह अवशिष्ट HA प्रोटॉन सभी भिन्नों N2, N3, N4, N6 के लिए H6A था। कैटेचिन इकाइयों के बीच IFL ने सभी डिमर के लिए C8A स्थिति को निहित किया।

2.3.2. आईएफएल की बी रिंग स्थिति का निर्धारण

भिन्न N2 और N4 के डिमर। अंश N2 के स्पेक्ट्रा ने दो अलग-अलग प्रकार के B रिंग प्रोटॉन स्पिन सिस्टम दिखाए: एक AMX गैर-लिंक्ड यूनिट के B रिंग से संबंधित है, और एक AM जिसमें लगभग 8 Hz का युग्मन स्थिरांक है, H6'B और H5 की विशेषता है। C2'B से जुड़ी इकाई का B। N2 डिमर की इकाइयों के बीच संबंध इस प्रकार C2'B-C8A है। अंश N4 के NMR स्पेक्ट्रा ने अलग-अलग B स्पिन सिस्टम भी दिखाए: दो AMX, गैर-लिंक्ड B-रिंग के अनुरूप, और दो AXspin सिस्टम, दोनों लगभग 2 Hz के युग्मन स्थिरांक प्रदर्शित करते हैं, जो H2'B और H6 की विशेषता हैं। C5'B से जुड़ी इकाइयों के B प्रोटॉन। H6'Band C8A के बीच लंबी दूरी के 'H/13C सहसंबंधों की उपस्थिति, जो दो डिमर के HMBC स्पेक्ट्रा में देखे गए थे, C5/'B-C8A लिंकेज (चित्र 5) के अनुसार हैं।

भिन्न N3 और N6 के डिमर। भिन्न N3 और N6 के स्पेक्ट्रा ने दो AMX B-रिंग प्रोटॉन सिस्टम की उपस्थिति और एक OH फिनोल सिग्नल की कमी को दिखाया। चूंकि डिमर इकाइयों के सभी ओएचए फेनोलिक प्रोटॉन की पहचान की गई थी (जैसा कि ऊपर वर्णित है), लापता ओएच फेनोलिक सिग्नल या तो ओएच 3'बी या ओएच 4'बी हो सकता है।

OH स्थिति (3'B या 4'B) को क्रमशः H2'Bor H5'B के साथ ROE सहसंबंधों के माध्यम से आसानी से निर्धारित किया जा सकता है, या चित्र 5 में सचित्र के रूप में लंबी दूरी के HMBC सहसंबंधों का उपयोग करके आसानी से निर्धारित किया जा सकता है।

बी रिंगों के अवशिष्ट ओएच का एट्रिब्यूशन या तो लंबी दूरी की एचएमबीसी या आरओईएसवाई सहसंबंधों का उपयोग करके आसानी से किया गया था, जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है। डिमर एन 3 के मामले में, एच 5'बी और अवशिष्ट ओएच के बीच एक आरओई सहसंबंध देखा गया था। कैटेचिन इकाई का 'बी' अपनी बी रिंग से जुड़ा हुआ है। इस OH को इस प्रकार OH4'B के रूप में पहचाना गया। भिन्न N6 के मामले में, अवशिष्ट OH'B को OH3'B को सौंपा गया था, क्योंकि इस OH और H2'B के बीच ROE सहसंबंध देखा गया था। लंबी दूरी की HMBC सहसंबंध इन विशेषताओं के अनुसार हैं। इन दो डिमरों की लिंकेज स्थिति तब निम्नानुसार निर्धारित की गई थी: CO3'B-C8A और CO4'B-C8A N3 और N6 के लिए। क्रमश।

