लैकेस-मीडिएटर सिस्टम मेलेनिन पार्ट 1 के डीकोलराइजेशन के लिए एक व्हाइटनिंग एजेंट के रूप में एक प्राकृतिक मध्यस्थ का उपयोग कर रहा है

अमूर्त: इस अध्ययन में, एक प्राकृतिक मध्यस्थ का उपयोग कर एक लैककेस-मध्यस्थ प्रणाली (एलएमएस) को मेलेनिन विरंजन के लिए एक सफ़ेद एजेंट के रूप में विकसित किया गया था। सिंथेटिक मध्यस्थों को बदलने के लिए सात प्राकृतिक मध्यस्थों का उपयोग किया गया था और लैकेस की कम रेडॉक्स क्षमता और लैकेस की सक्रिय साइट पर मेलेनिन की सीमित पहुंच को सफलतापूर्वक दूर किया गया था। ट्रामेट्स वर्सिकोलर (लैकटी) और मायसेलियोफथोरा थर्मोफिला (लैकएम) से लैकेस की मेलेनिन डीकोलराइजेशन गतिविधि को एसीटोसाइरिंगोन, सिरिंगाल्डिहाइड, और एसिटोवैनिलोन सहित प्राकृतिक मध्यस्थों का उपयोग करके काफी बढ़ाया गया था, जो कम साइटोटोक्सिसिटी दिखाते थे। प्राकृतिक मध्यस्थों के मेथॉक्सी और कीटोन समूह मेलेनिन विरंजकता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। मेलेनिन विरंजन के लिए lacT और lacM की विशिष्टता स्थिरांक क्रमशः 247 और 334 तक बढ़ाए गए थे, जब एसीटोसिरिंगोन को मध्यस्थ के रूप में इस्तेमाल किया गया था। लेस और एसिटोसिरिंगोन का उपयोग करने वाला एलएमएस सेल्युलोज हाइड्रोजेल फिल्म में मौजूद मेलेनिन को भी रंगहीन कर सकता है, जो त्वचा की स्थिति की नकल करता है। इसके अलावा, एलएमएस न केवल टाइरोसिन के ऑक्सीकरण द्वारा तैयार किए गए सिंथेटिक यूमेलानिन एनालॉग्स बल्कि मेलेनोमा कोशिकाओं द्वारा उत्पादित प्राकृतिक मेलेनिन को भी रंगहीन कर सकता है।

प्रासंगिक अध्ययनों के अनुसार,धनियाएक आम जड़ी बूटी है जिसे "चमत्कारिक जड़ी बूटी जो जीवन को लम्बा खींचती है" के रूप में जाना जाता है। इसका मुख्य अवयव हैसिस्टेनोसाइडजिसके विभिन्न प्रभाव होते हैं जैसेएंटीऑक्सिडेंट, सूजनरोधी, औरप्रतिरक्षा समारोह को बढ़ावा देना. सिस्टंच और के बीच का तंत्रत्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वालाधनिया के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव में निहित हैग्लाइकोसाइड. मेलेनिनमानव त्वचा में उत्प्रेरित टाइरोसिन के ऑक्सीकरण द्वारा निर्मित होता हैटायरोसिनेस, और ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया में ऑक्सीजन की भागीदारी की आवश्यकता होती है, इसलिए शरीर में ऑक्सीजन मुक्त कण मेलेनिन उत्पादन को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है। सिस्टैंच में शामिल हैसिस्टेनोसाइड, जो एक एंटीऑक्सीडेंट है और इस प्रकार शरीर में मुक्त कणों के उत्पादन को कम कर सकता हैमेलेनिन उत्पादन को रोकना।

