इनटेट इम्युनिटी रिस्पांस में दो सोरघम बाइकलर लाइन्स के बीच जीन एक्सप्रेशन में भिन्नता

अमूर्त:

माइक्रोब से जुड़े आणविक पैटर्न (MAMPs) ट्रिगर इम्युनिटी (MTI) माइक्रोबियल मान्यता के लिए पौधे की सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक प्रमुख घटक है। हालांकि, एमटीआई का हमारा अधिकांश वर्तमान ज्ञान मॉडल पौधों (अर्थात, अरबिडोप्सिस थालियाना) से आता है, जिसमें फसली पौधों का उपयोग करके तुलनात्मक रूप से कम काम किया जाता है। इस कार्य में, हमने MAMP-ट्रिगर ऑक्सीडेटिव बर्स्ट (ROS) और दो सोरघम बाइकलर जीनोटाइप, BTx623 और SC155-14E में ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया का अध्ययन किया। SC155-14E एक रेखा है जो उच्च एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध दिखाती है और रेखा BTx623 एन्थ्रेक्नोज के लिए अतिसंवेदनशील है। हमारे परिणामों ने दो पंक्तियों के बीच या तो फ्लैगेलिन (flg22) या चिटिन एलिसिटेशन के जवाब में जीन अभिव्यक्ति और ROS में स्पष्ट भिन्नता प्रकट की। जबकि प्रत्येक MAMP और प्रत्येक पंक्ति में ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया अद्वितीय थी, ओवरलैप की काफी डिग्री थी, और हम सोरघम MAMP ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया से जुड़े जीनों के एक मुख्य सेट को परिभाषित करने में सक्षम थे। GO टर्म और KEGG पाथवे संवर्धन विश्लेषण ने समान उपचार वाले BTx623 की तुलना में MAMP-उपचारित SC155-14E नमूनों में अधिक प्रतिरक्षा और रोगजनक प्रतिरोध-संबंधी DEG की खोज की। परिणाम रोग प्रतिरोध को बढ़ाने के प्रयासों सहित ज्वार में सहज प्रतिरक्षा मार्गों की जांच के लिए भविष्य के अध्ययन के लिए आधार रेखा प्रदान करते हैं।

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कीवर्ड:

सोरघम बाइकलर; आरओएस; सहज मुक्ति; एमएएमपी; आरएनए-seq; पित्रैक हाव भाव

1 परिचय

पौधे स्वाभाविक रूप से विभिन्न प्रकार के तनावों के संपर्क में आते हैं, जिनमें कई जीवाणु, कवक और वायरल रोगजनक [1] शामिल हैं। पौधे पूर्व-निर्मित संरचनाओं और रसायनों और प्रतिरक्षा प्रणाली के संक्रमण-प्रेरित प्रतिक्रियाओं का उपयोग करके रोगजनकों से खुद को बचाते हैं। संयंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली रिसेप्टर्स की दो परस्पर परतों के साथ दो-स्तरीय धारणा प्रणाली को नियोजित करती है।

पहला स्तर सतह-स्थानीयकृत पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (पीआरआर) द्वारा सक्रिय होता है, जो संरक्षित संरचनात्मक रूपांकनों, जिसे माइक्रोब-एसोसिएटेड आणविक पैटर्न (एमएएमपी) कहा जाता है, का पता लगाने के माध्यम से आक्रमणकारी रोगज़नक़ को पहचानकर कोशिका के बाहर अणुओं को महसूस करता है, जो एक मध्यम को ट्रिगर करता है। लेकिन व्यापक, रक्षा प्रतिक्रिया [2]। फ्लैगेलिन, चिटिन, लिपोपॉलीसेकेराइड्स, पेप्टिडोग्लाइकेन्स (PGNs), और बढ़ाव कारक Tu अच्छी तरह से अध्ययन किए गए MAMPs [3-5] के उदाहरण हैं। इस रक्षा प्रतिक्रिया को MAMPट्रिग्ड इम्युनिटी (MTI) [6] कहा जाता है। एफेक्टर-ट्रिगर इम्युनिटी (ईटीआई) के रूप में जाना जाने वाला रक्षा का दूसरा स्तर विशिष्ट रोगज़नक़-व्युत्पन्न प्रभावकारक प्रोटीन के जवाब में होता है, जिसे पौधे द्वारा प्रतिरोध प्रोटीन की क्रिया के माध्यम से पहचाना जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक मजबूत, लेकिन अत्यधिक विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया होती है। ETI को अक्सर स्थानीयकृत कोशिका मृत्यु के प्रेरण द्वारा पहचाना जा सकता है जिसे हाइपरसेंसिटिव रिस्पांस (HR) [7] कहा जाता है। एमटीआई और ईटीआई दोनों प्रणालियाँ रोगजनकों को समझती हैं और संक्रमित कोशिका और पड़ोसी कोशिकाओं [3,8] में रोगाणुरोधी सुरक्षा को सक्रिय करके प्रतिक्रिया करती हैं। पौधे प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स भी ले जाते हैं जो अत्यधिक परिवर्तनीय रोगजनक प्रभावकों को पहचानते हैं, इनमें प्रोटीन के एनबीएस-एलआरआर वर्ग [9] शामिल हैं।

इसके अलावा, प्रणालीगत अधिग्रहीत प्रतिरोध (SAR) एक "संपूर्ण-पौधा" प्रतिरोध प्रतिक्रिया है जो एक रोगज़नक़ के पहले स्थानीयकृत जोखिम के बाद होती है। SAR जीनों की एक विस्तृत श्रृंखला (रोगजनन-संबंधित जीन) को शामिल करने के साथ जुड़ा हुआ है, और SAR की सक्रियता के लिए अंतर्जात सैलिसिलिक एसिड (SA) [10] के संचय की आवश्यकता होती है।

मुख्य रूप से अरबिडोप्सिस का उपयोग करके किए गए अध्ययनों से पता चला है कि एमटीआई प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन (आरओएस), प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों के उत्पादन जैसे नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ), कॉलोज जमाव, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम स्तर, प्लाज्मा में आयन प्रवाह सहित विभिन्न प्रकार की प्रतिक्रियाएं पैदा कर सकता है। झिल्ली, प्रेरण या कई पौधों की रक्षा से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति का दमन, पौधे की कोशिका की दीवार में परिवर्तन, रोगाणुरोधी यौगिकों का समावेश और रोगजनन से संबंधित (पीआर) प्रोटीन का संश्लेषण [3,11]।

हालांकि इन एमटीआई प्रतिक्रियाओं में से कई को सामान्य पौधों की प्रतिक्रियाएं माना जा सकता है, लेकिन उनका परिमाण पौधे-प्रजाति विशिष्ट और यहां तक ​​कि खेती विशिष्ट [12-17] हो सकता है। संयंत्र एमटीआई प्रतिक्रिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए तरीके विकसित किए गए हैं। इन विधियों में आरओएस या एनओ उत्पादन, माइटोजेन-एक्टिवेटेड प्रोटीन किनेज फॉस्फोराइलेशन, विशिष्ट एमएएमपी प्रेरित जीन एक्सप्रेशन, सीडलिंग ग्रोथ इनहिबिशन, लिग्निन और सेल वॉल-बाउंड फिनोल, और बैक्टीरियल और फंगल रोगजनकों [18-20] के लिए एमएएमपी-प्रेरित प्रतिरोध को मापना शामिल है।

सोरघम बाइकलर (एल.) मोएंच एक प्रमुख, वैश्विक अनाज की फसल है जिसे विभिन्न प्रकार के आवासों के लिए अनुकूलित किया गया है और विविध उद्देश्यों के लिए पैदा किया गया है [21]। खाद्य और बायोमास उत्पादन [22] के लिए प्रमुख फसलों में से एक के रूप में दुनिया भर में ज्वार की खेती में काफी वृद्धि होने की उम्मीद है।

जैसे-जैसे ज्वार की खेती के तहत प्रथाओं और भौगोलिक क्षेत्रों में वृद्धि होगी, यह अपरिहार्य है कि रोग का दबाव बढ़ेगा। ज्वार को अन्य अनाजों के बीच रोगों की असामान्य रूप से व्यापक श्रेणी के कारण पहचाना जाता है, जो इसके उत्पादन के लिए सबसे महत्वपूर्ण बाधाओं में से एक है। विश्व स्तर पर, व्यापक रूप से फैले कवक रोग सबसे विनाशकारी ज्वार रोग हैं, जिसके परिणामस्वरूप अनाज की मात्रा और गुणवत्ता दोनों के मामले में उपज में भारी नुकसान होता है [23]। एन्थ्रेक्नोज सबसे गंभीर कवक रोगों में से एक है जो ज्वार की उपज और बायोमास उत्पादन को प्रभावित करता है। अतिसंवेदनशील किस्मों [24,25] में इस रोगजनक के कारण उपज हानि 50 से 70 प्रतिशत तक हो सकती है। रोगजनक आक्रमण से लड़ने के लिए पौधों ने विभिन्न रक्षा रणनीतियों का विकास किया है। ज्वार में, इन रणनीतियों में पीआर प्रोटीन की सक्रियता [26], हाइड्रोजन पेरोक्साइड का संचय [27], और फ्लेवोनोइड फाइटोएलेक्सिन [28] का जैवसंश्लेषण शामिल है। ज्वार के प्रतिरोध प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने, रक्षा यौगिकों की पहचान करने और एन्थ्रेक्नोज के खिलाफ भौतिक बाधाओं की पहचान करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है (समीक्षा के लिए संदर्भ [29,30] देखें)। जीन अभिव्यक्ति अध्ययनों का व्यापक रूप से प्रतिरोधी और अतिसंवेदनशील किस्मों या गैर-इनोक्युलेटेड और रोगज़नक़-इनोक्युलेटेड पौधों (जैसे, संदर्भ [31-37]) के बीच अंतर अभिव्यक्ति के आधार पर पौधों में उम्मीदवार प्रतिरोध जीन की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया था। वांग एट अल।, [37] ने सी. सबलाइन-ओला के लिए सोरघम कल्टीवर बीटीएक्स623 की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए ट्रांसक्रिपटोमिक विश्लेषण किया। उन्होंने बताया कि फेनिलप्रोपेनाइड चयापचय में शामिल जीन, और माध्यमिक चयापचयों के जैवसंश्लेषण की पहचान गैर-इनोक्युलेटेड नियंत्रण संयंत्रों के सापेक्ष रोगज़नक़ के साथ संक्रमण के जवाब में अलग-अलग व्यक्त की गई थी।