अंश N8. डिमर N8 के स्पेक्ट्रम विश्लेषण से पता चला है कि इस डिमर की एक इकाई कैटेचिन है जिसमें दो लिंकेज स्थितियाँ होती हैं, एक A रिंग, एक C8A पर, और दूसरी C-O7A स्थिति में, क्योंकि प्रोटॉन H8A और OH7A हैं गुम। इस डिमर की दूसरी इकाई ने एकवचन वर्णक्रमीय विशेषताओं का प्रदर्शन किया, जो बी रिंग एरोमैटिकिटी के नुकसान और बी और सी दोनों रिंगों पर कई लिंकेज पोजीशन की उपस्थिति को दर्शाता है।

बी रिंग से उत्पन्न होने वाले एच एनएमआर सिग्नल 2.49 और 2.71 पीपीएम पर दो डबल थे, जो एक मिथाइलीन समूह के विशिष्ट ~ 15 हर्ट्ज (12.03 पीपीएम) के जेमिनल कपलिंग को प्रदर्शित करते हैं और एक इथाइलेनिक प्रोटॉन से उत्पन्न होने वाले 6.38 पीपीएम पर एक सिंगलेट। चूंकि ये मेथिलीन और एथिलीन प्रोटॉन युग्मित नहीं थे, इसलिए उनके 2'B और 5'B की स्थिति में होने की संभावना है। एचआईएमबीसी स्पेक्ट्रम ने सभी सहसंबंधों को दिखाया, इन बी रिंग कार्बन के सटीक गुणों की इजाजत दी, जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है। इस इकाई के एच 2 सी ने बी रिंग कार्बन के साथ तीन सहसंबंध दिए: एक ~ 45 पीपीएम पर मेथिलिन कार्बन है, जिसे इस प्रकार जिम्मेदार ठहराया गया था C2'B, और शेष दो, ~ 90 पीपीएम और ~ 162 पीपीएम पर प्रतिध्वनित कार्बन के साथ, जिसे C1'B और C6'B.H5'B को सौंपा जा सकता है, ने इस B रिंग के दो चतुर्धातुक कार्बन के साथ केवल मजबूत 3J सहसंबंध दिए। : एक कार्बन है जिसे पहले C3'B (~ 95 पीपीएम) को सौंपा गया था, और दूसरा, जो ~ 90 पीपीएम पर प्रतिध्वनित होता है, इस प्रकार C1'B को जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। तब ~162 पीपीएम पर कार्बन को C6'B घटाया गया था।

C3'B स्थिति (~ 95 ppm) पर एक स्निग्ध OH (~ 5.8 पीपीएम) की उपस्थिति दोनों H2'B प्रोटॉन के साथ इसके ROE सहसंबंध के माध्यम से निर्धारित की गई थी। इसके अलावा, OH3/B ने HMBC सहसंबंध को ~ 192.5 ppm पर एक चतुर्धातुक कार्बन के साथ दिया, जो C4'B स्थिति में कीटोन समूह की विशेषता है।

लगभग 40 पीपीएम के इस सी1'बी का परिरक्षण बी रिंग एरोमैटिकिटी के नुकसान के अनुसार है। इसके अलावा, दूसरी इकाई की C7A स्थिति में OH की कमी एक ईथर लिंकेज C1'BO-C7A के अनुरूप है।

एनएमआर डेटा से पता चला है कि इस यूनिट के सी रिंग में कोई ओएच3सी नहीं है। C3C-O-C3'B लिंकेज की उपस्थिति लगभग 1.5ppm के C3C के परिरक्षण के साथ-साथ C3'B के रासायनिक बदलाव के अनुसार होती है जो हेमिकेटल कार्बन (95 पीपीएम) के लिए विशिष्ट है।

कुल मिलाकर, एनएमआर स्पेक्ट्रल डेटा हमें यह निष्कर्ष निकालने की अनुमति देता है कि यह डिमर डिहाइड्रोकैटेचिन ए से मेल खाता है जिसे पहले विंग्स एट अल द्वारा वर्णित किया गया था। [33] और फिर गयोट एट अल द्वारा। [20]।