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1 परिचय

लैकेसेस (EC 1.10.3.2, बेंजीनियोल: डाइऑक्सीजन ऑक्सीडोरडक्टेस) मल्टीकॉपर प्रोटीन हैं जो आणविक ऑक्सीजन [1,2] की कमी से एक कट्टरपंथी-उत्प्रेरित प्रतिक्रिया तंत्र के माध्यम से विभिन्न फेनोलिक और गैर-फेनोलिक यौगिकों के ऑक्सीकरण को उत्प्रेरित करते हैं। बायोडिग्रेडेशन प्रक्रियाओं के लिए बायोकेटलिस्ट के रूप में लैककेस का उपयोग किया गया है, जैसे कि रंगों का बायोरेमेडिएशन [3,4], फार्मास्यूटिकल्स [5,6], हर्बिसाइड्स [7], और डिग्निफिकेशन [8-10]। लैकेस का उपयोग डाई अग्रदूतों और कार्बनिक यौगिकों [11] के पोलीमराइज़ेशन को उत्प्रेरित करने के लिए भी किया गया है। विशेष रूप से, उनके आकर्षक गुण, जैसे कम सब्सट्रेट विशिष्टता, अंतिम इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के रूप में ऑक्सीजन का उपयोग, उप-उत्पाद के रूप में पानी की पीढ़ी, और पेरोक्साइड की कोई मांग (या कोई उत्पादन नहीं) उन्हें जैव प्रौद्योगिकी और में दिलचस्प बनाते हैं। पर्यावरण क्षेत्र [1,11,12]।

सक्रिय स्थल पर चार कॉपर आयन लैकेस की उत्प्रेरक गतिविधि में शामिल हैं। "ब्लू" कॉपर (T1 साइट) सब्सट्रेट को ऑक्सीडाइज़ करता है, और आणविक ऑक्सीजन [1,12,13] को कम करने के लिए ट्रिन्यूक्लियर कॉपर क्लस्टर (T2/T3) T1 साइट से इलेक्ट्रॉन प्राप्त करता है। विशेष रूप से, T1 साइट Cu की रेडॉक्स क्षमता को लैककेस [14] की उत्प्रेरक क्षमता का निर्धारण करने में एक प्रमुख कारक माना जाता है। लिग्निनोलिटिक पेरोक्सीडेस (1 वी से अधिक) जैसे मैंगनीज पेरोक्सीडेज और लिग्निन पेरोक्सीडेज की तुलना में लैककेस में अपेक्षाकृत कम रेडॉक्स क्षमता (0.4-0.8 वी) होती है। लैककेस 1.3 V [13,14] से ऊपर की रेडॉक्स क्षमता वाले गैर-फेनोलिक सबस्ट्रेट्स को सीधे ऑक्सीकृत नहीं कर सकता है। इसलिए, लैकेस की सीमाओं को दूर करने के लिए, छोटे आणविक यौगिकों, जैसे 2, 20 - एज़िनोबिस (3- एथिलबेनज़थियाज़ोलिन -6- सल्फोनेट) (एबीटीएस), { {24}}हाइड्रॉक्सी बेंज़ोट्रियाज़ोल (HOBt), वायल्यूरिक एसिड (VLA), N-हाइड्रॉक्सी थैलिमाइड (HPI), N-हाइड्रॉक्सी एसीटेनिलाइड (NHA), और TEMPO, जो रेडॉक्स मध्यस्थों के रूप में कार्य करते हैं, का सुझाव दिया गया है [15-17]।

ये मध्यस्थ विभिन्न ऑक्सीकरण मार्गों के माध्यम से भारी यौगिकों के ऑक्सीकरण की अनुमति देते हैं। लैकेस-एबीटीएस सिस्टम एक इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर (ईटी) तंत्र के माध्यम से एक धनायनित एबीटीएस रेडिकल उत्पन्न करके सबस्ट्रेट्स को ऑक्सीकरण करता है। एचओबीटी, वीएलए, एचपीआई, या एनएचए के साथ एलएमएस हाइड्रोजन परमाणु हस्तांतरण (एचएटी) तंत्र [1,12,17] के माध्यम से नाइट्रॉक्सिल रेडिकल का उत्पादन करते हैं। इसके अलावा, टेम्पो और इसके एनालॉग्स जैसे मध्यस्थ ऑक्सोअमोनियम आयन [1,12,18] उत्पन्न करने के लिए आयनिक मार्गों के माध्यम से प्रतिक्रिया करते हैं। इन मध्यस्थों का उपयोग विभिन्न अनुप्रयोगों में यौगिकों की एक विस्तृत श्रृंखला को ऑक्सीकृत कर सकता है, जैसे डाई डिग्रेडेशन [3,4], ड्रग डिग्रेडेशन [5,6], और लिग्निन डिग्रेडेशन [8-10]। फिर भी, औद्योगिक क्षेत्रों में सिंथेटिक मध्यस्थों के अनुप्रयोग उनकी संभावित विषाक्तता, उच्च लागत और एंजाइम निष्क्रियता प्रभाव कारण सीमित हैं। हाल ही में, प्राकृतिक मध्यस्थों के रूप में लिग्निन-व्युत्पन्न फेनोलिक अणु (जैसे, सिरिंगाल्डिहाइड, एसिटोसिरिंगोन, वैनिलिन, एसिटोवैनिलोन, मिथाइल वैनिलेट, फेरुलिक एसिड, सिनैपिक एसिड, पी-कौमारिक एसिड, आदि) का सिंथेटिक मध्यस्थों को बदलने के लिए अध्ययन किया गया है [1,12] . प्राकृतिक मध्यस्थों के लाभ कम लागत और कम विषाक्तता हैं क्योंकि वे प्राकृतिक और नवीकरणीय स्रोतों से प्राप्त होते हैं [19]।