हालाँकि, ये प्रयोग अतिसंवेदनशील कल्टीवेटर BTx623 के अंकुरों के साथ किए गए थे। अतिसंवेदनशील और प्रतिरोधी ज्वार की खेती में एक रोगज़नक़ के लिए जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया की तुलना करने के लिए अतिरिक्त ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन मूल्य का होगा। इसलिए, ज्वार बेसल रोग प्रतिरोध को नियंत्रित करने वाली आनुवंशिक संरचना और मात्रात्मक रोग प्रतिरोध के साथ इसके संबंध को समझना महत्वपूर्ण है।

इस दिशा में एक प्रारंभिक कदम के रूप में, हमने हाल ही में flg22 और चिटिन उन्मूलन के साथ-साथ कवक रोग प्रतिरोध [38] के प्रति उनकी प्रतिक्रिया में भिन्नता के लिए विविध ज्वार जर्मप्लाज्म के एक सेट की जांच की। इस मामले में, एमटीआई को एमएएमपी इलीटेशन पर आरओएस उत्पादन को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था। इस पहले के अध्ययन के परिणामों में, सोरघम जीनोटाइप की पहचान थी जो एमएएमपी इलीशन के लिए या तो एक मजबूत या कमजोर प्रतिक्रिया दिखाती थी।

अगली पीढ़ी के उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण और ट्रांसक्रिप्टोम के अध्ययन से पौधों में फंगल संक्रमण प्रतिक्रियाओं को स्पष्ट करने और मेजबान प्रतिक्रियाओं के बारे में समझ बढ़ाने में मदद मिल सकती है। अनाज की फसलों सहित कई पौधों की प्रजातियों में फंगल संक्रमण के लिए पौधों की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण का व्यापक रूप से उपयोग किया गया था (उदाहरण के लिए, संदर्भ [31-37])।

हालांकि, अनाज फसलों के तुलनात्मक प्रतिलेख विश्लेषण पर प्रकाशित डेटा ने मुख्य रूप से विभिन्न रोगजनकों की प्रतिक्रिया पर ध्यान केंद्रित किया है। ज्वार में, कई प्रकाशन एन्थ्रेक्नोज [35,37] सहित विभिन्न रोगजनकों के साथ इलाज किए गए पौधों की प्रतिलेख तुलना पर केंद्रित हैं। कुछ पिछले प्रकाशनों ने सुझाव दिया कि MAMPs और कवक रोग की प्रतिक्रिया के बीच कोई महत्वपूर्ण संबंध नहीं है। उदाहरण के लिए, झांग एट अल। [17] मक्का मैपिंग आबादी में दो एमएएमपी flg22 और चिटिन की प्रतिक्रिया के बीच एक मजबूत सहसंबंध की सूचना दी लेकिन कवक रोग की प्रतिक्रिया के लिए कोई पत्राचार नहीं किया। किमबॉल एट अल। [38] ने एक BTx623/SC155-14E आबादी सहित दो सोरघम RIL आबादी में flg 22-प्रेरित ROS प्रतिक्रिया स्कोर और लक्ष्य पत्ती स्थान-प्रतिरोधी स्कोर के बीच कम सहसंबंध की सूचना दी। इसलिए, डेटा की कमी को देखते हुए, हमने MAMP उपचारों के लिए ज्वार की प्रतिक्रिया को ट्रांसक्रिप्शनल रूप से प्रोफ़ाइल करना महत्वपूर्ण समझा।

इस वर्तमान रिपोर्ट में, हम MAMP एलिसिटेशन के लिए वैश्विक ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया को मापकर अपने पहले के विश्लेषण का विस्तार करते हैं। हमने सोरघम जीनोटाइप्स BTx623 और SC 155-14E में flg22 या चिटिन उपचार के जवाब में ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का सर्वेक्षण करने के लिए इल्लुमिना-आधारित RNA अनुक्रमण विश्लेषण का उपयोग किया, जिसे हमने क्रमशः क्रमशः कमजोर और मजबूत MTI उत्तरदाताओं के रूप में चित्रित किया। BTx623 सोरघम बाइकलर जीनोम रेफरेंस लाइन [22] है और SC155-14E उन्नत एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध [39] दिखाने वाली लाइन है। पाटिल एट अल। [39] ने बताया कि एससी 155-14 ई ने परीक्षण किए गए सभी वातावरणों में एन्थ्रेक्नोज रोग के लिए उच्च स्तर की स्थिर प्रतिरोध (लगभग रोग मुक्त) प्रदर्शित किया, जबकि बीटीएक्स 623 इस कवक रोग के लिए अतिसंवेदनशील है। हमारे RNA-seq विश्लेषण ने BTx623 में 5252 और 8085 विभेदित रूप से व्यक्त जीन (DEGs) की पहचान की, जो क्रमशः flg22 और चिटिन के साथ इलाज किया गया था, और अनुपचारित नकली नियंत्रणों की तुलना में flg22 और चिटिन उपचारित SC 155-14 E में क्रमशः 3849 और 5786 DEG थे। इन दो जीनोटाइप के।

इसके अलावा, दो अलग-अलग जैव सूचनात्मक पाइपलाइनों का उपयोग करके चयनित डीईजी की तुलना ने बहुत समान परिणाम दिखाए। विभेदित रूप से व्यक्त जीन, जीन ऑन्कोलॉजी (जीओ) संवर्धन विश्लेषण और केईजीजी मार्ग संवर्धन विश्लेषण के अभिव्यक्ति प्रोफाइल ने एमटीआई-संबंधित जीन अभिव्यक्ति में स्पष्ट जीनोटाइप-आधारित भिन्नता दिखाई। GO टर्म और KEGG पाथवे संवर्धन परिणामों ने MAMP- उपचारित SC {{4} में प्रस्तुत अधिक प्रतिरक्षा और रोगज़नक़ प्रतिरोध-संबंधी DEG (PR जीन, चिटिन के लिए जीन की प्रतिक्रिया, सैलिसिलिक एसिड के लिए जीन की प्रतिक्रिया, तनाव के लिए जीन की प्रतिक्रिया, आदि) का खुलासा किया। एमएएमपी-उपचारित बीटीएक्स 623 के सापेक्ष ई नमूने। परिणाम ज्वार एमटीआई प्रतिक्रिया के विभिन्न घटकों की पहचान के लिए एक आधार रेखा प्रदान करते हैं।

2. परिणाम और चर्चा

2.1। विभिन्न ज्वार की पत्तियों में ऑक्सीडेटिव फटने का परिवर्तन

विविध सोरघम जीनोटाइप्स की MTI प्रतिक्रिया के हमारे पिछले विश्लेषण ने जीनोटाइप्स BTx623 और SC155-14E [38] के बीच MAMP-ट्रिगर ऑक्सीडेटिव बर्स्ट में महत्वपूर्ण भिन्नता प्रकट की। इसके अलावा, SC155-14E उच्च एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध दिखाने वाली रेखा है, जबकि रेखा BTx623 एन्थ्रेक्नोज [39] के लिए अतिसंवेदनशील है। इन्हीं कारणों से, इन दो जीनोटाइप्स को RNA-seq का उपयोग करके तुलना के लिए चुना गया था।

पहले के आरओएस मापों का संचालन करते समय, हमने एक ही पौधे के भीतर भी महत्वपूर्ण भिन्नता पाई, जिसके कारण हमें इस भिन्नता के स्रोत की अधिक सावधानी से जांच करनी पड़ी। विशेष रूप से, हमने पन्द्रह दिन पुराने BTx623 और SC155-14E पौधों के नीचे से ऊपर तक पत्तियों के तीन सेटों का उपयोग करके ROS उत्पादन का परीक्षण किया। पत्तियों को #1, #2 और #3 के रूप में चिह्नित किया गया था, जैसा कि चित्र 1ए में दिखाया गया है। ROS परख के परिणाम (चित्र 1B) से पता चला है कि: (1) पुरानी पत्तियों (पत्ती #1) में ROS उत्पादन स्तर कम था, जबकि flg22 या चिटिन के जवाब में ROS उत्पादन का उच्चतम स्तर सबसे कम उम्र की पत्तियों से था ( पत्ता #3). (2) एमएएमपी-उपचारित और अनुपचारित दोनों बीटीएक्स 623 2 और सबसे नई पत्तियां (पत्ती #2) आरओएस उत्पादन के तुलनात्मक रूप से निम्न स्तर का उत्पादन करती हैं।