इन एनएमआर विश्लेषणों द्वारा निर्धारित छह डिमेरिक यौगिकों की संरचनाएं चित्र 6, एन 2, एन 3, एन 6, और एन 8 में शुद्ध उत्पाद हैं, और एन 4 दो आइसोमर्स का मिश्रण है।

3. सामग्री और तरीके

3.1.रसायन

(प्लस)-कैटेचिन हाइड्रेट 98 प्रतिशत से अधिक या उसके बराबर; लैकेसेज़ फ्रॉम ट्रैमेट्स वर्सीकलर(0.94 U·mg-1); सोडियम फॉस्फेट डिबासिक डाइहाइड्रेट 98 प्रतिशत से अधिक या उसके बराबर; साइट्रिक एसिड (ACS अभिकर्मक, कैडमियम नाइट्रेट टेट्राहाइड्रेट 99.997 प्रतिशत; फॉर्मिक एसिड और एम्बरलाइट XAD7HP सिग्मा-एल्ड्रिच से प्राप्त किए गए थे) (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए)। एसीटोन-डीजी को यूरीसो-टॉप (सारब्रुकन, जर्मनी) और ट्राइफ्लोरोएसेटिक से खरीदा गया था। एसिड (TFA) रोथ लेबो (कार्लज़ूए, जर्मनी) से। पानी LC-MS, एसीटोनिट्राइल LC-MS (ACN), और मेथनॉल LC-MS (MeOH) सभी VWR (रेडनर, PA, यूएसए) से थे।

3.2. मॉडल वाइन समाधान की तैयारी

मॉडल वाइन सॉल्यूशन एक इथेनॉल / पानी का घोल (12/88; o / o) था जिसमें 0 .033 M टार्टरिक एसिड होता था, जिसे NaOH 1 M [34] के साथ pH 3.6 में समायोजित किया जाता था।

3.3. कच्चे अंगूर पीपीओ अर्क

पीपीओ अर्क को सिंगलटन एट अल द्वारा पहले वर्णित के रूप में तैयार किया गया था। [35]। जमे हुए अंगूरों को पहले एसीटेट बफर (1.5 एम, पीएच5; 10 जीएल-आई एस्कॉर्बिक एसिड) में मिलाया गया था। मिश्रण को तब फ़िल्टर किया गया और सेंट्रीफ्यूज किया गया (3000 ग्राम; 10 मिनट)। अवशेषों को अंत में एसीटोन (80 प्रतिशत) से धोया गया और हवा में सुखाया गया।

3.4. बोट्रीटिस सिनेरिया से लैकेस

बोट्रीटिस सिनेरिया से लैकेस को क्विजादा-मोरिन एट अल द्वारा वर्णित के रूप में प्राप्त किया गया था। [36]। यह VA612 स्ट्रेन (2005 में पिनोट नोयर कल्टीवेर से हौटविलर्स, शैम्पेन, फ्रांस में एक दाख की बारी में एकत्रित) से तैयार किया गया था। संक्षेप में, ठोस माल्ट खमीर माध्यम पर संस्कृतियों को एक सप्ताह के लिए 24 डिग्री पर नीली रोशनी में छोड़ दिया गया था। इसके बाद बीजाणुओं को खुरच कर एक 5 0 0 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में टीका लगाया गया, जिसमें 125 एमएल संस्कृति माध्यम (4 {{3 0}} जीएल -1 ग्लूकोज, 7 gL{{10}}ग्लिसरॉल, 0.5 g·L-1L-histidine,0.1 g:L-1 CuSO,1.8gL-1 NaNO3,0.5g:L -1 KCl,0.5gL-1 CaCl2·H2O,0.05g:L-1 FeSO4.7H2O,1.0g L-1KH2PO4, और 0.7 gL-1 MgSO 4-7H2O)। ऊष्मायन के 3 दिनों के बाद और उसी पिछले माध्यम में 2 दिनों की वृद्धि के बाद, गैलिक एसिड (2 gL -1) को पूर्व-संस्कृतियों में जोड़ा गया था। 5 दिनों के बाद, तरल माध्यम को फ़िल्टर किया गया था, और सतह पर तैरनेवाला एक क्विक्सस्टैंड निस्पंदन सिस्टम (जीई हेल्थकेयर यूके, लिटिल शैल्फोंट, इंग्लैंड) में स्पर्शरेखा निस्पंदन के लिए प्रस्तुत किया गया था, जो झिल्ली से कटे हुए 30 केडीए-आणविक भार से सुसज्जित था। ध्यान अंतत: आसुत जल के विरुद्ध डायफिल्ट्रेशन के अधीन किया गया था, और केवल उन अंशों को रखा गया था जो ABTS के खिलाफ ऑक्सीडेंट गतिविधि प्रस्तुत करते थे (-80 डिग्री)।

