प्लेटलेट-गरीब और समृद्ध प्लाज्मा में ज़ैंथिन ऑक्सीडोरिडक्टेस गतिविधि एक ऑक्सीडेटिव तनाव संकेतक के रूप में रोगियों में गुर्दे प्रतिस्थापन चिकित्सा की आवश्यकता होती है

सार पृष्ठभूमि: ज़ैंथिन ऑक्सीडोरेडक्टेस(XOR) एक हाइड्रॉक्सिलेज़ एंजाइम है जो प्यूरीन के चयापचय में शामिल है। XOR गतिविधि भिन्न हो सकती है: होमोडिमर प्रोटीन को दो अलग-अलग आइसोफॉर्म XD (एंटीऑक्सीडेंट) और XO (प्रोऑक्सीडेंट) में परिवर्तित किया जा सकता है। ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन जो इसके साथ होती हैदीर्घकालिक वृक्क रोग(सी.के.डी.), डायलिसिस और किडनी प्रत्यारोपण के परिणामस्वरूप प्लेटलेट सक्रियण हुआ। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य ज़ैंथिन ऑक्सीडोरडक्टेस और इसकी आइसोफ़ॉर्म गतिविधि पर लागू गुर्दे की प्रतिस्थापन चिकित्सा के प्रभाव को निर्धारित करना था।

सामग्री और विधियाँ: अध्ययन समूह में 117 रोगी शामिल थे, जिन्हें 4 समूहों में विभाजित किया गया: हेमोडायलिसिस - 30 रोगी, पेरिटोनियल डायलिसिस - 30 रोगी, किडनी प्रत्यारोपण रोगी - 27, और रूढ़िवादी उपचार - 30 रोगी। नियंत्रण समूह में 30 स्वस्थ स्वयंसेवक शामिल थे। परिणाम: अध्ययन किए गए समूहों के भीतर प्लेटलेट-गरीब प्लाज्मा (पीपीपी) में एक्सओआर गतिविधि में महत्वपूर्ण अंतर पाए गए (पी=0.001)। पीपीपी (पी) में सभी ऑक्सीडोरेडक्टेस आइसोफॉर्म के गुर्दे प्रतिस्थापन चिकित्सा के प्रकार के बीच एक संबंध था<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Theक्रोनिक किडनी रोग का कारणयह पीपीपी में एक्सडी और एक्सओ गतिविधि में अंतर में भी परिलक्षित हुआ।

निष्कर्ष: सी.के.डी. रोगियों में प्रयुक्त गुर्दे की प्रतिस्थापन चिकित्सा का प्रकार, रोगियों की आयु, डायलिसिस की अवधि, सी.के.डी. के कारण, तथा प्रगति का चरण, एक्स.ओ.आर. तथा इसके आइसोफॉर्म्स की गतिविधि को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करते हैं।

कीवर्ड: ज़ैंथिन ऑक्सीडोरडक्टेस, प्लेटलेट्स, गुर्दे प्रतिस्थापन चिकित्सा,दीर्घकालिक वृक्क रोग, एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम

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पृष्ठभूमि

ज़ैंथिन ऑक्सीडोरडक्टेस (XOR) एक हाइड्रॉक्सिलेज़ एंजाइम है जो प्यूरीन के चयापचय में शामिल है। यह हाइपोक्सैंथिन को ज़ैंथिन और ज़ैंथिन को यूरिक एसिड (UA) में ऑक्सीकरण करने के लिए उत्प्रेरित करता है। XOR गतिविधि भिन्न हो सकती है: होमोडिमर प्रोटीन को दो अलग-अलग आइसोफॉर्म में परिवर्तित किया जा सकता है। ज़ैंथिन डिहाइड्रोजनेज (XD) मुख्य रूप से स्वस्थ ऊतक में व्यक्त किया जाता है, और ज़ैंथिन ऑक्सीडेज (XO) पोस्ट-ट्रांसलेशनल XD संशोधन, ऑक्सीकरण सिस्टीन अवशेषों के साथ-साथ सीमित प्रोटियोलिसिस द्वारा उत्पन्न होता है, जो चोटों के दौरान कोशिकाओं और ऊतकों में एक प्रमुख भूमिका निभाता है [1-3]। उल्लिखित आइसोफॉर्म की गतिविधियाँ एक दूसरे का विरोध करती हैं [4]। XOR NAD+ की उपस्थिति में एक डिहाइड्रोजनेज के रूप में और आणविक ऑक्सीजन के साथ ऑक्सीडेज के रूप में कार्य करता है। विभिन्न प्रकार के ऊतक क्षति में, एंटीऑक्सीडेंट से ऑक्सीडेंट में तेजी से परिवर्तित होने की XOR की क्षमता, एक त्वरित सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए एक आवश्यक तत्व है, जो उदाहरण के लिए, जीवाणु या फंगल संक्रमण में फायदेमंद है [5]।

