ज़ेरुम्बोन, जिंजिबर ऑफिसिनेल रोस्को का एक उष्णकटिबंधीय अदरक सेस्क्यूटरपीन, B16F10 कोशिकाओं भाग 1 में -MSH-प्रेरित मेलानोजेनेसिस को कम करता है

अमूर्त:ज़ेरुम्बोन (ZER), Zingiberaceae परिवार का एक सक्रिय घटक, कई जैविक गतिविधियों को प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है, जैसे कि विरोधी भड़काऊ, एंटी-एलर्जिक, एंटी-माइक्रोबियल और एंटी-कैंसर; हालांकि, एंटी-मेलानोजेनिक गुणों के लिए इसका अध्ययन नहीं किया गया है। वर्तमान अध्ययन में, हम प्रदर्शित करते हैं कि ZER और Zingiber ऑफिसिनल (ZO) अर्क हैं जो मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (-MSH) -उत्तेजित माउस मेलेनोजेनिक B16F10 कोशिकाओं में मेलेनिन संचय को महत्वपूर्ण रूप से क्षीण करते हैं। इसके अलावा, आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए जिसके द्वारा ZER मेलेनिन संचय को दबाता है, हमने मेलेनोजेनेसिस-जुड़े ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर, माइक्रोफथाल्मिया-जुड़े ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (MITF) की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया, और इसके लक्ष्य जीन, जैसे टायरोसिनेस, टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन 1 ( TYRP1), और tyrosinase-संबंधित प्रोटीन 2 (TYRP2), B16F10 कोशिकाओं में जो -MSH द्वारा उत्तेजित होते हैं। यहाँ, हमने पाया कि ZER -MSH उत्तेजना पर मेलानोजेनिक जीन की MITF-मध्यस्थता अभिव्यक्ति को रोकता है। इसके अतिरिक्त, ज़ेरुम्बोन और ZO के विभिन्न सांद्रणों के साथ उपचारित कोशिकाओं ने बढ़े हुए बाह्य संकेत-विनियमित किनेसेस 1 और 2 (ERK1 / 2) फॉस्फोराइलेशन को दिखाया, जो MITF के क्षरण तंत्र में शामिल हैं। U0126 का उपयोग करके ERK1 / 2 के फार्माकोलॉजिकल निषेध ने ZER के एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव को पर्याप्त रूप से उलट दिया, यह सुझाव देते हुए कि इसके एंटी-मेलेनोजेनिक गतिविधि के लिए ERK1 / 2 के फॉस्फोराइलेशन में वृद्धि आवश्यक है। एक साथ लेने पर, इन परिणामों से पता चलता है कि ZER और ZO अर्क को उनके एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव के कारण त्वचा को सफेद करने वाले सौंदर्य प्रसाधनों में सक्रिय सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

प्रासंगिक अध्ययनों के अनुसार, सिस्टंच एक सामान्य जड़ी-बूटी है जिसे "चमत्कारिक जड़ी-बूटी जो जीवन को लम्बा खींचती है" के रूप में जाना जाता है। इसका मुख्य अवयव हैसिस्टेनोसाइडजिसके विभिन्न प्रभाव होते हैं जैसेएंटीऑक्सिडेंट,सूजनरोधी, और प्रतिरक्षा समारोह को बढ़ावा देना। बीच का तंत्रधनियाऔरत्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वालाधनिया के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव में निहित हैग्लाइकोसाइड. मानव त्वचा में मेलेनिन द्वारा उत्प्रेरित टाइरोसिन के ऑक्सीकरण द्वारा निर्मित होता हैटायरोसिनेस, और ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया में ऑक्सीजन की भागीदारी की आवश्यकता होती है, इसलिए शरीर में ऑक्सीजन मुक्त कण मेलेनिन उत्पादन को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है। Cistanche में cistanoside होता है, जो एक एंटीऑक्सीडेंट है और इस प्रकार शरीर में मुक्त कणों के उत्पादन को कम कर सकता हैमेलेनिन उत्पादन को रोकना.