3.5.ऑक्सीकरण प्रक्रिया

फॉस्फेट-साइट्रेट बफर में एक लैकेस समाधान (1 gL-1) पहले तैयार किया गया था और एक लैकेस अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 6g.L -1 (प्लस) -कैटेचिन समाधान (मॉडल वाइन) में जोड़ा गया था। {6}}.3 जीएल-1। प्राप्त घोल को 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर धीरे-धीरे (180 आरपीएम) उभारा गया। सांद्रता को पहले अनुकूलित किया गया था, और प्रयोग तीन प्रतियों में किया गया था।

3.6. राल एम्बरलाइट XAD7HP पर प्रतिक्रिया रोकना

एक एम्बर लाइट कॉलम को इथेनॉल (पूर्ण) के साथ वातानुकूलित किया गया था और मिली-ओ पानी के दो कॉलम वॉल्यूम से धोया गया था। पिछला लैकेस/(प्लस)-कैटेचिन प्रतिक्रिया माध्यम स्तंभ पर गिरा दिया गया था और पहले मिली-क्यूवाटर [37] के दो स्तंभ खंडों के साथ क्षालन किया गया था। स्तंभ को तब तक इथेनॉल से उपचारित किया गया था जब तक कि एकत्रित अंश बिना रंग का नहीं था। केवल इथेनॉल अंशों को रखा गया, वाष्पित किया गया, और lyophilized किया गया। उपयोग किए जाने तक पाउडर को -80 डिग्री पर भंडारित किया गया था।

3.7. फ्लैश क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके डिमेरिक अंश की शुद्धिकरण प्रक्रिया

lyophilized पाउडर को पहले फ्लैश क्रोमैटोग्राफी सिस्टम puriflash43 0 का उपयोग करके शुद्ध किया गया था, जो 280 एनएम पर एक UV डिटेक्टर और एक Purflash diol 50 um f0025 कॉलम से लैस था। बाइनरी मोबाइल चरण में एसीटोनिट्राइल (विलायक ए) और मेथनॉल (विलायक बी) शामिल थे, दोनों 0.1 प्रतिशत टीएफए के साथ अम्लीकृत थे। इंजेक्शन की एक श्रृंखला 20 एमएल · मिनट -1 की निरंतर प्रवाह दर पर निम्न ढाल का उपयोग करके की गई थी: 4.4 मिनट के लिए 100 प्रतिशत ए; 0-10 10 मिनट में प्रतिशत बी; 5 मिनट के लिए 10 प्रतिशत बी; 10-90 प्रतिशत बी 5 मिनट में; 90 प्रतिशत बी 3 मिनट के लिए; 90-10 प्रतिशत बी 2 मिनट में; 10 प्रतिशत बी 10 मिनट के लिए। इंजेक्शन की मात्रा 1mL थी (300 mg lyophilized पाउडर विलायक A के 1 mL में भंग)। हर बार तीन अलग-अलग अंश एकत्र किए गए। पहला अवशिष्ट (प्लस) -कैटेचिन के अनुरूप था, और तीसरा उच्च-आणविक-भार पॉलीफेनोल्स का मिश्रण था। दूसरा क्षालन अंश, जिसमें डिमेरिक ऑक्सीकरण उत्पादों का मिश्रण होता है, दूसरे शुद्धिकरण चरण से पहले वाष्पित और lyophilized किया गया था।