मेलानिन मेलानोसाइट्स द्वारा टाइरोसिन के ऑक्सीडेटिव पोलीमराइजेशन के माध्यम से मेलानोजेनेसिस द्वारा उत्पादित प्राकृतिक पिगमेंट का एक समूह है। प्राकृतिक मेलेनिन को यूमेलानिन, फेमोलेनिन, सभी मेलेनिन, फेमोलेनिन और न्यूरोमेलानिन [20] की पांच श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है। हाल ही में, मेलेनिन या मेलेनिन अग्रदूतों का उपयोग करने वाले विभिन्न चिकित्सा और विद्युत रासायनिक अनुप्रयोगों का अध्ययन [20,21] किया गया है। मानव त्वचा का रंग ज्यादातर मेलेनिन की उपस्थिति से निर्धारित होता है। कॉस्मेटिक उद्योग में, त्वचा को गोरा करने वाले एजेंटों के विकास के लिए एंजाइमों का उपयोग करके मेलेनिन का प्रत्यक्ष अपचयन प्रस्तावित किया गया है। मेलेनिन को रंगहीन करने के लिए कई पेरोक्सीडेस का अध्ययन किया गया है। वू एट अल। दिखाया गया है कि पी। क्राइसोस्पोरियम [22] से लिग्निन पेरोक्सीडेज द्वारा सिंथेटिक मेलेनिन को सीधे रंगहीन किया जा सकता है। केनेको और मोहोरसीक समूहों ने कवक (स्पोरोट्रिचम प्रुइनोज और फ्लेबिया रेडियाटा) [23,24] से पृथक मैंगनीज पेरोक्सीडेज द्वारा मेलेनिन के एंजाइमैटिक डीकोलराइजेशन की सूचना दी। किम एट अल। ने बताया कि मैंगनीज पेरोक्सीडेज, लिग्निन पेरोक्सीडेज और लैकेस युक्त क्रूड एंजाइम मिश्रण में मेलेनिन अपचयन गतिविधि दिखाई देती है [25]। जब पेरोक्सीडेस मेलेनिन को विरंजित करता है, तो उन्हें एक सहकारक के रूप में हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) की आवश्यकता होती है जो त्वचा को परेशान कर सकता है। इस प्रकार, H2O2 के उपयोग को कम करने के लिए, ग्लूकोज ऑक्सीडेज या लैकेस को एंजाइम संयोजन प्रणाली [26,27] में पेश किया गया था। लैककेस हाइड्रोजन पेरोक्साइड के उपयोग के बिना मेलेनिन को रंगहीन कर सकता है। खम्मुआंग और सरनथिमा ने बताया कि लेंटिनस पॉलीकार्पस लेव के लैकेस ने मध्यस्थों के रूप में एबीटीएस, वैनिलिन और वैनिलिक एसिड का उपयोग करके मेलेनिन विरंजीकरण गतिविधि दिखाई [28]।