इसके विपरीत, SC155-14E की MAMP-उपचारित दूसरी सबसे छोटी पत्तियों ने अनुपचारित मॉक की तुलना में महत्वपूर्ण रूप से (0.01 स्तर पर) ROS उत्पादन के उच्च स्तर का उत्पादन किया, साथ ही BTx के उपचारित या मॉक{ {5}}दूसरी सबसे छोटी पत्तियाँ। (3) flg22, या काइटिन के अनुप्रयोगों से ट्रिगर होने वाला ऑक्सीडेटिव फट दोनों जीनोटाइप के सबसे कम उम्र के पत्तों (पत्ती #3) से लीफ डिस्क में पाया गया था, हालांकि, जैसा कि पहले देखा गया था, MAMP-उपचारित SC में ROS उत्पादन का स्तर अधिक था। 155-14ई BTx623 के सापेक्ष। SC155-14E दूसरी सबसे छोटी पत्ती में flg 22-ट्रिगर और काइटिन-ट्रिगर ROS उत्पादन के समय पाठ्यक्रम से पता चला कि चिटिन-ट्रिगर ROS उत्पादन flg22- ट्रिगर ROS उत्पादन से पहले हुआ था (चित्र 1C ). झांग एट अल द्वारा इसी तरह के परिणाम की सूचना दी गई थी। [17] जहां चिटिन-ट्रिगर ROS उत्पादन flg22-से पहले दिखाई दिया, वहीं flg22 और चिटिन-उपचारित मक्का रोपण में ROS उत्पादन ट्रिगर हुआ। यह बताया गया [40] कि flg22 के जवाब में ROS उत्पादन ने लगभग 12 मिनट में ROS का उच्चतम उत्पादन दिखाया, और Arabidopsis में 30 मिनट पर सबसे कम था। ज्वार में हमारे आरओएस परख के परिणाम ने 13 मिनट के आसपास उच्चतम आरओएस उत्पादन दिखाया, और flg22 उपचार के बाद 30 मिनट में सबसे कम, जो अरबिडोप्सिस के परिणामों के समान है। चूंकि हमारा लक्ष्य दो जीनोटाइप की एमटीआई प्रतिक्रिया की तुलना के लिए इष्टतम स्थितियों का पता लगाना था, इसलिए हमने आरएनए निष्कर्षण और बाद में ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए 15-दिन पुराने पौधों की दूसरी सबसे छोटी पत्तियों को चुना। एकल ज्वार के पौधों की पत्तियों के बीच भिन्नता एक अनुस्मारक है कि परिणाम किसी दिए गए प्रयोग के स्रोत, समय और अन्य विशेषताओं के आधार पर प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकते हैं और इसलिए, प्रायोगिक मापदंडों को सावधानीपूर्वक नियंत्रित करने की आवश्यकता है।

ऑक्सीडेटिव फट, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का एक तीव्र, क्षणिक, उत्पादन, पौधे की रक्षा प्रतिक्रिया [41] के शुरुआती अवलोकनीय पहलुओं में से एक है। यह देखते हुए कि आरओएस फट एक तत्काल प्रतिक्रिया है, एमटीआई से संबंधित जीनों की थोड़ी देर बाद ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया अपेक्षित है। हमने RNA-Seq विश्लेषण के लिए MAMPs उपचार के बाद 60 मिनट के नमूनों की कटाई की।

2.2। MAMP उपचारों के जवाब में BTx623 और SC155-14E के विभेदक रूप से व्यक्त जीन (DEG)

प्रत्येक नमूने के लिए एनोटेट सोरघम बाइकलर प्रोटीन-कोडिंग जीन के अभिव्यक्ति स्तर का मूल्यांकन करने के लिए, प्रत्येक जीन के लिए मैप किए गए RNA-seq के स्वच्छ रीड्स की संख्या की गणना की गई और फिर FPKM (प्रति मिलियन मैप किए गए टुकड़े प्रति kb एक्सॉन मॉडल के टुकड़े) में सामान्यीकृत किया गया। मॉक (पानी) उपचारों की तुलना में BTx623 और SC155-14E के MAMP-उपचारित पत्ती डिस्क में प्रत्येक जीन के अभिव्यक्ति परिवर्तन की जांच की गई। कुल अभिव्यक्त जीन दोनों जीनोटाइप के सभी उपचारों में समान थे: 27,171, 27,283, 27,161, 27,182, 27,512, और 27,175 जीन BTx623, flg22-उपचारित BTx623, चिटिन-उपचारित BTx623, नकली SC{ {22}}E, flg22- ने SC155-14E का इलाज किया, और चिटिन से इलाज किया SC155-14E, क्रमशः। हमने दोनों पंक्तियों में रीड मैपिंग के लिए BTx623 संदर्भ जीनोम का उपयोग किया क्योंकि SC155-14E के लिए विशिष्ट संदर्भ उपलब्ध नहीं है। उपरोक्त सभी शर्तों के साथ BTx623 और SC {{3 0}}} E से प्राप्त अभिव्यक्त जीन संख्या से पता चला है कि दोनों पंक्तियों ने व्यक्त जीनों की समान संख्या साझा की है। SC155- 14E मॉक (3 प्रतिकृति), SC155-14E के नमूनों की समग्र रीड मैपिंग दर flg22 (3 प्रतिकृति), SC155-14E के साथ काइटिन के साथ उपचारित (3 प्रतिकृति) , BTx623 नकली (3 प्रतिकृति), BTx623 flg22 (3 प्रतिकृति), BTx623 चिटिन (3 प्रतिकृति) के साथ इलाज किया गया: 93.6 प्रतिशत, 93.9 प्रतिशत, 93.9 प्रतिशत, 93.8 प्रतिशत, 93.9 प्रतिशत, 93.6 प्रतिशत, 93.5 प्रतिशत, 93.5 प्रतिशत , 93.1 प्रतिशत, 96.9 प्रतिशत, 97.0 प्रतिशत, 97.0 प्रतिशत, 97.2 प्रतिशत, 96.8 प्रतिशत, 97.0 प्रतिशत, 96.9 प्रतिशत, 97.0 प्रतिशत, 97.0 प्रतिशत, क्रमशः। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि BTx623 और SC 155-14 E के ट्रांसक्रिप्टोम पर MAMPs उपचार के विभिन्न प्रभाव दो जीनोटाइप के बीच जीनोमिक अनुक्रम अंतर के कारण नहीं थे।

जीन एक्सप्रेशन पीसीए प्लॉट नमूनों के बीच सहयोग में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। अपने नमूनों की समानता का पता लगाने के लिए, हमने पीसीए विश्लेषण किया। PC1 और PC2 पर नमूना प्लॉटिंग (चित्र 2) ने दिखाया कि चार प्रायोगिक स्थितियां (BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_चिटिन और SC{ {10}}ई_चिटिन) व्यापक रूप से अलग थे। इसके विपरीत, प्रत्येक ज्वार रेखा और प्रत्येक एमएएमपी उपचार के साथ-साथ नकली उपचार के तीन जैविक प्रतिकृति क्रमशः एक साथ क्लस्टर किए गए थे, जो जैविक प्रतिकृति (चित्रा 2) के बीच एक अच्छी प्रजनन क्षमता का संकेत देते हैं।

चित्रा 3 में ज्वालामुखी भूखंड flg22 या चिटिन के साथ इलाज की गई दो सोरघम लाइनों में जीन अभिव्यक्ति दिखाते हैं। एक ज्वालामुखी प्लॉट एक प्रकार का स्कैटरप्लॉट है जो सांख्यिकीय महत्व (पी-वैल्यू) बनाम परिवर्तन के परिमाण (गुना परिवर्तन) को दर्शाता है। यह बड़े पैमाने पर परिवर्तन वाले जीन की त्वरित दृश्य पहचान को सक्षम बनाता है जो सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण भी हैं। ये सबसे जैविक रूप से महत्वपूर्ण जीन हो सकते हैं। चित्र 3 में, −log10 (p-मान) के बराबर या 3 से अधिक वाले जीन को DEG माना जाता है। लाल रंग के बिंदु डीईजी का प्रतिनिधित्व करते हैं और काले रंग के बिंदु गैर-डीईजी का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रत्येक भूखंड में, 0 से अधिक लॉग2 (गुना _ परिवर्तन) वाले जीन अप-विनियमित जीन होते हैं, अन्यथा, डाउन-विनियमित जीन। सबसे ऊपर-विनियमित जीन दाईं ओर हैं, सबसे नीचे-विनियमित जीन बाईं ओर हैं, और सबसे सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण जीन शीर्ष की ओर हैं।

विभेदित रूप से अभिव्यक्त जीन (डीईजी) प्रत्येक उपचार से अभिव्यक्ति के महत्व के अनुसार चुने गए थे (पी-वैल्यू 0। 0 0 1)। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमने इस रिपोर्ट में डीईजी का चयन करने के लिए अपनी सीमा के रूप में 0.001 के पी-मूल्य का उपयोग किया, लेकिन एफडीआर (क्यू-मान) का नहीं। इस स्तर पर FDR (q-मान) भी महत्वपूर्ण थे (टेबल्स S2-S5)। 0.001 के पी-वैल्यू पर, FDRs 0.0039, 0.0051, 0.0025, और 0.0035 थे BTx623 के लिए flg22 उपचार के साथ, SC155-14E flg22 उपचार के साथ, BTx623 चिटिन उपचार के साथ और SC{{ 26}}चिटिन उपचार के साथ ई, क्रमशः। BTx623 और SC155-14E के जीनों के p-मान और q-मान सभी स्थितियों में तालिका S2-S5 में सूचीबद्ध हैं। BTx623 और SC155-14E के MAMP- उपचारित पत्तियों में इन जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करके, हमने बड़ी संख्या में जीनों (कुल व्यक्त जीनों का 14-30 प्रतिशत) का अवलोकन किया, जिन्होंने flg22 या चिटिन के बाद बड़े अंतर प्रदर्शित किए दोनों ज्वार लाइनों में इलाज. चिटिन-उपचारित BTx623 (8085) के कुल DEG की संख्या BTx623 में एन्थ्रेक्नोज रोगज़नक़ C. सबलाइन-ओला (8078) [37] द्वारा संक्रमित पिछले ट्रांसक्रिप्टोम अध्ययन में रिपोर्ट किए गए के बहुत करीब थी। डीईजी की संख्या flg22 (19 प्रतिशत) या चिटिन (30 प्रतिशत) उपचारित BTx623 पत्तियों में SC155-14E (क्रमशः 14 प्रतिशत और 21 प्रतिशत) की तुलना में अधिक थी।

हालांकि एससी 155-14 ई के सापेक्ष एमएएमपी-उपचारित बीटीएक्स 623 में डीईजी की उच्च संख्या इन दो जीनोटाइप्स की आरओएस प्रतिक्रिया के विपरीत थी, यह शायद आश्चर्य की बात नहीं है क्योंकि एमएएमपी उपचार के लिए आरओएस प्रतिक्रिया और जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया होती है। अलग-अलग समय, काफी हद तक स्वतंत्र हैं, और विभिन्न तंत्रों [42,43] द्वारा मध्यस्थता की जाती है। GO टर्म और KEGG पाथवे संवर्धन ने MAMP-उपचारित SC155-14E नमूनों में प्रस्तुत अधिक प्रतिरक्षा और रोगज़नक़ प्रतिरोध-संबंधी DEGs का खुलासा किया। इसके अलावा, तथ्य यह है कि डीईजी की संख्या एफएलजी22 के साथ इलाज किए गए लोगों के सापेक्ष चिटिन-उपचारित नमूनों में अधिक थी, आरओएस प्रतिक्रिया परख (चित्रा 1बी) के साथ अच्छी तरह से मेल खाती है जहां हमने चिटिन उपचार पर एक मजबूत आरओएस प्रतिक्रिया देखी।