3.8. अर्ध-तैयारी क्रोमैटोग्राफिक सिस्टम का उपयोग करके डिमेरिक अंश से ऑक्सीकरण उत्पादों की शुद्धिकरण प्रक्रिया

डिमेरिक ऑक्सीकरण उत्पादों वाले अंश को एक अर्ध-प्रारंभिक बायो-रेड NGC 1 0 मध्यम-दबाव क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का उपयोग करके शुद्ध किया गया था, जो एक उलट-चरण वेरियन डायनामैक्स C18 माइक्रोसॉर्ब कॉलम (250 × 21.2 मिमी; 3 um) से सुसज्जित था। बाइनरी मोबाइल चरण में मिली-ओ पानी (विलायक ए) और 80 प्रतिशत एसीटोनिट्राइल, 20 प्रतिशत मिली-क्यू पानी 'विलायक बी' शामिल थे, दोनों 0.05 प्रतिशत टीएफए के साथ अम्लीकृत थे। लियोफिलिज्ड पाउडर के इंजेक्शन की एक श्रृंखला （300 μL） (20 मिलीग्राम विलायक ए के 200 यूएल और एसीएन के 100 यूएल में भंग) निम्नलिखित रेफरेंस शर्तों के तहत किया गया था: 4 मिनट के लिए 100 प्रतिशत ए; 0-35 46 मिनट में प्रतिशत बी;35-100 2 मिनट में प्रतिशत बी; 5 मिनट के लिए 100 प्रतिशत बी। 280 एनएम पर शुद्ध यूपीएलसी संकेतों के अनुरूप हर बार आठ अलग-अलग अंश एकत्र किए गए थे। NMR विश्लेषण से पहले प्रत्येक अंश को वाष्पित और lyophilized किया गया था।

3.9.एनएमआर विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करना

Eppendorf ट्यूबों में भारित प्रत्येक lyophilized पाउडर का लगभग 1 मिलीग्राम एसीटोन-डीजी के 500 μL में हल किया गया था। फिर, एसीटोन-डी में कैडमियम नाइट्रेट के एक केंद्रित समाधान के ~ 10 यूएल को नमूनों में जोड़ा गया, और परिणामी समाधान एनएमआर विश्लेषण के लिए 5 मिमी एनएमआर ट्यूबों में स्थानांतरित कर दिए गए। कुछ नमूनों के लिए एक अतिरिक्त कदम उठाया गया था: कैडमियम के निशान की उपस्थिति में एसीटोन-डीजी में लियोफिलिज्ड पाउडर के घुलनशीलता के बाद, नमूने सूखने के लिए वाष्पित हो गए थे और फिर सीडी के बिना अतिरिक्त एसीटोन-डी में फिर से घुलनशील थे।