ज़ैंथिन डिहाइड्रोजनेज (XDO) और ऑक्सीजन के एक प्रतिक्रिया मध्यवर्ती NAD+ और O2 दोनों के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं लेकिन NAD+ के लिए एक उच्च आत्मीयता प्रस्तुत करते हैं [6]। इस मध्यवर्ती आइसोफॉर्म को अलग नहीं किया गया है, लेकिन इसकी गतिविधि का निर्धारण XD से XO में परिवर्तन की ट्रैकिंग की सुविधा प्रदान करता है [7]।

विभिन्न रोगों में सीरम XOR गतिविधि की व्यापक रूप से जांच की गई है। इस एंजाइम में रुचि का कारण इसकी क्रिया की द्वैधता है: एंटीऑक्सिडेंट का उत्पादन करने की क्षमता, और दूसरी ओर, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का निर्माण। वायरल हेपेटाइटिस, संक्रामक मोनोन्यूक्लिओसिस, ऑटोइम्यून रोग, निमोनिया, सिज़ोफ्रेनिया और टाइप II मधुमेह जैसी रोग स्थितियों में XOR गतिविधि में वृद्धि होती है। गुर्दे या यकृत प्रत्यारोपण के बाद रोगियों के सीरम में XOR गतिविधि में वृद्धि भी देखी गई है [8]। यह दिखाया गया है कि XOR के लिए जीन कोडिंग गुर्दे की परिपक्वता और गुर्दे में वसाजनन के लिए जिम्मेदार हो सकती है, और उपकला कोशिकाओं को मेसेनकाइमल ऊतक में बदलने से रोक सकती है [9]। हालांकि, हमारे सर्वोत्तम ज्ञान के कारण, गुर्दे के प्रतिस्थापन उपचार से गुजरने वाले रोगियों में प्लेटलेट-गरीब प्लाज्मा (पीपीपी) और प्लेटलेट-समृद्ध प्लाज्मा (पीआरपी) में एक्सओआर गतिविधि की जांच करने वाली कोई प्रकाशित रिपोर्ट नहीं है। रोगियों के इस समूह में XOR गतिविधि का महत्व बढ़ी हुई प्लेटलेट सक्रियता से संबंधित है, जो क्रोनिक किडनी रोग (CKD), डायलिसिस और किडनी प्रत्यारोपण के साथ होने वाले ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन के कारण होता है। इसके अलावा, डायलिसिस और अंग प्रत्यारोपण के दौरान, ऊतक और रक्त वाहिकाएँ क्षतिग्रस्त हो जाती हैं, और प्लेटलेट्स ऊतक क्षति के स्थान पर पहुँचने वाली पहली कोशिकाएँ होती हैं, जो सूजन प्रक्रिया और उपचार के प्रारंभिक चरणों में सक्रिय रूप से भाग लेती हैं [10]।

पीआरपी और पीपीपी अलग-अलग प्लेटलेट सांद्रता वाले रक्त प्लाज्मा के अंश हैं। पीआरपी और पीपीपी की प्लेटलेट सामग्री क्रमशः प्लेटलेट्स/एमएल और प्लेटलेट्स/एमएल है। पीपीपी और पीआरपी मनुष्यों के पूरे रक्त को अलग-अलग सेंट्रीफ्यूजल गति से बार-बार सेंट्रीफ्यूज करके और धोकर प्राप्त किया जाता है [11, 12]।