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कीवर्ड:ज़ेरुम्बोन; जिंजिबर ऑफिसिनल रोसको; मेलानोजेनेसिस; MITF; ईआरके1/2

1 परिचय

मेलानोजेनेसिस, एपिडर्मल मेलानोसाइट्स द्वारा मेलेनिन का उत्पादन, -मेलानोसाइट उत्तेजक हार्मोन (-एमएसएच) द्वारा प्रेरित होता है जो पराबैंगनी (यूवी) विकिरण [1,2] के संपर्क में आने पर केराटिनोसाइट्स से स्रावित होता है। स्टेम सेल फैक्टर (SCF) एक अन्य मेलानोजेनिक कारक है जो प्रसवोत्तर त्वचीय मेलानोजेनेसिस [3] को बनाए रखने के लिए मेलानोसाइट माइग्रेशन, प्रसार और भेदभाव को सख्ती से नियंत्रित करता है। माइक्रोफथाल्मिया से जुड़ा ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (MITF), जो एक मेलेनोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर है, cAMP-PKA-CREB (साइक्लिक एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट-प्रोटीन किनेज A-cAMP रिस्पॉन्स एलिमेंट बाइंडिंग प्रोटीन) के जरिए सक्रिय होता है। (MC1R) एपिडर्मल मेलानोसाइट्स [4] के साइटोप्लाज्मिक झिल्ली में। कई रसायन, जैसे कि फोरस्कोलिन और IBMX (3-आइसोबुटिल-1-मिथाइलक्सैन्थिन), cAMP-PKA-CREB सिग्नलिंग पाथवे को सक्रिय करने के लिए जाने जाते हैं, जिससे मेलानोजेनेसिस [5] का समावेश होता है। कई अध्ययनों से पता चला है कि बाह्य-विनियमित किनेसेस 1 और 2 (ERK1/2) की सक्रियता को बनाए रखा है, जो ऑन्कोजेनेसिस के आणविक तंत्र में शामिल है, Ser73 पर MITF फॉस्फोराइलेशन को बढ़ावा देता है और ubiquitin- निर्भर प्रोटियोलिसिस के माध्यम से इसके बाद की गिरावट [6,7 ]। दरअसल, U0126, एक चयनात्मक ERK1/2 पाथवे अवरोधक, MITF अभिव्यक्ति और टायरोसिनेस गतिविधि को बढ़ाने के लिए सूचित किया गया है, जिससे मेलेनिन उत्पादन होता है [6]। स्थिर और सक्रिय MITF मेलेनोजेनिक जीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, जैसे टायरोसिनेस, टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन 1 (TYRP1), और टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन 2 (TYRP2)। टाइरोसिन का 3, 4- डाइहाइड्रॉक्सीफेनिलएलानिन (L-DOPA) में परिवर्तन, जो मेलेनोजेनेसिस का प्रारंभिक चरण है, टाइरोसिनेस द्वारा उत्प्रेरित होता है। टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन (टीआरपी) आगे ऑक्सीकरण और टॉटोमेराइजेशन प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित करते हैं [8]। मेलेनिन संश्लेषण के बाद, यूवी विकिरण [2] से कोशिकाओं की रक्षा के लिए परिपक्व मेलेनिन को एपिडर्मल मेलानोसाइट्स से बेसल केराटिनोसाइट्स के साइटोप्लाज्म में ले जाया जाता है।