BTx623 और SC155-14E में flg22 और चिटिन उपचारों के बीच जीन और जैविक प्रक्रियाओं को किस हद तक साझा किया जाता है, इसकी जांच करने के लिए, हमने उनके DEG की अधिक विस्तार से तुलना की। चित्र 4ए में वेन आरेख कुल डीईजी में ओवरलैप दिखाते हैं, 0.001 के पी-मान पर ऊपर और नीचे विनियमित जीन सेट। कुल 10,535 डीईजी में से, 2272 जीनों के एक कोर सेट ने दोनों सोरघम लाइनों में flg22 और चिटिन उपचार दोनों का जवाब दिया। इसी तरह, कुल 5410 अप-विनियमित जीनों में से, 1778 जीनों के एक कोर सेट को दोनों जीनोटाइप्स में अप-विनियमित किया गया था, जबकि कुल 5125 डाउन-रेगुलेटेड जीनों में से, 474 के एक कोर सेट को दोनों जीनोटाइप्स में डाउन-रेगुलेट किया गया था। जीनोटाइप।

यहां प्रस्तुत RNA seq डेटा का विश्लेषण बॉवी2 2.3.4.3, टॉपहैट 2.1.1, और कफ़लिंक 2.2.1 (कफ़मर्ज, कफ़डिफ़) के साथ डिफ़ॉल्ट पैरामीटर (पाइपलाइन #1) के साथ जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन का उपयोग करके किया गया। परख परिणामों की और पुष्टि करने के लिए, हमने विश्लेषण करने के लिए HiSat2, HTSeq और edgeR के साथ एक और पाइपलाइन (पाइपलाइन #2) का उपयोग किया। HiSat2, TopHat2 का अगला विकास है। हमने दोनों पाइपलाइनों का उपयोग करके चयनित प्रत्येक स्थिति के डीईजी (यानी, flg22 या चिटिन, सभी, ऊपर या नीचे-विनियमित डीईजी के साथ इलाज किए गए दो जीनोटाइप) की तुलना की। परिणाम (चित्र 5) ने दिखाया कि दोनों पाइपलाइनों का उपयोग करके चयनित डीईजी नंबर बहुत करीब थे।

पाइपलाइन #1 बनाम पाइपलाइन #2 के साथ चुने गए कुल डीईजी BTx623_flg22: 5241 बनाम 5413 थे; SC155-14E_flg22: 3849 बनाम 3476; BTx623_चिटिन: 8085 बनाम 8320; SC155-14E_चिटिन: 5786 बनाम 5383। पाइपलाइन #1 बनाम पाइपलाइन #2 के साथ चयनित अप-विनियमित DEGs BTx623_flg22: 3074 बनाम 3076 थे; SC155-14E_flg22: 2591 बनाम 2483; BTx623_चिटिन: 4156 बनाम 4583; SC155-14E_चिटिन: 3486 बनाम 3346। पाइपलाइन #1 बनाम पाइपलाइन #2 के साथ चुने गए डाउन-रेगुलेटेड DEGs BTx623_flg22: 2152 बनाम 2237 थे; SC155-14E_flg22: 1257 बनाम 993; BTx623_चिटिन: 3919 बनाम 3757; SC155-14E_चिटिन: 2296 बनाम 2037। इसके अलावा, चित्र 5 के परिणामों से यह भी पता चला कि दो पाइपलाइनों का उपयोग करके चयनित DEG का उच्च प्रतिशत सभी स्थितियों में ओवरलैप किया गया। पाइपलाइन#1 का उपयोग करके चयनित अतिव्यापी डीईजी संख्या/डीईजी संख्या का प्रतिशत 79.6 प्रतिशत और 73.7 प्रतिशत था। BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_चिटिन और SC155-14E{{73} के कुल DEG का 80.8 प्रतिशत और 74.4 प्रतिशत }चिटिन, क्रमशः; 83 प्रतिशत , 80.6 प्रतिशत , 85.3 प्रतिशत और 81.1 प्रतिशत BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_चिटिन और SC{{ 88}}ई_चिटिन, क्रमशः; BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_चिटिन और SC{{ 105}}ई_काइटिन, क्रमशः। इस प्रकार, इन तुलनात्मक परिणामों ने साबित कर दिया कि प्रस्तुत आरएनए seq डेटा विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली दो विधियों में से किसी की परवाह किए बिना सही है।

तीन जैविक प्रतिकृतियों के लिए flg22 या चिटिन के साथ उपचारित BTx623 और SC155-14E के डीईजी के संकुल अभिव्यक्ति प्रोफाइल का हीटमैप चित्र 6 में दिखाया गया है। जीन अभिव्यक्ति मूल्यों को z-स्कोर के रूप में सामान्यीकृत किया गया था। मूल्य बढ़ने पर रंग बैंगनी से लाल हो जाता है, जो जीन की अभिव्यक्ति को निम्न से उच्च तक दर्शाता है। यह हीटमैप flg22 या चिटिन उपचार के जवाब में BTx623 और SC155-14E में जीनों के अंतर विनियमन को स्पष्ट रूप से दिखाता है। इसके अलावा, परिणाम यह भी दिखाते हैं कि प्रत्येक स्थिति में तीन जैविक प्रतिकृति के हीटमैप बहुत करीब थे, जो जैविक प्रतिकृति के बीच अच्छी प्रजनन क्षमता का संकेत देते हैं।

इसके अलावा, flg22 और चिटिन उपचारों से ऊपर और नीचे-विनियमित डीईजी के बीच जोड़ी-वार तुलना (चित्र 7ए) से पता चला है कि BTx623 और SC155-14E के बीच एक बड़ा ओवरलैप था। BTx623 में 3074 flg 22- प्रेरित जीनों में, 83.8 प्रतिशत भी चिटिन उपचार के जवाब में BTx623 में प्रेरित थे, जबकि 2591 flg 22- प्रेरित जीनों में SC 155-14 E, {{ 16}}.6 प्रतिशत ने चिटिन-उपचारित SC155-14E पर भी प्रतिक्रिया दी। यह शायद आश्चर्य की बात नहीं है क्योंकि अरबिडोप्सिस थालियाना में पिछले कार्यों ने विभिन्न प्रकार के विभिन्न एमएएमपी का जवाब देने वाले जीनों में महत्वपूर्ण ओवरलैप दिखाया, जो सामान्य एमटीआई मार्गों [44-46] को परिभाषित करता है।

इसके अलावा, झांग एट अल। [17] ने मक्का में flg22 और चिटिन प्रतिक्रिया के बीच एक महत्वपूर्ण सहसंबंध की सूचना दी। BTx623 और SC155-14E लीफ डिस्क के बीच एक ही MAMP के साथ उपचारित (चित्र 7A) के बीच कम ओवरलैप देखा गया था। BTx623 में 64.3 प्रतिशत flg 22- प्रेरित जीन flg 22- उपचारित SC 155-14 E में प्रेरित थे और BTx623 में 68.3 प्रतिशत चिटिन-प्रेरित जीन चिटिन उपचारित SC 155-14 में प्रेरित थे। इ। इसी तरह, BTx623 के flg22 उपचार पर डाउन-रेगुलेटेड 2152 जीनों में से, उच्च प्रतिशत (75.9 प्रतिशत) को भी BTx623 में चिटिन द्वारा डाउन-रेगुलेट किया गया था। SC155-14E में flg22 द्वारा डाउनरेगुलेट किए गए 1257 जीनों में से, SC155-14E में चिटिन द्वारा 70.8 प्रतिशत को भी डाउन-रेगुलेट किया गया था। हालाँकि, BTx623 में केवल 29 प्रतिशत flg22 डाउन-रेगुलेटेड जीन भी flg 22- उपचारित SC 155-14 E में डाउन-रेगुलेटेड थे और BTx623 में चिटिन-डाउन-रेगुलेटेड जीन के 45 प्रतिशत डाउन-रेगुलेटेड थे। चिटिन-उपचारित SC 155-14E (चित्र 7A) में। इसलिए, जबकि दो जीनोटाइप्स में flg22 और चिटिन की तुलना में MTI पाथवे में महत्वपूर्ण अभिसरण था, डेटा भी दिलचस्प जटिलता की ओर इशारा करता है कि ये दो जीनोटाइप अलग-अलग MAMPs पर कैसे प्रतिक्रिया करते हैं।

2.3। जीन कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण BTx623 और SC155-14E के MTI प्रतिक्रिया की तुलना

या तो flg22 या चिटिन के जवाब में विनियमित जीन की कार्यात्मक श्रेणियों का निर्धारण करने के लिए और परीक्षण किए गए दो सोरघम लाइनों के अंतर की प्रतिक्रिया के लिए, हमने प्लांटरेगमैप [47,48] प्लेटफॉर्म का उपयोग जैविक में पता लगाए गए डीईजी के आधार पर जीन सेट संवर्धन विश्लेषण करने के लिए किया। प्रक्रिया श्रेणी। चित्र 8ए, और बी बीटीx623 और एससी 155-14 ई दोनों से अप-विनियमित डीईजी और डाउन-विनियमित डीईजी के साथ जैविक प्रक्रिया-समृद्ध जीन की शीर्ष गो शर्तों को दर्शाता है। DEG की पूरी सूची तालिका S6-S13 में प्रदान की गई है। इनमें से कई जीन तनाव प्रतिक्रिया, पौधे की रक्षा प्रतिक्रिया, उत्तेजना की प्रतिक्रिया, जैविक उत्तेजना की प्रतिक्रिया, जीवाणु की प्रतिक्रिया, दूसरे जीव की प्रतिक्रिया, कोशिका संचार, फास्फोरस चयापचय प्रक्रिया और प्रोटीन फास्फारिलीकरण सहित प्रक्रियाओं से जुड़े हैं।