एंटीकोएग्युलेटेड रक्त के सेंट्रीफ्यूजेशन बायप्रोडक्ट के रूप में PPP में सामान्य रक्त की तुलना में कम प्लेटलेट सांद्रता होती है। PPP के मुख्य घटक फाइब्रिनोजेन, फ़ाइब्रोनेक्टिन और थ्रोम्बिन हैं। PPP के जैविक प्रभाव हेमोस्टेसिस और जमावट में भाग ले रहे हैं, एक सेल अटैचमेंट वेक्टर के रूप में कार्य कर रहे हैं, और फ़ाइब्रोब्लास्ट और उपकला कोशिकाओं के माइटोसिस को बढ़ावा दे रहे हैं [13]। हालाँकि PPP प्लेटलेट्स में PRP जितना केंद्रित नहीं है, लेकिन यह प्रदर्शित किया गया है कि PPP सेल की वृद्धि और अस्तित्व को भी बनाए रख सकता है। PPP घाव भरने से जुड़े सेल फ़ंक्शन को बढ़ावा देता है और फ़ाइब्रोब्लास्ट के सेल माइग्रेशन और प्रसार को तेज़ करता है [14, 15]। प्लेटलेट-समृद्ध प्लाज्मा में सामान्य प्लाज्मा (लगभग 150-400 × 103 सेल / डीएल) की तुलना में अधिक केंद्रित प्लेटलेट्स होते हैं। यह साहित्य में PRP की सबसे आम परिभाषाओं में से एक है [16]। आज तक, सीमित अध्ययनों ने क्रोनिक किडनी रोग से पीड़ित रोगियों में प्लेटलेट-समृद्ध या खराब प्लाज्मा में XOR और इसकी आइसोफ़ॉर्म गतिविधि की विशेषता बताई है। टैन एट अल. ने दिखाया कि रिएक्टिव ऑक्सीजन स्पीशीज (आरओएस) (क्रोनिक रीनल रिप्लेसमेंट थेरेपी के मामले में) से क्षतिग्रस्त कोशिकाएं एक्सओआर आइसोफॉर्म को "लीक" करती हैं, जिससे प्लाज्मा में एंजाइम का स्तर बढ़ जाता है [17]। यह तंत्र पीपीपी की तुलना में प्लेटलेट्स में एक्सओआर और इसके आइसोफॉर्म की कम गतिविधि की व्याख्या करता है। इसलिए, पीपीपी और पीआरपी में ऑक्सीडोरडक्टेस की सक्रियता बहुत रुचिकर है, क्योंकि वे प्रतिदिन होने वाली सेलुलर प्रक्रियाओं को उजागर करने में मदद कर सकते हैं। इस तरह की जांच रोगियों के इस समूह में ऑक्सीडेटिव तनाव की गंभीरता को भी अप्रत्यक्ष रूप से उजागर कर सकती है।

बेरी एट अल. यह भी वर्णन करते हैं कि ज़ैंथिन ऑक्सीडोरडक्टेस यकृत, छोटी आंत, स्तन ग्रंथि और एंडोथेलियल कोशिकाओं में वितरित होता है। उपकोशिकीय स्थानीयकरण विधियों ने कोशिका द्रव्य और कोशिका झिल्लियों दोनों में ज़ैंथिन ऑक्सीडोरडक्टेस की उपस्थिति का प्रदर्शन किया है। वे यह भी संकेत देते हैं कि प्लाज्मा ज़ैंथिन ऑक्सीडोरडक्टेस कोशिका झिल्लियों से ज़ैंथिन ऑक्सीडोरडक्टेस छायांकन या कोशिका द्रव्य से लीक होने के कारण हो सकता है। यह एक कारण है कि हम प्लाज्मा में मौजूद प्लेटलेट्स और अन्य रक्त कोशिकाओं में एंजाइम गतिविधि को अलग करने के लिए PPP और PRP में XOR की गतिविधि का परीक्षण करते हैं [18]। एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों की गतिविधि के आधार पर, हम यह भी निर्धारित कर सकते हैं कि किस प्रकार की रीनल रिप्लेसमेंट थेरेपी से रोगी को ऑक्सीडेटिव तनाव के संपर्क में आने की संभावना कम है। XOR की दोहरी प्रकृति के कारण, रीनल रिप्लेसमेंट थेरेपी के प्रकार और XOR आइसोफॉर्म की गतिविधि के बीच संबंधों की समझ रीनल रिप्लेसमेंट थेरेपी के प्रकार के चयन में बहुत दिलचस्प और सहायक हो सकती है।

सामग्री और तरीके

नैतिक अनुमोदन और सहमति

स्ज़ेसिन में पोमेरेनियन मेडिकल यूनिवर्सिटी के बायोएथिकल कमीशन ने किए गए शोध को मंजूरी दे दी (सं. KB−0012/36/11)। नियंत्रण समूह में स्वस्थ स्वयंसेवकों सहित सभी प्रतिभागियों को अध्ययन के उद्देश्य और दायरे के बारे में सूचित किया गया और उन्होंने नमूने दान करने और परिणामी डेटा के प्रकाशन के लिए अपनी सहमति दी।