असामान्य रूप से बढ़ा हुआ मेलानोजेनेसिस कई प्रकार के त्वचा विकारों का कारण बनता है, जैसे कि त्वचा कैंसर, क्लोस्मा और झाईयां [4]; इस प्रकार, छोटे अणु या प्राकृतिक उत्पाद जो या तो टाइरोसिनेस की उत्प्रेरक गतिविधि को लक्षित करते हैं, या मेलानोजेनेसिस में सिग्नलिंग पाथवे के नियामकों को लक्षित करते हैं, जिसमें ERK1 / 2, या मेलानोजेनिक जीन के MITF-मध्यस्थता प्रतिलेखन शामिल हैं, को कॉस्मेटिक में उपयोग किए जाने वाले सक्रिय अवयवों के रूप में पहचाना गया है। उद्योग। कई छोटे अणु, जैसे कि कोजिक एसिड, अर्बुटिन और नियासिनामाइड, व्यापक रूप से उनके एंटी-मेलेनोजेनिक गतिविधियों के कारण कॉस्मेटिक सामग्री के रूप में उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, रिपोर्टों से पता चला है कि कोजिक एसिड अपनी जीनोटॉक्सिक गतिविधि [9] के कारण साइटोटॉक्सिसिटी, डर्माटाइटिस, त्वचा कैंसर और हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा सहित कई दुष्प्रभाव पैदा करता है। हालांकि अर्बुटिन, जिसे बेरबेरी के पौधे से अलग किया गया था, का उपयोग हाइपरपिग्मेंटेशन डिसऑर्डर के इलाज के लिए किया गया है, हाल ही में, कॉस्मेटिक सामग्री के रूप में इसका उपयोग इसके कई दुष्प्रभावों के कारण प्रतिबंधित कर दिया गया है [9]। यह बताया गया है कि नियासिनमाइड में एंटी-मेलानोजेनिक गतिविधि होती है और यह गतिविधि मेलेनोसाइट्स से आसपास के केराटिनोसाइट्स [10] में मेलानोसोम हस्तांतरण को रोककर की जाती है। इस प्रकार, यह आमतौर पर कॉस्मेटिक उद्योग में त्वचा को सफेद करने वाले यौगिक के रूप में उपयोग किया जाता है। स्थापित त्वचा को गोरा करने वाले एजेंटों की सीमाओं को दूर करने के लिए जिनके कई दुष्प्रभाव हैं, प्राकृतिक स्रोतों से प्राप्त सुरक्षित त्वचा को गोरा करने वाले अवयवों को विकसित करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, -थुजाप्लिसिन, लिंडेरेनोलाइड बी, 4-ब्यूटाइल रेसोरिसिनॉल, और प्लंबेगिन को उनके टाइरोसिनेज निरोधात्मक प्रभाव [4,11] के कारण एंटी-मेलेनोजेनिक यौगिकों के रूप में पहचाना गया है। मेलानोजेनेसिस पाथवे [11] में सिग्नलिंग इंटरमीडिएट्स को संशोधित करके नोबिलेटिन, विथफेरिन ए, सीसमोल और चेटोसिन एंटी-मेलेनोजेनिक गुण प्रदर्शित करते हैं।

ज़ेरुम्बोन (ZER) एक प्राकृतिक उत्पाद है, जो Zingiberacee परिवार से संबंधित पौधों के वाष्पशील आवश्यक तेलों से अलग होता है, जैसे Zingiber zerumbet Smith और Zingiber officinal Roscoe [12]। कई अध्ययनों से पता चला है कि ZER में रोगाणुरोधी, एंटीऑक्सिडेंट, एंटी-डायबिटिक, एंटीकैंसर, एंटी-इंफ्लेमेटरी, एंटीएलर्जेनिक और एंटी-एंजियोजेनिक गतिविधियों [12] सहित जैविक गतिविधियों की एक विस्तृत श्रृंखला है। दिलचस्प बात यह है कि ZER को त्वचा केराटिनोसाइट्स में पराबैंगनी A (UVA) से प्रेरित ऑक्सीडेटिव क्षति के खिलाफ एक सुरक्षात्मक प्रभाव दिखाने के लिए दिखाया गया है, इसकी वजह परमाणु-कारक-E {{8} की सक्रियता के माध्यम से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) को परिमार्जन करने की क्षमता है। }संबंधित कारक -2 (Nrf2) [1,13]। इससे पता चलता है कि ZER का उपयोग त्वचा देखभाल सौंदर्य प्रसाधनों में एक कार्यात्मक योज्य के रूप में किया जा सकता है। हालाँकि, ZER क्रिया के एंटी-मेलेनोजेनिक गुणों के विस्तृत तंत्र का अध्ययन किया जाना बाकी है।