चित्रा 8ए और बी में परिणाम सामान्य रूप से दो सोरघम जीनोटाइप के बीच सहज प्रतिरक्षा से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति में स्पष्ट अंतर दिखाते हैं। उन समृद्ध GO शर्तों में, ओवरलैप के साथ प्रत्येक स्थिति में कुछ अद्वितीय DEG पाए गए। उदाहरण के लिए, GO टर्म डिफेंस रिस्पांस (GO 0006952): 91 और 84 अप-रेगुलेटेड DEGs को क्रमशः BTx623 या SC155-14E में flg22 के साथ ट्रीट करके समृद्ध किया गया था। उन डीईजी के भीतर, बीटीएक्स 623 में 24 डीईजी अद्वितीय थे और 15 डीईजी केवल एससी 155-14 ई में पाए गए थे, और अन्य दोनों सोरघम जीनोटाइप में प्रस्तुत किए गए थे। इसी तरह, 102 और 93 अप-रेगुलेटेड डीईजी को क्रमशः चिटिन से उपचारित BTx623 या SC155-14E में समृद्ध किया गया। उन DEG के भीतर, BTx623 में 20 DEG अद्वितीय थे और SC 155-14E में 14 DEG अद्वितीय थे, और अन्य दोनों सोरघम जीनोटाइप में प्रस्तुत किए गए थे।

"चिटिन की प्रतिक्रिया (जीओ: 0010200)" के जीओ शब्द में, हमने इस श्रेणी में कुल 779 जीनों में से 18 अप-विनियमित डीईजी का अवलोकन किया, जो कि चिटिन-उपचारित एससी 155-14 ई नमूनों में समृद्ध है (चित्र 8) ), जबकि चिटिन-उपचारित BTx623 नमूनों में कोई जीन समृद्ध नहीं था। इसके अलावा, 16 अप-विनियमित डीईजी को flg22-उपचारित SC155-14E नमूनों में समृद्ध किया गया था, और 12 अप-विनियमित DEG को flg22-उपचारित BTx623 नमूनों में समृद्ध किया गया था (चित्र 8)। flg22 और चिटिन-उपचारित BTX623 और SC 155-14 E (टेबल S9) में GO शब्द "चिटिन की प्रतिक्रिया" की DEG सूचियों की तुलना से पता चला है कि DEGs flg22, या चिटिन-उपचारित SC 155- 14 में समृद्ध हैं। E समान थे, जबकि चिटिन ने flg22 की तुलना में दो और DEG प्रेरित किए। इसके विपरीत, flg 22- उपचारित BTX623 में समृद्ध सभी 12 DEG SC 155-14E में MAMPs द्वारा प्रेरित DEG से भिन्न थे। वे एमएएमपी-प्रेरित डीईजी एससी 155-14 ई में एन्थ्रेक्नोज की प्रतिरोध प्रतिक्रिया में योगदान कर सकते हैं क्योंकि चिटिन कवक कोशिका की दीवारों से एक विशिष्ट एमएएमपी अणु है जो पौधे की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ग्रहण करता है। स्ट्रिंगलिस एट अल। [49] ने यह भी बताया कि अप-विनियमित डीईजी के एक सेट को चिटिन, एफएलजी22 से "चिटिन की प्रतिक्रिया" के जीओ शब्द में समृद्ध किया गया था, और एक पौधे लाभकारी राइजोबैक्टीरिया स्यूडोमोनास सिमिया डब्ल्यूसीएस417 उपचारित अरबिडोप्सिस पौधे। मैटिक एट अल। [33] ने बताया कि 21 डीईजी एक प्रतिरोधी कल्टीवेटर के चावल के पत्ते आरएनए-सीक्यू विश्लेषण से "चिटिन की प्रतिक्रिया" के जीओ शब्द में समृद्ध थे, लेकिन कवक रोगज़नक़ फुसैरियम फुजिकुरोई के संक्रमण के बाद अतिसंवेदनशील कल्टीवेटर से नहीं।

पीआर (पैथोजेनेसिस-संबंधी) जीन पौधे की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया [50] में शामिल होते हैं और कई फाइटोपैथोजेनिक कवक [51] के खिलाफ एंटिफंगल गतिविधि करते हैं। PR -10 प्रोटीन छोटे, मुख्य रूप से अम्लीय, इंट्रासेल्युलर प्रोटीन होते हैं जिनमें एंटीफंगल गुण होते हैं जो पौधों की प्रजातियों में ज्वार [52] सहित रक्षा प्रतिक्रियाओं से जुड़े होते हैं। PR-10 जीन परिवार के सदस्यों को विभिन्न प्रकार की पौधों की प्रजातियों [53] में रोगज़नक़ों के हमलों से प्रेरित किया गया था। ज्वार में, लो एट अल। [26] ने बताया कि पीआर -10 एक्सप्रेशन को फोलियर फंगल रोगजनकों सी. हेटेरोस्ट्रोफस और सी. सबलाइनोलम के खिलाफ ज्वार की सक्रिय मेजबान रक्षा के हिस्से के रूप में प्रेरित किया गया था। केटी एट अल। [54] ने बताया कि सी. लुनाटा और एफ. कैप्सिकम के कवकीय बीजाणुओं के क्षेत्र परीक्षणों में टीकाकरण के बाद ज्वार की कई किस्मों ने पीआर -10 की सामान्यीकृत सापेक्ष मात्रा का महत्वपूर्ण समावेश दिखाया। ग्रीनहाउस की स्थिति में, लगाए गए पौधों के ग्लूम्स ने PR-10 mRNA का समावेश दिखाया, और प्रतिक्रिया दो अतिसंवेदनशील किस्मों के सापेक्ष परीक्षण की गई दो प्रतिरोधी किस्मों में अधिक थी।

हमारे परिणामों से पता चला कि पहचाने गए डीईजी में चार पीआर -10 जीन पाए गए (एसओआरबी _3001 जी401300, सोरबी _3001 जी 401200, सोरबी _3001 जी 400800, सोरबी _3001 जी401000)। SC155-14E में सभी चार PR-10 DEG को flg22 या चिटिन उपचार द्वारा अपग्रेड किया गया, इसके विपरीत, BTx623 में, SORBI_3001G401000 DEG में नहीं पाया गया, और SORBI{{15} }G401300 (अप-रेगुलेटेड) केवल BTx623 में चिटिन उपचार के साथ प्रस्तुत किया गया था लेकिन flg22 उपचार के साथ नहीं। इसने संकेत दिया कि एमएएमपी उपचार और एससी 155-14 ई में एन्थ्रेक्नोज के खिलाफ प्रतिरोध के बाद उच्च आरओएस उत्पाद स्तरों के जवाब में पीआर जीन की अभिव्यक्ति को नियोजित किया जा सकता है।

सैलिसिलिक एसिड (एसए) स्थानीय रक्षा प्रतिक्रिया और प्रणालीगत अधिग्रहित प्रतिरोध दोनों के लिए आवश्यक एक पौधा प्रतिरक्षा संकेत है। यह रोगज़नक़ों के हमलों [55] के खिलाफ प्रतिरोध और पौधों की रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सोरघम में, तुगिज़िमाना एट अल। [56] सी. सबलाइन-ओला संक्रमित ज्वार में जैस्मोनिक एसिड, सैलिसिलिक एसिड कॉन्जुगेट्स और एब्सिसिक-एसिड के स्तर में मात्रात्मक परिवर्तन की सूचना दी। C. सबलाइन-ओला एन्थ्रेक्नोज का कारक एजेंट है। अमीनो एसिड (ट्रिप्टोफैन और टाइरोसिन), जैस्मोनिक एसिड और सैलिसिलिक संयुग्मों के बढ़े हुए स्तर वाले सोरघम जीनोटाइप, और ज़ेटिन एन्थ्रेक्नोज के प्रति अधिक प्रतिरोधी थे। इस अध्ययन में, GO शब्द 'सैलिसिलिक एसिड की प्रतिक्रिया' (GO: 0009751) जिसमें 19 अप-विनियमित DEG शामिल हैं, विशेष रूप से केवल SC 155-14 E में चिटिन (टेबल S9) के साथ इलाज किया गया था। इसलिए, एमएएमपी उपचार और एससी 155-14 ई में एन्थ्रेक्नोज के खिलाफ प्रतिरोध के बाद उच्च आरओएस उत्पादन स्तर के जवाब में सैलिसिलिक सिग्नलिंग मार्ग महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।

इसके अलावा, 169 अप-विनियमित डीईजी को पूरी तरह से एससी 155-14 ई में चिटिन (टेबल एस 9) के साथ इलाज के तनाव के लिए जीओ टर्म प्रतिक्रिया में समृद्ध किया गया था। अन्य GO शब्द केवल SC 155-14E में MAMPs के साथ व्यवहार किए गए, लेकिन समान उपचार के साथ BTx623 में नहीं पाए गए हैं, द्वितीयक चयापचय प्रक्रियाएं (GO: 0019748), फॉस्फेटिडिलकोलाइन बायोसिंथेटिक प्रक्रिया (GO: 0006656), और लिपिड बायोसिंथेटिक प्रक्रिया ( जाओ: 0008610)।

इसके अलावा, 169 अप-विनियमित डीईजी को पूरी तरह से एससी 155-14 ई में चिटिन (टेबल एस 9) के साथ इलाज के तनाव के लिए जीओ टर्म प्रतिक्रिया में समृद्ध किया गया था। अन्य GO शब्द केवल SC 155-14E में MAMPs के साथ व्यवहार किए गए, लेकिन समान उपचार के साथ BTx623 में नहीं पाए गए हैं, द्वितीयक चयापचय प्रक्रियाएं (GO: 0019748), फॉस्फेटिडिलकोलाइन बायोसिंथेटिक प्रक्रिया (GO: 0006656), और लिपिड बायोसिंथेटिक प्रक्रिया ( जाओ: 0008610)।