अध्ययन दल

इसमें 147 प्रतिभागी थे: 30 स्वस्थ स्वयंसेवकों (एनके) का एक नियंत्रण समूह, और 117 क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) वाले रोगी स्ज़ेसिन में पोमेरेनियन मेडिकल यूनिवर्सिटी के नेफ्रोलॉजी, ट्रांसप्लेनेटोलॉजी और आंतरिक रोग क्लिनिक में भाग ले रहे थे। टी रोगियों को उनके द्वारा प्राप्त उपचार के आधार पर 4 समूहों में विभाजित किया गया था: हेमोडायलिसिस से पहले और बाद में 30 रोगी (एचडी ए और एचडी बी): 30 रोगियों ने पेरिटोनियल डायलिसिस (पीडी) प्राप्त किया; किडनी प्रत्यारोपण से पहले और बाद में 27 रोगी (सर्जरी के 5-7 दिन बाद) (टीई, टीई ए); 30 रोगियों को रूढ़िवादी उपचार (सीटी) (सीकेडी चरण 2-5) मिला।

नमूने

सभी अध्ययन प्रतिभागियों से रक्त के नमूने (K2EDTA (8 मिली), 3.8% ट्राइसोडियम साइट्रेट (9: 1; v / v), और सीरम (8 मिली)) लिए गए थे। हेमोडायलिसिस वाले रोगी का खून उनके आर्टेरियोवेनस फिस्टुला से लिया गया था; अन्य सभी प्रतिभागियों के लिए परिधीय शिरापंक्चर का उपयोग किया गया था। हेमोडायलिसिस रोगियों से नमूने पहले (एचडी ए) और पंप बंद होने के लगभग 10 मिनट बाद (एचडी बी) लिए गए थे। ट्रांसप्लांट रोगी का खून ट्रांसप्लांटेशन से पहले (टीई) और सर्जरी के 5-7 दिन बाद (टीई ए) एकत्र किया गया था। टीई समूह के लिए भर्ती किए गए मरीज इस अध्ययन में हेमोडायलिसिस या पेरिटोनियल डायलिसिस रोगियों के समूह से संबंधित नहीं थे। वे पूरे पोलैंड से प्रत्यारोपण के लिए योग्य मरीज थे। किडनी ट्रांसप्लांट वाले अधिकांश रोगियों का पूर्व मोडेनेलिसिस था। प्लेटलेट-समृद्ध प्लाज्मा (पीआरपी) और प्लेटलेट-गरीब प्लाज्मा (पीपीपी) प्राप्त करने के लिए, साइट्रेट के साथ एकत्रित रक्त को 20 डिग्री पर 10 मिनट के लिए 1100 आरपीएम पर अपकेंद्रित्र किया गया था। परिणामी पीआरपी को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित किया गया और 20 डिग्री पर 10 मिनट के लिए 6000 आरपीएम पर अपकेंद्रित्र किया गया: प्लेटलेट-गरीब प्लाज्मा (पीपीपी) को एक अलग ट्यूब में स्थानांतरित किया गया; प्लेटलेट गोली को दो बार धोया गया और टायरोडा बफर (पीएच 7.4) में निलंबित कर दिया गया। प्लाज्मा, सीरम, पीपीपी और पीआरपी को -80 डिग्री पर जमाया गया जब तक कि परख नहीं की गई। हेमोडायलिसिस रोगियों में, हेपरिन प्रशासन से पहले और डायलिसिस के बाद रक्त एकत्र किया गया था