वर्तमान अध्ययन में, -MSH-उत्तेजित मेलानोजेनेसिस पर ZER और Zingiber ऑफिसिनल (ZO) के निरोधात्मक प्रभाव और उनके अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन किया गया। यहाँ, हम दिखाते हैं कि ZER ERK1 / 2 के फॉस्फोराइलेशन को बढ़ाकर और मेलेनोजेनिक जीन की MITF-मध्यस्थता अभिव्यक्ति को रोककर -MSH प्रेरित मेलानोजेनेसिस को महत्वपूर्ण रूप से दबा देता है।

2. परिणाम

2.1। Zerumbone (ZER) B16F10 माउस मेलानोमा कोशिकाओं में -MSH प्रेरित मेलानोजेनेसिस को दबा देता है

ज़ेरुम्बोन (ZER) के एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हमने शुरुआत में B16F1 0 और HaCaT कोशिकाओं दोनों में इसकी साइटोटोक्सिसिटी का मूल्यांकन किया। ZER की रासायनिक संरचना चित्र 1ए में दिखाई गई है। यह देखा गया कि 20 माइक्रोन से ऊपर की सांद्रता पर ZER ने एक मजबूत साइटोटोक्सिक प्रभाव प्रदर्शित किया, जबकि 20 माइक्रोन से नीचे वाले लोगों पर, ZER ने दोनों सेल लाइनों(चित्रा 1B)में साइटोटोक्सिसिटी नहीं दिखाई। इसके बाद, हमने B16F10 कोशिकाओं में ZER ऑन -मेलानोसाइट्स उत्तेजक हार्मोन (-MSH) -इन्फेक्टेड मेलेनिन संचय और स्राव के निरोधात्मक प्रभावों की जांच की। ZER को मेलेनिन के -MSH- प्रेरित इंट्रासेल्युलर संचय और सुसंस्कृत माध्यम में इसके स्राव को दृढ़ता से दबाने के लिए दिखाया गया था (चित्र 1C, D)। इसके अलावा, हमने पाया कि ZER मेलानोजेनेसिस को 1 एमएम अर्बुटिन या 0.2 एमएम कोजिक एसिड की तुलना में अधिक प्रभावी ढंग से क्षीण करता है, जो त्वचा को सफेद करने वाले सौंदर्य प्रसाधनों के प्रसिद्ध सक्रिय घटक हैं (चित्र 1डी)। यह स्पष्ट करने के लिए कि क्या ZER मानव कोशिकाओं में मेलेनोजेनेसिस को दबाने के लिए पर्याप्त है, हमने मेलेनिन-उत्पादक G361 मानव मेलेनोमा कोशिकाओं का उपयोग किया। जैसा कि चित्र 1E में दिखाया गया है, ZER स्टेम सेल फैक्टर (SCF)-प्रेरित अतिरिक्त- और इंट्रासेल्युलर मेलेनिन सामग्री को काफी कम कर देता है। ये परिणाम मेलानोजेनिक माउस B16F10 और मानव G361 कोशिकाओं में ZER की मेलानोजेनिक गतिविधि की पुष्टि करते हैं।

2.2। ज़ेरुम्बोन मेलानोजेनेसिस ट्रांसक्रिप्शन फ़ैक्टर, MITF की जीन अभिव्यक्ति और G361 मानव मेलेनोमा कोशिकाओं में इसके लक्ष्य जीन को दबा देता है 

एंडोटिलिन -1 और एससीएफ सिग्नलिंग को मानव मेलानोसाइट्स और मेलेनोमा [3,14-16] के कई उपप्रकारों में मेलानोजेनेसिस में आवश्यक भूमिका निभाने के लिए सूचित किया गया है। इस अध्ययन में, हमने पाया कि ZER माउस B16F10 और मानव G361 मेलेनोमा कोशिकाओं (चित्र 1) में मेलानोजेनिक उत्तेजनाओं, -MSH और SCF पर मेलानोजेनेसिस को दबा देता है।