हमने उन जीनों की संरचना की भी जांच की जो flg22 या चिटिन उपचार के साथ-साथ सभी उपचारों में DEG के मुख्य सेट और GO संवर्धन विश्लेषण (आंकड़े 4B और 7B) द्वारा दो जीनोटाइप के बाद दो जीनोटाइप के बीच सह-विनियमित हैं। DEG की पूरी सूची तालिका S14 और S15 में दी गई है। चित्र 4बी ने सभी उपचारों के साथ BTx623 और SC155-14E में कुल, अप- और डाउन-रेगुलेटेड DEG के कोर सेट की समृद्ध GO शर्तें दिखाईं। MAMPs प्रतिक्रिया और पादप रक्षा (जैसे, चिटिन बाइंडिंग, रक्षा प्रतिक्रिया, प्रोटीन किनेज गतिविधि, प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन, प्रोटीन सेरीन / थ्रेओनीन किनसे गतिविधि) से संबंधित GO शर्तें अप-विनियमित DEG में काफी समृद्ध थीं जबकि द्वितीयक मेटाबोलाइट बायोसिंथेटिक प्रक्रिया की GO शर्तें। आयरन आयन बाइंडिंग, ऑक्सीडोरडक्टेस गतिविधि केवल डाउन-रेगुलेटेड डीईजी में समृद्ध थी। यह परिणाम अरबिडोप्सिस के परिणामों के समान था, जहां एलिसिटर्स (पी। उपमा WCS417 से flg22 पेप्टाइड्स और पी। एरुगिनोसा PAO1, चिटिन, और पी। उपमा WCS417 के जीवाणु कोशिकाओं) की प्रतिक्रिया से संबंधित GO शब्द अप-विनियमित में सबसे महत्वपूर्ण रूप से समृद्ध थे। डीईजी का कोर सेट [49]।

चित्र 7B ने flg22 या चिटिन उपचार के बाद BTx623 और SC 155-14E के बीच DEG के सह-विनियमित (यानी, ऊपर या नीचे-विनियमित दोनों जीनोटाइप्स में) सेट की काफी समृद्ध GO शर्तें दिखाईं। परिणामों से पता चला कि MAMPs प्रतिक्रिया और पादप रक्षा (जैसे, रक्षा प्रतिक्रिया, प्रोटीन किनेज गतिविधि, प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन, प्रोटीन सेरीन / थ्रेओनीन किनेज गतिविधि) से संबंधित GO शब्द केवल flg22 या चिटिन अप-विनियमित DEG में दोनों जीनोटाइप में समृद्ध थे, जबकि GO शब्द माध्यमिक मेटाबोलाइट बायोसिंथेटिक प्रक्रिया, हीम बाइंडिंग, आयरन आयन बाइंडिंग, ऑक्सीजन के एक परमाणु की ऑक्सीडोरडक्टेस गतिविधि और फॉस्फेटिडिलकोलाइन बायोसिंथेटिक प्रक्रिया केवल डीईजी के डाउन-रेगुलेटेड सेट में समृद्ध हुई।

2.4। BTx623 और SC155-14E की MTI प्रतिक्रिया का KEGG पाथवे संवर्धन विश्लेषण

चित्र 9 एमएएमपी-उपचारित बीटीएक्स623 और एससी 155-14ई नमूनों में डीएवीआईडी ​​​​ऑनलाइन टूल [57] का उपयोग करते हुए पाए गए अप-विनियमित डीईजी के केईजीजी मार्ग संवर्धन विश्लेषण को दर्शाता है। डीईजी की पूरी सूची तालिका S16–S20 में प्रदान की गई है। परिणाम दो ज्वार जीनोटाइप में एमटीआई के सक्रियण के परिणामस्वरूप समृद्ध उन विशिष्ट शीर्ष केईजीजी मार्गों की पहचान करते हैं। KEGG पाथवे "प्लांट-पैथोजेन इंटरेक्शन" में, हमने देखा कि चिटिन-उपचारित SC 155-14E नमूनों में 24 अपरेगुलेटेड DEG समृद्ध थे, जबकि कोई भी DEG चिटिन-उपचारित BTx623 नमूनों में समृद्ध नहीं था। जीनोटाइप एससी 155-14 ई की मजबूत चिटिन प्रतिक्रिया इस जीनोटाइप के कवक रोग एन्थ्रेक्नोज [39] के अधिक प्रतिरोध के साथ सहसंबद्ध है। इसके अलावा, KEGG पाथवे संवर्धन ने SC 155-14E में फेनिलप्रोपेनाइड जैवसंश्लेषण में शामिल 28 जीनों का खुलासा किया, जिन्हें flg22 के साथ इलाज किया गया था। फेनिलप्रोपेनाइड जैवसंश्लेषण मार्ग फेनिलएलनिन से शुरू होता है जिसे फ्लेवोनोइड्स, बेंजीनोइड्स, क्यूमरिन, हाइड्रॉक्सीसिनामेट्स और लिग्निन [58,59] जैसे सुगंधित यौगिकों में परिवर्तित किया जा सकता है। रोग-प्रतिरोध प्रतिक्रिया [28,60] में कई फेनिलप्रोपानोइड्स और फ्लेवोनोइड्स शामिल थे। ज्वार में एन्थ्रेक्नोज रोगज़नक़ सी. सबलाइन-ओला [28] के विरुद्ध फाइटोएलेक्सिन का उत्पादन एक प्रमुख रक्षा प्रतिक्रिया है। 3- डीऑक्सी एंथोसायनिडिन फ्लेवोनोइड्स का एक असामान्य समूह है जिसे ज्वार में फाइटोएलेक्सिन के रूप में पहचाना जाता है। फाइटोएलेक्सिन रोगाणु संक्रमण [61] के बाद उत्पादित रोगाणुरोधी गतिविधि वाले छोटे अणु होते हैं। वांग एट अल। [37] यह भी पाया गया कि केईजीजी शब्द फेनिलप्रोपेनाइड जैवसंश्लेषण सी. सबलाइन-ओला-संक्रमित पौधों के डीईजी में ज्वार के उनके ट्रांसक्रिप्टोमिक्स अध्ययन में काफी समृद्ध था। हमें ध्यान देना चाहिए कि KEGG पाथवे संवर्धन परिणाम (चित्र 9) ने कुछ पाथवे में MAMPs उपचार के बाद BTx623 की उच्च प्रतिक्रिया भी दिखाई, जो प्लांट-पैथोजेन इंटरैक्शन (जैसे, पाथवे फेनिलएलनिन और ट्रिप्टोफैन बायोसिंथेसिस, एंटीबायोटिक बायोसिंथेसिस) में भूमिका निभा सकते हैं।

इसके अलावा, डाउन-रेगुलेटेड डीईजी के केईजीजी पाथवे संवर्धन विश्लेषण के परिणामों से पता चला है कि दस डाउन-रेगुलेटेड डीईजी को 'प्रकाश संश्लेषण-एंटीना प्रोटीन' के रूप में एनोटेट किया गया था और 84 डीईजी को 'द्वितीयक चयापचयों के जैवसंश्लेषण' में भाग लेने के रूप में एनोटेट किया गया था। बीटीएक्स 623। हालांकि, इस तरह के जीन अभिव्यक्ति अध्ययन MAMPs उपचार या रोगज़नक़ संक्रमण के जवाब में अलग-अलग व्यक्त किए गए जीन की पहचान कर सकते हैं, लेकिन यह जरूरी नहीं दर्शाता है कि ये जीन किसी विशिष्ट रोगज़नक़ के खिलाफ प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रकार, दोनों जीनोटाइप में कवक प्रतिरोध और उन केईजीजी मार्गों के सक्रियण के बीच प्रेरक संबंधों को समझने के लिए आगे के शोध की आवश्यकता होगी, जैसा कि आरएनए-सेक विश्लेषण से पता चला है।

हमने सभी स्थितियों में डीईजी के मुख्य सेटों के लिए केईजीजी पाथवे संवर्धन विश्लेषण भी किया (चित्र 4सी) और साथ ही flg22 या चिटिन उपचार (चित्र 7सी) के बाद दो जीनोटाइप के बीच सह-विनियमित डीईजी। परिणामों से पता चला कि प्लांट-पैथोजेन इंटरेक्शन पाथवे सहित छह महत्वपूर्ण रास्ते केवल डीईजी के अप-रेगुलेटेड कोर सेट में समृद्ध थे, लेकिन डीईजी के डाउन-रेगुलेटेड कोर सेट में नहीं। इसी तरह, प्लांट-पैथोजेन इंटरेक्शन पाथवे सहित सात और तीन रास्ते क्रमशः BTx623 और SC155-14E में चिटिन अप-रेगुलेटेड DEGs और flg22 अप-रेगुलेटेड DEGs में काफी समृद्ध थे। इसके विपरीत, यूकेरियोट्स मार्ग में केवल राइबोसोम बायोजेनेसिस को दोनों जीनोटाइप में चिटिन-डाउन-रेगुलेटेड डीईजी में समृद्ध किया गया था।

2.5। चुनिंदा जीनों के मात्रात्मक आरटी-पीसीआर का उपयोग करके आरएनए-सेक डेटा का सत्यापन

RNA-seq द्वारा प्राप्त जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइलिंग डेटा की पुष्टि करने के लिए, हमने नौ चयनित उम्मीदवार जीनों की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए qRT-PCR विश्लेषण किया। उन नौ जीनों को तीन श्रेणियों में RNA-seq द्वारा देखी गई अभिव्यक्ति के आधार पर चुना गया था: (a) इसी तरह BTx623 और SC 155-14E में flg22 या चिटिन उपचार के साथ व्यक्त किया गया; (बी) केवल एमएएमपी के इलाज वाले एससी 155-14 ई में व्यक्त किया गया, लेकिन इलाज किए गए बीटीएक्स 623 में बेहद कम अभिव्यक्ति के साथ और (सी) एमएएमपी के इलाज में 2-21- गुना अधिक व्यक्त किया गया एससी 155-14 ई बीटीएक्स 623 के सापेक्ष . क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण के परिणाम (तालिका 1) ने मूल्यांकन किए गए नौ जीनों में से प्रत्येक के लिए आरएनए-सीक्यू विश्लेषण द्वारा निर्धारित अभिव्यक्ति स्तरों के साथ एक पूर्ण समझौते का खुलासा किया। ये परिणाम हमें विश्वास दिलाते हैं कि RNA-seq द्वारा किए गए माप MAMP उपचार के लिए सोरघम लाइनों की ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया को दर्शाते हैं।