2। सामग्री और विधि

2.1। सामग्री

2.2। एलएमएस द्वारा मेलानिन रंगहीनता

संतृप्त मेलेनिन समाधान (1.4 मिलीग्राम/एमएल) 3 मिलीग्राम सिंथेटिक मेलेनिन के 1.3 एमएल 10 एमएम NaOH में घोलकर तैयार किया गया था। अघुलित मेलेनिन को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 85 0 0 आरपीएम पर समाधान को सेंट्रीफ्यूज किया गया था, और सतह पर तैरनेवाला 0 के साथ पतला था। 1 एम साइट्रिक एसिड फॉस्फेट बफर (पीएच 3, 4, 5, 5.5, 6, या 7) और एलएमएस के लिए एक सब्सट्रेट समाधान के रूप में उपयोग किया जाता है। सब्सट्रेट समाधान में मेलेनिन की एकाग्रता 63 μg/mL थी और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिकल रूप से 475 एनएम पर पुष्टि की गई थी। 0.8 एमएल मेलेनिन सब्सट्रेट घोल को 0.1 एमएल मध्यस्थ घोल (0-1 मिमी) के साथ 1.5 एमएल एपपॉर्फ ट्यूब में मिलाया गया था। मेलेनिन डीकोलराइजेशन रिएक्शन को मेलेनिन के मिश्रण में 0.1 एमएल लैकेस सॉल्यूशन (15.8 माइक्रोग्राम (0.6 यू) एलएसीटी या 19.2 माइक्रोग्राम (1.8 यू) एलसीएम) जोड़कर शुरू किया गया था और 120 आरपीएम पर मिलाते हुए पानी के स्नान में 25 डिग्री सेल्सियस पर मध्यस्थ बनाया गया था। . प्रतिक्रिया के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण को अपकेंद्रित किया गया था, और सतह पर तैरनेवाला का अवशोषण 475 एनएम पर मापा गया था। विरंजकता उपज (प्रतिशत) की गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके की गई थी:

रंगहीनता (प्रतिशत ) {{0}} (ए0 - एट)/ए0 × 100, (1)

2.3। एलएमएस द्वारा मेलेनिन रंगहीनता का काइनेटिक अध्ययन

2.4। प्राकृतिक मध्यस्थों की साइटोटोक्सिसिटी

B16F10 मेलेनोमा सेल लाइन (कोरिया सेल लाइन बैंक, सियोल, कोरिया) का उपयोग LMS के लिए प्राकृतिक मध्यस्थों की साइटोटोक्सिसिटी निर्धारित करने के लिए किया गया था। मध्यस्थों [29] की साइटोटोक्सिसिटी को मापने के लिए एक तटस्थ लाल (एनआर) परख का प्रदर्शन किया गया था। NR लाइव सेल लाइसोसोम की व्यवहार्यता को मापता है। 3 × 104 कोशिकाओं की सघनता वाली मेलेनोमा कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में भेजा गया। 24 घंटे की खेती के बाद, कोशिकाओं को प्राकृतिक मध्यस्थों (1, 2, 5, 10, 22 और 46 मिमी) के साथ इलाज किया गया। 2 दिनों के लिए अतिरिक्त खेती के बाद, कोशिकाओं को डीएमईएम में भंग 50 माइक्रोग्राम / एमएल एनआर समाधान के साथ इलाज किया गया और 3 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। चूषण के माध्यम से सतह पर तैरने वाले को हटाने के बाद, रंग निष्कर्षण के लिए एक एनआर डिसोर्ब समाधान (1 प्रतिशत ग्लेशियल एसिटिक एसिड, 49 प्रतिशत इथेनॉल, और 50 प्रतिशत आसुत जल) का उपयोग किया गया था। निष्कर्षण प्रक्रिया के बाद, अवशोषण में परिवर्तन 540 एनएम पर मापा गया था।