3.10.उपकरण निर्दिष्टीकरण

यूपीएलसी-एमएस विश्लेषण। दो यूपीएलसी-एमएस सिस्टम का उपयोग करके प्रतिक्रियाओं की निगरानी की गई। पहले वाले का उपयोग लंबी ढाल पद्धति का उपयोग करके उत्पादों के अवधारण समय को ठीक से पहचानने के लिए किया गया था। यानी, वाटर्स रिवर्सेड-फेज अल्ट्रा-हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (यूएचपीएलसी-एमएस) के साथ मिलकर। लिक्विड क्रोमैटोग्राफी सिस्टम एक एक्विटी यूपीएलसी (वाटर्स, मिलफोर्ड, एमए, यूएसए) था जो एक फोटोडायोड एरे डिटेक्टर से लैस था। हमने Acquity UPLC HSS T3 कॉलम (1.8 um,2.1 ×150mm) का इस्तेमाल किया। स्तंभ का तापमान 25 डिग्री था। बाइनरी मोबाइल चरण में पानी में 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड (विलायक ए) और एसीटोनिट्राइल (विलायक बी) शामिल थे। पृथक्करण 0.25mL·min-1 की निरंतर प्रवाह दर पर निम्न ढाल का उपयोग करके किया गया था: 8-11 2 मिनट में प्रतिशत बी; 8 मिनट के लिए 11 प्रतिशत बी; 11-25 प्रतिशत बी 15 मिनट में; 25-55 प्रतिशत बिन 5 मिनट; 55-99 प्रतिशत बिन 1 मिनट; 99 प्रतिशत बी 4 मिनट के लिए; 99-8 प्रतिशत बिन1 मिनट; 8 प्रतिशत बी 4 मिनट के लिए इंजेक्शन की मात्रा 5 μL थी। मास स्पेक्ट्रोमीटर एक वाटर्स एक्विटी क्यूडीए इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) सरल चौगुनी (वाटर्स, मिलफोर्ड, एमए, यूएसए) था। केशिका वोल्टेज 0.8 केवी पर सेट किया गया था। मास स्पेक्ट्रा को 200-900 थिन पॉजिटिव आयन मोड के बड़े पैमाने पर हासिल किया गया था।

दूसरा यूएचपीएलसी-एमएस सिस्टम, शुद्धिकरण चरणों के दौरान तेजी से सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित किया गया था, एक एक्विटी यूएचपीएलसी एचएसएस टी 3 कॉलम （1.8 माइक्रोन, 2.1 × 1 0 0 मिमी） गर्म 38 डिग्री पर। पृथक्करण 0.55 एमएल · मिनट -1 की निरंतर प्रवाह दर पर निम्न तेज ढाल का उपयोग करके किया गया था: 0. 1-40 5 मिनट में प्रतिशत बी; 40-99 2 मिनट में प्रतिशत बी; 1 मिनट के लिए 99 प्रतिशत बी; 99-0.1 प्रतिशत बी 1 मिनट में। इंजेक्शन की मात्रा 2 μL थी। मास स्पेक्ट्रोमीटर एक ब्रूकर अमेज़ॅन एक्स इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) आयन ट्रैप (ब्रूकर डाल्टनिक्स, ब्रेमेन, जर्मनी) था। केशिका वोल्टेज -5.5 kV पर सेट किया गया था। मास स्पेक्ट्रा को 50-2000 थिन पॉजिटिव आयन मोड के बड़े पैमाने पर हासिल किया गया था।

सभी UPLC-MS विश्लेषण तीन प्रतियों में किए गए।

एनएमआर इंस्ट्रुमेंटेशन। सभी एनएमआर स्पेक्ट्रा एक एगिलेंट डीडी {0}} मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए, यूएसए) पर दर्ज किए गए थे, जो प्रोटॉन और कार्बन -13 नाभिक के लिए 500.05 और 125.74 मेगाहर्ट्ज पर काम कर रहे थे। क्रमशः, एक 5 मिमी अप्रत्यक्ष पहचान जांच का उपयोग करके एक ग्रेडिएंट कॉइल से लैस। 1D'H और 13C, 2Dhomonuclear1H TOCSY और ROESY, और हेटेरोन्यूक्लियर lH / 13C HSQC और HMBC प्रयोग शास्त्रीय पल्स अनुक्रमों का उपयोग करके किए गए थे और VNMRJ4.2 और MestReNova 14.2 दोनों का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। .1 (मेस्ट्रेलैब रिसर्च, स्पेन) सॉफ्टवेयर। DOSY माप पहले से वर्णित 38] के रूप में हासिल और संसाधित किए गए थे। डीजीसीएसटीईएसएल पल्स सीक्वेंस के अधिग्रहण पैरामीटर इस प्रकार थे: डिफ्यूजन डिले टाइम और ग्रेडिएंट पल्स चौड़ाई क्रमशः 50 एमएस और 2 एमएस पर सेट की गई थी, ग्रेडिएंट स्ट्रेंथ (जी) को 16 चरणों में 0.3 से बराबर जी 2 स्पेसिंग के साथ बढ़ाया गया था। 32जी · सेमी-I। चरण सुधार के बाद, VNMRJ4.2 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके चोटी की ऊंचाई माप से 2D DOSY स्पेक्ट्रा का निर्माण किया गया।