2.6। निष्कर्ष

इस अध्ययन में, हमने पहली बार पत्तियों के तीन सेटों का उपयोग करके आरओएस उत्पादन का परीक्षण करके दो जीनोटाइप की एमटीआई प्रतिक्रिया की तुलना के लिए इष्टतम स्थिति पाई और आरएनए निष्कर्षण और बाद में ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए पंद्रह-दिवसीय पौधों की दूसरी सबसे छोटी पत्तियों को चुना। ज्वार 22- के एक समय पाठ्यक्रम ने ट्रिगर किया और सोरघम लाइन एससी 155-14 ई (चित्रा 1सी) में चिटिन-ट्रिगर आरओएस उत्पादन से पता चला कि चिटिन-ट्रिगर आरओएस उत्पादन flg22 उपचार द्वारा ट्रिगर होने से पहले हुआ था। हमने प्रारंभिक चरणों के दौरान ROS उत्पादन पर MAMPs उपचार के लिए उच्च प्रतिक्रिया के साथ कवक रोग एन्थ्रेक्नोज-प्रतिरोधी सोरघम बाइकलर जीनोटाइप SC 155-14 E की अभिव्यक्ति प्रोफाइल प्राप्त की और ROS उत्पाद पर कम प्रतिक्रिया के साथ अतिसंवेदनशील जीनोटाइप BTx623 प्राप्त किया। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया।

परिणाम MAMP उपचार के जवाब में ज्वार जीनोटाइप्स BTx623 और SC 155-14E में जीन अभिव्यक्ति की स्पष्ट भिन्नता प्रदर्शित करते हैं। जबकि दो एमएएमपी की प्रतिक्रियाओं ने प्रत्येक पंक्ति (86.6–70.8 प्रतिशत) के भीतर काफी ओवरलैप दिखाया, वे अलग थे। कुछ, हालांकि कम, ओवरलैप (68.3-29 प्रतिशत) भी दो पंक्तियों की प्रतिक्रियाओं के बीच एक ही MAMP के बीच देखा गया था। डीईजी की काफी संख्या, 10,535 डीईजी में से 2272, सभी चार स्थितियों में पहचाने गए और कोर एमएएमपी प्रतिक्रिया को अस्थायी रूप से परिभाषित करते हैं। जीन की यह सूची उन प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी होनी चाहिए जो एमएएमपी उपचार के लिए जीन अभिव्यक्ति की प्रतिक्रिया को प्रोफाइल करना चाहते हैं। RNA-seq विश्लेषण ने BTx623 और SC155-14E में उन दो पंक्तियों के अनुपचारित मॉक नियंत्रणों की तुलना में flg22 या चिटिन के साथ व्यवहार किए गए अंतर व्यक्त जीनों के बड़े सेटों की पहचान की। इसके अलावा, दो अलग-अलग जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइनों का उपयोग करके चयनित डीईजी की तुलना ने बहुत समान परिणाम दिखाए। इन डीईजी के विस्तृत अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल विश्लेषण, जीओ संवर्धन विश्लेषण और केईजीजी मार्ग विश्लेषण ने दो जीनोटाइप की जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया में स्पष्ट भिन्नता प्रकट की। GO टर्म और KEGG पाथवे संवर्धन ने MAMP- उपचारित SC {{18} में अधिक प्रतिरक्षा और रोगज़नक़ प्रतिरोध-संबंधी DEG (PR जीन, चिटिन के लिए जीन की प्रतिक्रिया, सैलिसिलिक एसिड के प्रति जीन की प्रतिक्रिया, तनाव की प्रतिक्रिया, फेनिलप्रोपेनाइड जैवसंश्लेषण, आदि) की खोज की। }समान उपचार के साथ BTx623 के सापेक्ष ई नमूने। यह जानकारी महत्वपूर्ण आधारभूत जानकारी प्रदान करती है कि कैसे इस प्रमुख फसल संयंत्र की सहज प्रतिरक्षा प्रणाली एमएएमपी के उत्थान के प्रति प्रतिक्रिया करती है। मॉडल अरबिडोप्सिस के सापेक्ष, फसल पौधों की सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर जानकारी की सामान्य कमी को देखते हुए, वर्णित जीन सूची और विधियां रोगजनकों के लिए ज्वार की प्रतिक्रिया की आगे की खोज के लिए एक संसाधन प्रदान करती हैं और अंततः रोग प्रतिरोधक क्षमता में सुधार के प्रयासों को सुगम बनाती हैं। यह महत्वपूर्ण भोजन और बायोमास फसल है।

3. सामग्री और तरीके

3.1। संयंत्र सामग्री

इस अध्ययन में डॉ. विलियम रूनी (टेक्सास ए एंड एम यूनिवर्सिटी, कॉलेज स्टेशन, यूएसए) और डॉ. स्टीफन क्रेसोविच (क्लेम्सन यूनिवर्सिटी, क्लेम्सन, यूएसए) द्वारा प्रदान की गई दो ज्वारी लाइनों का उपयोग किया गया था। BTx623 उपलब्ध संपूर्ण जीनोम अनुक्रम [22] के साथ एक मानक ज्वार रेखा है, और SC155-14E एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध [39] के लिए विकसित एक रेखा है।

3.2। आरओएस परख

BTx623 और SC155-14E के ज्वार के बीजों को सतह से निष्फल किया गया (1 मिनट के लिए 70 प्रतिशत इथेनॉल और फिर 10 मिनट के लिए 10 प्रतिशत ब्लीच, ऑटोक्लेव्ड ddH2O से धोया गया) और ऑटोक्लेव्ड सनशाइन पॉटिंग मिक्स में लगाया गया, और विकास कक्षों में अंकुरित किया गया ( 16 h/8 h प्रकाश/अंधेरा, 28/26 ◦C, 60–70 प्रतिशत आर्द्रता)। प्रयोगों के लिए पंद्रह दिन पुराने पौधों का इस्तेमाल किया गया।

इस अध्ययन में दो MAMPs, flg22 (जेनस्क्रिप्ट कैटलॉग # RP19986) और केकड़े के खोल से चिटिन (सिग्मा-एल्ड्रिच, कैटलॉग # C3641) का उपयोग किया गया था। Flg22 एक पेप्टाइड है जो प्लांट रोगजनक बैक्टीरिया के फ्लैगेलिन एन-टर्मिनस से प्राप्त होता है और पौधों में एक विशिष्ट सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए जाना जाता है [62]। चिटिन एक विशिष्ट एमएएमपी अणु है जो कवक कोशिका की दीवारों से प्राप्त होता है, जो पौधे की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया [3] को प्राप्त करता है। Kimball et al के अनुसार ROS assays का प्रदर्शन किया गया। [38]। व्यक्तिगत जीनोटाइप के साथ-साथ पत्तियों की स्थिति के भीतर एमएएमपी प्रतिक्रिया में भिन्नता का आकलन करने के लिए, प्रत्येक जीनोटाइप के पौधों की सभी तीन पूरी तरह से विस्तारित पत्तियों का व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन किया गया था। प्रत्येक जीनोटाइप के पन्द्रह दिन पुराने ज्वार के पौधों के नीचे से ऊपर तक की पत्तियों को पत्ती #1, #2, और #3 के रूप में चिह्नित किया गया था। आरओएस उत्पादन को मापने के लिए हमने नमूने के लिए पत्ती के केवल मध्य भाग का उपयोग किया। उपचार के तुरंत बाद, फोटेक सीसीडी कैमरा (फोटेक लिमिटेड, ईस्ट ससेक्स यूके) का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के रसायनयुक्त संकेत को 30 मिनट के लिए रिकॉर्ड किया गया था। आठ कुओं में नकली उपचार (एमएएमपी के बिना) और आठ कुओं में उपचार (एमएएमपी के साथ) शामिल था। हर मामले में, प्रत्येक उपचार के लिए कुल 8 नमूनों के साथ तीन जैविक प्रतिकृति की तुलना की गई।

3.3। एमएएमपी के साथ नमूना उपचार

प्रयोगों के लिए पंद्रह दिन पुराने पौधों का इस्तेमाल किया गया। वैल्ड्स-लोपेज़ एट अल में वर्णित MAMPs उपचार किए गए थे। [12] मामूली संशोधनों के साथ। संक्षेप में, प्रत्येक सोरघम लाइन के लिए पांच पौधों से दूसरी पत्ती (ऊपर से यानी दूसरी सबसे छोटी पत्ती) को अलग कर दिया गया और फिर 2 मिनट के लिए ऑटोक्लेव्ड ddH2O के साथ वैक्यूम घुसपैठ किया गया। प्रत्येक जीनोटाइप के पानी-घुसपैठ वाले पत्तों से लगभग पचास 1 सेमी व्यास की पत्ती की डिस्क को काटा गया और पूल किया गया। प्रत्येक जीनोटाइप से पैंतालीस पत्ती डिस्क को तीन अलग-अलग पेट्री डिश (प्रत्येक पेट्री डिश में 15 पत्ती डिस्क) में स्थानांतरित किया गया और फिर एल्यूमीनियम पन्नी से ढकी प्लेटों के साथ ऑटोक्लेव्ड ddH2O पर कमरे के तापमान पर रात भर तैरती रही। अगले दिन, सभी पेट्री डिश से पानी निकाल दिया गया और 10 एमएल ddH2O (मॉक), 10 एमएल 1 µM flg22, या 10 एमएल 20 mg/mL चिटिन घोल से बदल दिया गया। एक 60-मिनट के उपचार के बाद, मॉक- और एमएएमपी-उपचारित पत्ती के टुकड़ों को अलग-अलग नलियों में काटा गया और तुरंत तरल नाइट्रोजन में जमा दिया गया। लीफ स्लाइस के नमूने (101quenced "ies ie-11272 के लिए) इम्युनिटीBTx623 और SC155-14E मॉक, flg22, या चिटिन उपचार, तीन जैविक प्रतिकृति के साथ) RNA निष्कर्षण के लिए -80 ◦C पर संग्रहीत किए गए थे। सभी किसी भी संभावित प्रकाश संश्लेषण प्रभाव को खत्म करने के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं को अंधेरे परिस्थितियों में किया गया था।