2.5। मेलेनिन/सेलुलोज हाइड्रोजेल फिल्म की तैयारी और रंगहीनता

मेलेनिन/सेल्युलोज फिल्म के लिए एलएमएस की रंगहीनता गतिविधि को मापने के लिए, तैयार हाइड्रोजेल फिल्म को 1 × 2 सेमी शीट में काटा गया था। हाइड्रोजेल फिल्म को 0.1 एम साइट्रिक एसिड फॉस्फेट बफर (पीएच 5.5) के 4 एमएल में डुबोया गया था; बाद में, 0.5 एमएल 1 एमएम एसीटोसिरिंगोन और 0.5 एमएल लेस सॉल्यूशन (2.5 यू) को बफर में जोड़ा गया। डी-कलराइजेशन रिएक्शन को पानी के स्नान में दोपहर 120 बजे और 3 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ किया गया। प्रतिक्रिया के बाद, फिल्म को आसुत जल से धोया गया और यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 400-800 एनएम की सीमा में स्पेक्ट्रा में परिवर्तन को मापने के लिए क्युवेट के अंदरूनी हिस्से से जोड़ा गया। एलसीएम या मध्यस्थों के बिना नियंत्रण प्रतिक्रियाएं भी उन्हीं परिस्थितियों में आयोजित की गईं। प्रतिक्रिया स्थितियों के तहत फिल्म से मेलेनिन की रिहाई या मेलेनिन / सेलूलोज़ फिल्म के रंग परिवर्तन का पता नहीं चला। इसके अलावा, एलएमएस द्वारा रंग हटाने की प्रतिक्रिया के बाद मेलेनिन/सेलुलोज फिल्म के रंग मापदंडों (एल *, ए * और बी * मान) में परिवर्तन भी एक वर्णमापक (कोनिका एमआई एनओएलटीए, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके दर्ज किया गया था। ∆L (मीट्रिक हल्कापन अंतर), ∆E (कुल रंग अंतर), YI (पीलापन सूचकांक), और WI (सफेदी सूचकांक) मान निम्नलिखित समीकरण [30-32] का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे:

2.6। प्राकृतिक मेलेनिन की तैयारी

प्राकृतिक मेलेनिन B16F10 मेलानोमा कोशिकाओं से प्राप्त किया गया था। मेलेनिन का उत्पादन करने के लिए कोशिकाओं को अल्फा-मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन के साथ इलाज किया गया था। ऊष्मायन के 4 दिनों के बाद, ट्रिप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करके कोशिकाओं को पकड़ लिया गया और 10 मिनट के लिए ध्वनिबद्ध किया गया। सतह पर तैरनेवाला 10 मिनट के लिए 8000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्राप्त किया गया था और फिर 6 एम एचसीएल का उपयोग करके पीएच 1.5 में समायोजित किया गया था। अवशिष्ट प्रोटीन अंशों को हाइड्रोलाइज करने के लिए 4 घंटे के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर घोल को उबाला गया। प्राकृतिक मेलेनिन युक्त घोल को एसीटोन से धोया गया, उसके बाद क्लोरोफॉर्म और इथेनॉल के साथ, और फिर कोशिकाओं, मीडिया घटकों और प्रोटीन अंशों [33,34] जैसे अवशेषों को खत्म करने के लिए विआयनीकृत पानी से धोया गया। सभी धुलाई प्रक्रियाओं को दो बार से अधिक किया गया। अंत में, प्राकृतिक मेलेनिन को फ्रीज-सुखाने से प्राप्त किया गया और एलएमएस के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया गया।