इस प्रकार, हमने G361 मानव मेलेनोमा कोशिकाओं में SCF उत्तेजना पर मेलानोजेनेसिस-संबंधित जीन और प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तरों में परिवर्तन को मापा। हमने पाया कि ZER SCF- प्रेरित MITF और tyrosinase प्रोटीन अभिव्यक्ति को क्रमशः SCF उत्तेजना के बाद 2-4 घंटे और 24-48 घंटे में क्षीण कर देता है (चित्र 2ए)। इसके अलावा, मेलानोजेनेसिस-संबंधित जीन की जीन अभिव्यक्ति, जैसे कि एमआईटीएफ, टायरोसिनेस, और टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन 1 (टीवाईआरपी1) को ज़ेर-उपचारित जी361 कोशिकाओं (चित्रा 2बी, सी) में दबा दिया गया था। इन परिणामों ने एससीएफ उत्तेजना पर मेलानोजेनेसिस-संबंधित जीन की अभिव्यक्ति के लिए चरम समय का खुलासा किया; अधिकतम MITF mRNA प्रेरण 1-2 h के भीतर देखा गया था, और tyrosinase और TYRP1 के mRNA स्तर SCF उत्तेजना के बाद अपने अधिकतम 24-48 h तक पहुँचने के लिए देखे गए थे।

2.3। Zerumbone माउस B16F10 कोशिकाओं में मेलेनोजेनिक जीन और एंजाइम अभिव्यक्ति को दबा देता है

आणविक तंत्र की जांच करने के लिए जिसके द्वारा ZER मेलानोजेनेसिस को दबाता है, हमने मेलानोजेनेसिस ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर, MITF और इसके लक्ष्य जीन जैसे टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन 1 (TYRP1), टायरोसिनेस और टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन 2 (TYRP2) की जीन अभिव्यक्ति को मापा। ZER की अनुपस्थिति या उपस्थिति में। चूंकि SCF और -MSH उत्तेजना पर मेलेनोजेनेसिस-संबंधित जीन अभिव्यक्ति के लिए चरम समय मानव G361 (चित्र 2) और माउस B16F10 मेलानोमा कोशिकाओं [4] के लिए जाना जाता है, क्रमशः, हमने आगे MITF, टायरोसिनेस, TYRP1, और TYRP2 की अभिव्यक्ति को मापा। ZER में -MSH के साथ ऊष्मायन के 2 घंटे या 48 घंटे के बाद माउस B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं का इलाज किया। चित्र 3क दर्शाता है कि ZER B16F10 कोशिकाओं में -MSH-प्रेरित MITF, TYRP1, TYRP2, और tyrosinase अभिव्यक्ति को क्षीण करने के लिए पर्याप्त है। इसी तरह, ZER उपचार पर MITF, tyrosinase और TYRP2 प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में कमी आई थी। सीआरईबी का प्रोटीन किनेज ए (पीकेए)-मध्यस्थ फास्फारिलीकरण -एमएसएच उत्तेजना [4] पर ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर एमआईटीएफ को बढ़ाने वाला एक प्रमुख सिग्नलिंग मार्ग है। इस प्रकार, यहाँ, हमने विश्लेषण किया कि क्या ZER द्वारा CREB के फॉस्फोराइलेशन में कमी MITF के दमन को मध्यस्थ कर सकती है। हमने पाया कि -MSH-प्रेरित CREB फॉस्फोराइलेशन ZER उपचार से प्रभावित नहीं था, यह सुझाव देते हुए कि ZER दमन -MSH- प्रेरित MITF अभिव्यक्ति PKA-CREB सिग्नलिंग पाथवे अक्ष (चित्र 3B) से स्वतंत्र है। क्योंकि टाइरोसिनेज़ एक दर-सीमित एंजाइम है, जो मेलेनिन संश्लेषण [2,4,11] को नियंत्रित करता है, हमने आगे इंट्रासेल्युलर टायरोसिनेस प्रोटीन के स्तर और अर्बुटिन, कोजिक एसिड और ZER उपचार पर इसकी एंजाइमिक गतिविधि का विश्लेषण किया। चित्रा 3सी से पता चलता है कि ZER पर्याप्त रूप से B16F10 कोशिकाओं में -MSH-प्रेरित टायरोसिनेस प्रोटीन स्तर को कम करता है। इसके अलावा, चित्रा 3डी से पता चलता है कि 10 माइक्रोन ज़ेर अधिक प्रभावी ढंग से एल-डोपा ऑक्सीकरण को टाइरोसिनेस इनहिबिटर, अर्बुटिन और कोजिक एसिड से दबा देता है, यह सुझाव देता है कि टायरोसिनेस की एंजाइमैटिक गतिविधि के माध्यम से डोपाक्विनोन में एल-डोपा के ऑक्सीकरण को ज़ेर-उपचारित कोशिकाओं में दबा दिया जाता है। . इन परिणामों से पता चलता है कि ZER MITF की जीन अभिव्यक्ति, एक मेलेनोजेनेसिस-जुड़े प्रतिलेखन कारक और इसके लक्ष्य जीन को दबाकर -MSH-मध्यस्थता मेलेनोजेनेसिस को क्षीण करता है।