3.4। आरएनए एक्सट्रैक्शन, सीक्वेंसिंग और लाइब्रेरी कंस्ट्रक्शन

निर्माता के निर्देशों के अनुसार Zymoresearch (कैटलॉग #R2071) से Direct-zol RNA Miniprep Plus किट का उपयोग करके RNA निष्कर्षण किया गया था।

यूनिवर्सिटी ऑफ मिसौरी डीएनए कोर फैसिलिटी में हाई-थ्रूपुट सीक्वेंसिंग की गई। इल्लुमिना के ट्रूसेक एमआरएनए फंसे हुए नमूना तैयार करने की किट में आपूर्ति किए गए अभिकर्मकों के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद अठारह पुस्तकालयों का निर्माण किया गया था। नमूना एकाग्रता क्यूबिट एचएस आरएनए परख किट का उपयोग करके क्यूबिट फ्लोरोमीटर (इंविट्रोजन) द्वारा निर्धारित किया गया था, और फ्रैगमेंट एनालाइजर स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग करके आरएनए अखंडता की जांच की गई थी। संक्षेप में, पॉली-ए युक्त एमआरएनए को कुल आरएनए (1 माइक्रोग्राम) से शुद्ध किया गया था, आरएनए को खंडित किया गया था, खंडित आरएनए से डबल-स्ट्रैंडेड सीडीएनए उत्पन्न किया गया था, और एडेप्टर युक्त सूचकांक सिरों तक जुड़ा हुआ था। प्रवर्धित सीडीएनए निर्माणों को एक्सप्रेप मैग पीसीआर क्लीन-अप मोतियों के अतिरिक्त शुद्ध किया गया था। प्रत्येक शुद्ध पुस्तकालय के अंतिम निर्माण का मूल्यांकन फ्रैगमेंट एनालाइजर स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग करके किया गया था, क्यूबिट एचएस डीएसडीएनए परख किट का उपयोग करके क्यूबिट फ्लोरोमीटर के साथ मात्रा निर्धारित की गई थी, और नेक्स्टसेक 500 पर अनुक्रमण के लिए इलुमिना के मानक अनुक्रमण प्रोटोकॉल के अनुसार पतला था। अनुक्रमण लंबाई एकल थी। 75 ठिकानों पर पढ़ें।

3.5। RNA-Seq रीड्स की मैपिंग और प्रोसेसिंग

अनुक्रम डेटा ने छह अलग-अलग स्थितियों का प्रतिनिधित्व किया: नकली, flg22, या चिटिन उपचार के साथ BTx623, और नकली, flg22, या चिटिन उपचार के साथ SC155-14E। प्रत्येक स्थिति को तीन जैविक प्रतिकृति द्वारा दर्शाया गया था, जिसके परिणामस्वरूप कुल 18 नमूने थे। सबसे पहले, रीड्स के 3 0 सिरों को इल्लुमिना एडेप्टर के लिए "छंटनी" की गई, अस्पष्ट न्यूक्लियोटाइड्स (N's) के लिए, और (NextSeq तकनीक के कारण) कृत्रिम पॉली-जी के लिए (G{100} के रूप में दर्शाया गया) cutadapt का उपयोग कर संस्करण 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, 21 अगस्त 2019 को एक्सेस किया गया) रीड्स के लिए जिनके 30 सिरे 90 प्रतिशत पहचान के साथ न्यूनतम 3 आधारों के लिए एडॉप्टर के साथ ओवरलैप होते हैं। यदि इस ट्रिमिंग के बाद, एक रीड में दस से कम आधार होते हैं, तो इसे छोड़ दिया जाता है (यदि लागू हो तो इसके युग्मित पढ़ने के साथ)। ट्रिमिंग के बाद RNA seq डेटा के लिए गुणवत्ता स्कोर की FASTQC (संस्करण 0.11.9) [63] का उपयोग करके जांच की गई। रीड्स में सभी पदों के लिए औसत गुणवत्ता स्कोर 34 के आसपास है, जो दर्शाता है कि आधार कॉलिंग सटीकता 99.9 प्रतिशत से अधिक है। प्रत्येक नमूने के लिए रीड्स को टॉपहैट 2.1.1 के साथ संदर्भ जीनोम (सोरघम _बाइकलर _NCBIv3.dna. top-level.fa) से जोड़ा गया था। प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिलेखों को इकट्ठा करने के लिए परिणामी संरेखण फाइलें कफ़लिंक 2.2.1 को प्रदान की गईं। इस शोध में इस्तेमाल किया गया एनोटेशन संस्करण सोरघम _बाईकलर _NCBIv3.38.gff3 था। कफ़मर्ज का उपयोग करके उसी स्थिति से नमूने मर्ज किए गए थे। उद्देश्य प्रत्येक स्थिति में जीन और प्रतिलेख अभिव्यक्ति की गणना के लिए एक समान आधार प्रदान करना था।

3.6। RNA-Seq डेटा का जैव सूचनात्मक विश्लेषण

RNA seq डेटा का विश्लेषण बायोइन्फॉर्मेटिक्स टूल्स बोवी {{0}}}.3.4.3, टॉपहैट 2.1.1, और कफ़लिंक्स 2.2.1 (कफ़मर्ज, कफ़डिफ़) के डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ किया गया। हमने इन उपकरणों के साथ उसी पाइपलाइन का उपयोग किया जैसा कि ट्रैपनेल एट अल में वर्णित है। [64]। परख परिणामों की और पुष्टि करने के लिए, हमने विश्लेषण करने के लिए HiSat2 (संस्करण 2.1। 0), HTSeq (संस्करण 0.12.4), और edgeR (संस्करण 3.26.8) के साथ एक और पाइपलाइन का उपयोग किया। HiSat2, TopHat2 का अगला विकास है। सबसे पहले, हमने सोरघम संदर्भ जीनोम का उपयोग करके संरेखण करने के लिए HiSat2 का उपयोग किया। फिर हमने HTSeq का उपयोग यह गिनने के लिए किया कि प्रत्येक जीन में कितने रीड मैप किए गए थे। इसके लिए हमें पिछले स्टेप से जनरेट हुई bam फाइल्स और जीनोम एनोटेशन (gif फाइल) की जरूरत थी। ध्यान दें कि संदर्भ जीनोम और एनोटेशन फाइलें वैसी ही हैं जैसी हमने मूल पाइपलाइन में इस्तेमाल की थीं। अंत में, हमने प्रत्येक स्थिति में विभेदित रूप से व्यक्त जीनों को निर्धारित करने के लिए आर पैकेज एजआर का उपयोग किया

3.7। विभेदित रूप से व्यक्त जीन की पहचान
मर्ज किए गए असेंबली को कफ़डिफ़ को खिलाया गया था, जो अभिव्यक्ति के स्तर की गणना करता है और दो स्थितियों के बीच देखे गए परिवर्तनों के सांख्यिकीय महत्व का परीक्षण करता है। हमने क्रमशः BTx623, और SC155-14E के लिए नकली बनाम flg22, और नकली बनाम चिटिन के बीच स्थितियों की तुलना की। विभेदित रूप से अभिव्यक्त जीन 0.001 पी-वैल्यू थ्रेसहोल्ड का उपयोग करके निकाले गए थे। ज्वालामुखी भूखंडों को R पैकेज (ggplot2 V3.3.0) का उपयोग करके क्रमशः BTx623 को flg22 या चिटिन और SC 155- 14 E के साथ flg22 या चिटिन के साथ इलाज की स्थिति में जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के महत्व को दिखाने के लिए बनाया गया था। −log10 (p-मान) के बराबर या तीन से अधिक वाले जीन डॉट्स को DEG माना जाता था। प्रत्येक भूखंड में, शून्य से अधिक log2 (गुना _ परिवर्तन) वाले जीन डॉट्स अप-विनियमित जीन थे, अन्यथा, वे डाउन-विनियमित जीन थे।

3.8। पीसीए प्लॉट

प्रत्येक सोरघम लाइन के तीन जैविक प्रतिकृति और प्रत्येक एमएएमपी उपचार के जीन अभिव्यक्ति मूल्यों के बीच संबंधों की जांच करने के लिए, आर पैकेज (ggfortify V {{0}}.4.10, ggplot2 V3) का उपयोग करके प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) प्लॉट उत्पन्न किए गए थे। .3.0)। मूल फीचर स्पेस (जीन एक्सप्रेशन) से पहले दो प्रमुख घटकों तक मैप करने के बाद प्रत्येक डॉट एक स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है। एक ही स्थिति से संबंधित डॉट्स एक साथ क्लस्टर होते हैं

3.9। डीईजी का हीट मैप

प्लांट साइंस एंड टेक्नोलॉजी एंड बायोकेमिस्ट्री का 1 डिवीजन, सीएस बॉन्ड लाइफ साइंसेज सेंटर, मिसौरी विश्वविद्यालय, कोलंबिया, एमओ 65211, यूएसए; cuiy@missouri.edu (वाईसी); chendq@cau.edu.cn (डीसी)

2 इलेक्ट्रिकल इंजीनियरिंग और कंप्यूटर विज्ञान विभाग, सीएस बॉन्ड लाइफ साइंसेज सेंटर, मिसौरी विश्वविद्यालय, कोलंबिया, एमओ 65211, यूएसए; yjm85@mail.missouri.edu (वाईजे); xudong@missouri.edu (डीएक्स)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 प्लांट साइंस रिसर्च यूनिट, यूएसडीए-एआरएस, रैले, एनसी 27695, यूएसए

* Correspondence: staceyg@missouri.edu