3) परिणाम और चर्चा

3.1। एलएमएस द्वारा मेलानिन रंगहीनता पर मध्यस्थों का प्रभाव

एलएमएस द्वारा मेलेनिन डीकोलराइजेशन रिएक्शन पर विभिन्न मध्यस्थों के प्रभाव की जांच टी. वर्सिकलर (लैकटी) और एम. थर्मोफिला (लैकएम) (चित्र 1) से दो लैकेस का उपयोग करके की गई थी।जब मेलेनिन विरंजकता के लिए मध्यस्थ के बिना एलएसीटी का उपयोग किया गया था, तो प्रतिक्रिया के 5 घंटे के बाद विरंजकता उपज केवल 1 प्रतिशत थी। जब HOBt को lacT के लिए एक मध्यस्थ के रूप में इस्तेमाल किया गया था, तो प्रतिक्रिया के 5 घंटे के बाद विरंजकता उपज को थोड़ा बढ़ाकर 2 प्रतिशत कर दिया गया था। फेनोलिक या गैर-फेनोलिक यौगिकों के लैकेस-उत्प्रेरित ऑक्सीकरण में HOBt, ABTS, VLA, और TEMPO जैसे विभिन्न सिंथेटिक मध्यस्थों के उपयोग ने प्रतिक्रिया दर [10,15] में काफी वृद्धि की। जब लैकेस की सक्रिय साइट में लक्ष्य यौगिकों की पहुंच उनके स्टेरिक बाधा से सीमित होती है, तो लैकेस द्वारा गठित मध्यस्थ रेडिकल्स इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण या हाइड्रोजन परमाणु हस्तांतरण तंत्र [12] द्वारा लक्षित यौगिकों को कुशलतापूर्वक ऑक्सीकरण कर सकते हैं। HOBt अपनी उच्च रेडॉक्स क्षमता (1.1 V) [6] के कारण LMS में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले सिंथेटिक मध्यस्थों में से एक है। हालांकि, HOBt इसकी संभावित सेल विषाक्तता और लैकेस को निष्क्रिय करने की क्षमता के कारण एक अच्छा कॉस्मेटिक घटक नहीं है। इस प्रकार, हमने एलएमएस द्वारा मेलेनिन डीकोलराइजेशन प्रतिक्रिया के लिए सात प्राकृतिक मध्यस्थों, एसिटोसिरिंगोन, सिरिंगल्डिहाइड, पी-कौमारिक एसिड, वैनिलिन, वैनिलिक एसिड, वैनिलिल अल्कोहल और एसिटोवैनिलोन का चयन किया। दिलचस्प बात यह है कि सभी प्राकृतिक मध्यस्थ कमी से मेलेनिन विरंजन के लिए HOBt की तुलना में अधिक कुशल मध्यस्थ के रूप में कार्य करते हैं। जब एसीटोसिरिंगोन, सीरिंजल्डिहाइड, और पी-कौमारिक एसिड का उपयोग किया गया था, तो 5 घंटे की प्रतिक्रिया के बाद रंग हटाने की क्षमता क्रमशः 28 प्रतिशत, 22 प्रतिशत और 18 प्रतिशत थी। ये परिणाम एलएमएस द्वारा मेलेनिन विरंजीकरण प्रतिक्रिया के लिए प्राकृतिक मध्यस्थों की उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं। LMS में मध्यस्थों को लैकेस द्वारा मध्यस्थ रेडिकल्स में ऑक्सीकृत किया जाता है, और मध्यस्थ रेडिकल्स मेलेनिन के ऑक्सीकरण और विघटन को प्रेरित करते हैं। जब एक पर्याप्त प्रतिक्रिया समय के दौरान मेलेनिन विरंजकता के लिए मध्यस्थ के बिना कमी का उपयोग किया गया था, जो संतुलन स्थिति तक पहुंच सकता था, प्रतिक्रिया के 24 घंटे के बाद विघटन की उपज 7 प्रतिशत थी। वैनिलिक एसिड को छोड़कर प्राकृतिक मध्यस्थ, 24 घंटे की प्रतिक्रिया के बाद LACT द्वारा मेलेनिन विरंजन के लिए HOBt की तुलना में अधिक कुशल मध्यस्थ के रूप में कार्य करते हैं। एक मध्यस्थ के रूप में वैनिलिक एसिड का उपयोग करके 24 घंटे की प्रतिक्रिया के बाद विरंजकता की उपज प्रतिक्रिया के 5 घंटे के बाद की तुलना में कम थी। यह वैनिलिक एसिड के ऑक्सीकृत कट्टरपंथी रूप की कम स्थिरता के कारण हो सकता है। जब एसिटोसिरिंगोन, सीरिंजल्डिहाइड, और एसिटोवैनिलोन का उपयोग किया गया था, तो 24 घंटे की प्रतिक्रिया के बाद डीकलराइजेशन यील्ड क्रमशः 34 प्रतिशत, 30 प्रतिशत और 31 प्रतिशत थी। पी-कौमरिक एसिड एसिटोवैनिलोन की तुलना में प्रारंभिक प्रतिक्रिया दर को बढ़ाने में अधिक कुशल था, जबकि एसिटोवैनिलोन ने पी-कौमरिक एसिड की तुलना में संतुलन अवस्था में उच्च विरंजकता उपज को प्रेरित किया।