सभी स्पेक्ट्रा को विलायक एसीटोन-डीजी संकेतों ('2.05 पीपीएम पर एच अवशिष्ट संकेत और 29.92 पीपीएम पर 13 सी सिग्नल) के लिए संदर्भित किया गया था।

4। निष्कर्ष

तीन अलग-अलग ऑक्सीडोरेक्टेसेस (अंगूर से निकाले गए पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज, बोट्रीटिस सिनेरिया से लैकेस, और ट्रैमेट्स वर्सिकलर से लैकेस) की कार्रवाई (प्लस) -कैटेचिन की जांच की गई, और एलसी-यूवी-एमएस परिणामी प्रोफाइल बहुत समान थे, हालांकि कुछ मामूली अंतर इन एंजाइमों की प्रतिक्रियाशीलता में संभावित असमानताओं का सुझाव दिया।

छह कैटेचिन-लैकेस ऑक्सीकरण उत्पादों (ट्रैमेट्स वर्सिकलर से लैकेस का उपयोग करके) की संरचना विशिष्ट एनएमआर हस्ताक्षर (चार शुद्ध उत्पाद, यानी, एन 2, एन 3, एन 6, और एन 8, और एन 4 के मिश्रण के अनुरूप प्राप्त की गई थी) दो आइसोमर्स)। फेनोलिक ओएच संकेतों का पूरा श्रेय एक नमूना तैयार करने की प्रक्रिया के साथ कैडमियम नाइट्रेट को जोड़ने के लिए संभव था, जिसने ब्याज के कुछ यौगिकों के लिए कैटेचिन इकाइयों के बीच संबंधों के स्पष्ट आरोपण की अनुमति दी। यह प्रक्रिया प्राकृतिक उत्पादों से संश्लेषित या निकाले गए पॉलीफेनोल्स मिश्रण के एनएमआर विश्लेषण को बहुत सरल करेगी।

इस काम में प्राप्त मानकों का उपयोग भविष्य में अंगूर के पकने और शराब की उम्र बढ़ने के दौरान उनकी उपस्थिति और विकास की जांच के लिए ऑक्सीकरण मार्कर के रूप में किया जा सकता है। कैटेचिन के अलावा, फ्लेवोनोइड्स और गैर-फ्लेवोनोइड्स सहित अन्य पॉलीफेनोल यौगिकों का उपयोग अतिरिक्त नए मानकों को प्राप्त करने के लिए लैकेस के सब्सट्रेट के रूप में भी किया जा सकता है।

लघुरूप

एनएमआर: परमाणु चुंबकीय अनुनाद,

सीडी: कैडमियम,

TOCSY: कुल सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी,

ROESY: रोटेटिंग-फ्रेम न्यूक्लियर ओवरहॉसर इफेक्ट स्पेक्ट्रोस्कोपी,

HSQC: विषम परमाणु एकल-क्वांटम सहसंबंध प्रयोग,

HMBC: हेटेरोन्यूक्लियर मल्टी-बैंड कनेक्टिविटी,

DOSY: प्रसार ने स्पेक्ट्रोस्कोपी का आदेश दिया।

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