2.4। ज़ेरुम्बोन का एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव ERK1/2 के फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से होता है

विकास कारकों या मेलानोजेनिक उत्तेजनाओं द्वारा प्रोटीन किनेज बी (AKT) और बाह्य संकेत-नियंत्रित किनेसेस (ERK1 / 2) की सक्रियता को MITF और इसके लक्ष्य जीन [11] की घटी हुई अभिव्यक्ति के माध्यम से मेलानोजेनेसिस को दबाने के लिए जाना जाता है। ERK1/2 सिग्नलिंग पाथवे के जवाब में Ser73 और Ser409 पर MITF का फास्फोराइलेशन इसके प्रोटियासम-डिपेंडेंट डिग्रेडेशन [17,18] को बढ़ावा देता है। इसलिए, हमने जांच की कि क्या ZER B16F10 माउस और G361 मानव मेलेनोमा कोशिकाओं में ERK1 / 2 फॉस्फोराइलेशन को नियंत्रित करता है। ERK1/2 (p-ERK1/2) का बढ़ा हुआ फॉस्फोराइलेशन, लेकिन कुल ERK1/2 (T-ERK1/2) नहीं, एक समय और खुराक पर निर्भर तरीके से ZER उपचार पर देखा गया था (चित्र 4A, B)। दिलचस्प बात यह है कि माउस B16F10 और मानव G361 मेलानोमा कोशिकाओं (चित्र 4A) में ERK1/2 के फास्फारिलीकरण को 10-30 मिनट और 1-2 घंटे के बाद ZER उपचार के भीतर तेजी से बढ़ा हुआ देखा गया। हालाँकि, ZER उपचार पर AKT और MEK का फॉस्फोराइलेशन नहीं देखा गया था, यह सुझाव देते हुए कि ZER- प्रेरित ERK1 / 2 फॉस्फोराइलेशन MITF (चित्र 4B) को दबा सकता है। क्योंकि ERK1/2 फॉस्फोराइलेशन MITF [17,18] के फॉस्फोराइलेशन और प्रोटीसोमल डिग्रेडेशन को बढ़ावा देता है, हमने जांच की कि क्या प्रोटियासम इनहिबिटर ZER द्वारा MITF की कमी को रोकता है। ZER द्वारा MITF का दमन MG132 की उपस्थिति में नहीं देखा गया था, यह पुष्टि करते हुए कि ZER ने MITF अभिव्यक्ति को प्रोटीसोमल डिग्रेडेशन (चित्र 4C) के माध्यम से घटाया है। इसके बाद, हमने जांच की कि क्या ZER Ser73 पर MITF को फास्फोराइलेट करता है, जो ERK1 / 2 का लक्ष्य अवशेष है। फॉस्फोराइलेटेड MITF का पता लगाने के लिए, कोशिकाओं को -MSH और MG132 के संपर्क में लाया गया। यहाँ, हमने पाया कि -MSH और MG132 (चित्र 4D) की उपस्थिति में ZER द्वारा फॉस्फोराइलेटेड MITF (Ser73) में काफी वृद्धि हुई थी। U0126, एक चयनात्मक मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज (MAPK) अवरोधक [19], ZER- प्रेरित MITF फॉस्फोराइलेशन (चित्र 4D) को समाप्त कर दिया। इसके अलावा, पूरे सेल lysates (WCL) में कुल MITF प्रोटीन का स्तर ZER और U0126 द्वारा MG132 (चित्र 4D) की उपस्थिति में नहीं बदला गया था। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि ERK1/2-मध्यस्थ MITF (Ser73) फॉस्फोराइलेशन और प्रोटीसोमल गिरावट MITF के ZER-मध्यस्थता दमन में एक महत्वपूर्ण तंत्र है। इसके अलावा, चित्रा 4E से पता चलता है कि U0126 ने ZER- उपचारित कोशिकाओं में MITF प्रोटीन के स्तर को काफी हद तक बहाल कर दिया है। लगातार, ZER द्वारा घटी हुई इंट्रासेल्युलर मेलेनिन सामग्री को U0126 द्वारा लगभग 40 प्रतिशत (चित्र 4F) तक बहाल किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि ZER के एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव के लिए ERK1 / 2 की सक्रियता आवश्यक है।