प्लेटलेट-कमज़ोर प्लाज़्मा और प्लेटलेट्स में ज़ैंथिन ऑक्सीडोरडक्टेस की गतिविधि

निर्धारण पर्किन एल्मर यूवी/वीआईएस लैम्ब्डा 40पी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ किया गया। 30 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 340nm (XD) और 302nm (XDO, XO) पर विलुप्त होने के परिवर्तन दर्ज किए गए। एंजाइमेटिक गतिविधि को यूरिक एसिड और NADH (A340 और A302 में वृद्धि) के गठन के रूप में मापा गया और mU× mL−1 (मिलीयूनिट प्रति मिलीलीटर) में व्यक्त किया गया। प्रतिक्रिया की प्रारंभिक दरों को ध्यान में रखते हुए एंजाइमेटिक गतिविधि की गणना की गई। यूरिक एसिड गठन को 302nm (आइसोफॉर्म XDO और XO) पर मापा गया क्योंकि इसका अवशोषण अभी भी वहाँ अधिक है, जबकि NAD+ सांद्रता में परिवर्तन योगदान नहीं करते हैं। NADH+ H+ के लिए विलुप्ति गुणांक ε340=6.22× 103 [L∙mol−1 cm−1 ] का उपयोग ज़ैंथिन ऑक्सीडोरडक्टेस NADH+ H+ के आइसोफॉर्म की गतिविधि की गणना करने के लिए किया गया था: ε302=2.30× 103 [L∙mol−1 cm−1 ] [7, 19–22]।

तालिका 1 अध्ययन में भाग लेने वाले हेमोडायलिसिस रोगियों (एचडी), पेरिटोनियल डायलिसिस (पीडी) रूढ़िवादी तरीके से इलाज (सीकेडी), किडनी प्रत्यारोपण (टीई), और नियंत्रण समूह (सी) की सामान्य विशेषताएं (औसत ± एसडी)

पी * - एचडी, पीडी और सीकेडी समूहों के बीच अंतर के लिए सांख्यिकीय महत्व, गुणात्मक चर के लिए टीई और सी सटीक फिशर परीक्षण; मात्रात्मक चर के लिए - एक-तरफ़ा एनोवा और; पी ** - एचडी, पीडी और सीकेडी समूहों के बीच अंतर के लिए सांख्यिकीय महत्व और गुणात्मक चर के लिए टीई सटीक फिशर परीक्षण मात्रात्मक चर के लिए एक-तरफ़ा एनोवा या; डीएम - मधुमेह अपवृक्कता; एचए - उच्च रक्तचाप; जीआईके - ग्लोमेरुलर इन्फ्लेमेशन किडनी; एडीपीकेडी - पॉलीसिस्टिक किडनी रोग जो ऑटोसोमल प्रमुख विरासत में मिला है; एनएस - कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं।

तालिका 2 हेमोडायलिसिस रोगियों की सामान्य विशेषताएं (बी - एचडी से पहले, ए - बाद में), गुर्दे के प्रत्यारोपण से पहले और बाद में रूढ़िवादी तरीके से इलाज किए गए पेरिटोनियल डायलिसिस (पीडी) (सीकेडी) (टीई बी और टीई ए) और अध्ययन में भाग लेने वाले नियंत्रण समूह (एनके) (औसत ± एसडी)

पी * - मात्रात्मक चर के लिए एचडी ए, एचडी बी, पीडी और सीकेडी समूहों, टीई और सी के बीच अंतर के लिए सांख्यिकीय महत्व - क्रुस्कल वालिस एनोवा, एक-तरफ़ा एनोवा या स्टूडेंट का टी-परीक्षण पी ** - क्रुस्कल वालिस एनोवा मात्रात्मक चर या एनोवा एक-तरफ़ा विश्लेषण के लिए एचडी ए, एचडी बी, पीडी और सीकेडी और टीई समूहों के बीच अंतर के लिए सांख्यिकीय महत्व केटी / वी - डायलिसिस इंडेक्स (समय टी पर क्लीयरेंस के द्वारा शुद्ध किया गया वॉल्यूम अंश वी) एनएस कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण संबंध नहीं पाए गए

सांख्यिकीय विश्लेषण वितरण का आकलन करने के लिए, केएस परीक्षण (कोलमोगोरोव-स्मिर्नोव) का इस्तेमाल किया गया था, जो कुछ चर (पीआरपी में एक्सडी और एक्सडीओ आइसोफॉर्म की गतिविधि) के मामले में मापदंडों का एक गैर-सामान्य वितरण दिखाता था। मात्रात्मक डेटा का विश्लेषण करने के लिए सटीक फिशर और ची-स्क्वायर परीक्षणों का इस्तेमाल किया गया था। यूनीवेरिएट सिस्टम के लिए स्टूडेंट के टी-टेस्ट और एनोवा विश्लेषण का उपयोग करते हुए, सामान्य वितरण वाले चर के मामले में संबद्ध (युग्मित) और असंबंधित (अनयुग्मित) चर के बीच अंतर का मूल्यांकन किया गया था। गैर-सामान्य वितरण वाले चर के मामले में, मापदंडों के बीच अंतर का मूल्यांकन करने के लिए क्रुस्कल-वालिस एनोवा विश्लेषण किया गया था