2.5। Zingiber Officinale (ZO) के अर्क का मेलानोजेनिक प्रभाव

ZER एक फाइटोकेमिकल है जो Zingiberaceae परिवार की कई पौधों की प्रजातियों से प्राप्त होता है, जैसे Zingiber zerumbet और Zingiber officinal [12]। इस प्रकार, हमने शुरू में B16F10 और HaCaT कोशिकाओं में ZO अर्क की अनुपस्थिति या उपस्थिति में सेल व्यवहार्यता को मापा। चित्रा 5ए से पता चलता है कि ज़ेडओ निकालने के उपचार से सेल व्यवहार्यता में बदलाव नहीं किया गया था। हमने आगे Zingiber ऑफिसिनल (ZO) एक्सट्रैक्ट के एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभावों का विश्लेषण किया। क्योंकि सक्रिय ERK1/2 सिग्नलिंग मार्ग (आंकड़े 2 और 3) के माध्यम से MITF और उसके लक्ष्य मेलानोजेनिक जीन की अभिव्यक्ति ZER द्वारा कम की गई थी, हमने जाँच की कि क्या ZO एक्सट्रैक्ट -MSH- प्रेरित MITF और B16F10 कोशिकाओं में इसके लक्ष्य मेलानोजेनिक प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबा देता है। ZER के एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव के समान, -MSH-प्रेरित MITF, टायरोसिनेस, और TYRP2 को खुराक पर निर्भर तरीके (चित्र 5B) में ZO अर्क द्वारा काफी कम किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि ZO एक्सट्रैक्ट-ट्रीटेड सेल्स (चित्र 5B) में ERK1/2 फॉस्फोराइलेशन को भी बढ़ाया गया था। एमआईटीएफ और इसके लक्षित जीनों की अभिव्यक्ति, जैसे टायरोसिनेज, टीवाईआरपी1, और टीवाईआरपी2, 5 माइक्रोग्राम/जेडएल जेडओ एक्सट्रैक्ट ट्रीटमेंट (चित्र 5सी) पर काफी कम हो गई थी। इसके अलावा, दोनों बाह्य और इंट्रासेल्युलर मेलेनिन सामग्री को 5 μg/μL ZO निकालने के उपचार (चित्रा 5D) पर लगभग 40 प्रतिशत तक कम कर दिया गया था। इसके अलावा, घटी हुई tyrosinase गतिविधि उन कोशिकाओं में देखी गई जिनका ZO अर्क (चित्र 5E) के साथ उपचार किया गया था। इन परिणामों से पता चलता है कि Zingiber ऑफिसिनल (ZO) एक्सट्रैक्ट MITF-मध्यस्थता मेलेनोजेनिक जीन अभिव्यक्ति को क्षीण करके मेलानोजेनेसिस को दबा देता है।

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