lacM का उपयोग करके LMS द्वारा विरंजक प्रतिक्रिया पर मध्यस्थ का प्रभाव भी LMS द्वारा lacT का उपयोग करके प्राप्त किए गए प्रभाव के समान था। जब मेलेनिन विरंजकता के लिए एक मध्यस्थ के बिना फीता का उपयोग किया गया था, तो प्रतिक्रिया के 5 घंटे के बाद विरंजीकरण उपज केवल 2 प्रतिशत थी। एलसीएम के मध्यस्थ के रूप में एचओबीटी ने 5 घंटे की प्रतिक्रिया के दौरान विरंजकता उपज में वृद्धि नहीं की। पी-कौमारिक एसिड और वैनिलीन को छोड़कर सभी प्राकृतिक मध्यस्थों ने एलसीएम द्वारा मेलेनिन विरंजकता के कुशल मध्यस्थों के रूप में कार्य किया। जब एसिटोसिरिंगोन और सीरिंजल्डिहाइड का उपयोग किया गया था, तो 5 घंटे की प्रतिक्रिया के बाद रंग हटाने की क्षमता क्रमशः 25 प्रतिशत और 22 प्रतिशत थी। पी-कौमारिक एसिड और वैनिलिन का उपयोग प्रत्येक के लिए कुशल मध्यस्थ के रूप में किया गया था, लेकिन वे एलएमएस में लेस का उपयोग करके विरंजकता दर को कुशलता से नहीं बढ़ा सके। यह p-coumaric एसिड और वैनिलिन के लिए lacM की निचली सब्सट्रेट विशिष्टता के कारण हो सकता है। पी-कौमरिक एसिड और वैनिलिन के साथ lacM की प्रतिक्रिया के 24 घंटे के बाद डीकोलराइजेशन की पैदावार lacT द्वारा प्राप्त की गई समान थी। यह इंगित करता है कि पी-कौमारिक एसिड और वैनिलिन के ऑक्सीकृत रूप मेलेनिन को कुशलता से विरंजित कर सकते हैं, हालांकि lacM द्वारा उनकी ऑक्सीकरण दर lacT की तुलना में बहुत कम थी। जब एक मध्यस्थ के बिना एलसीएम का उपयोग पर्याप्त प्रतिक्रिया समय के दौरान मेलेनिन विरंजन के लिए किया गया था, तो 24 घंटे की प्रतिक्रिया के बाद विघटन की उपज 5 प्रतिशत थी। वैनिलिक एसिड को छोड़कर, प्राकृतिक मध्यस्थ भी प्रतिक्रिया के 24 घंटे के बाद lacM द्वारा मेलेनिन विरंजन के लिए HOBt की तुलना में अधिक कुशल मध्यस्थ के रूप में कार्य करते हैं। जब एसीटोसाइरिंगोन, सिरिंगल्डिहाइड, और एसिटोवैनिलोन को एलसीएम के लिए मध्यस्थ के रूप में इस्तेमाल किया गया था, तो 24 घंटे की प्रतिक्रिया के बाद रंग हटाने की क्षमता क्रमश: 34 प्रतिशत, 28 प्रतिशत और 31 प्रतिशत थी। जब वैनिलिक एसिड को lacT और lacM दोनों के लिए एक मध्यस्थ के रूप में इस्तेमाल किया गया था, तो इसने सबसे कम विरंजकता उपज दिखाई। यह वैनिलिक एसिड के ऑक्सीकृत कट्टरपंथी रूप की कम स्थिरता के कारण हो सकता है। खम्मुआंग और सरनथिमा ने बताया कि लेंटिनस पॉलीकार्पस [28] से लैकेस का उपयोग करके मेलेनिन विरंजन के लिए वैनिलिन और वैनिलिक एसिड मध्यस्थ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, उन्होंने एसिटोसिरिंगोन की तुलना में मेलेनिन के लिए बहुत कम विरंजीकरण गतिविधि दिखाई जब उन्हें लैक्टी और लेस के लिए मध्यस्थ के रूप में इस्तेमाल किया गया।

इन परिणामों से संकेत मिलता है कि प्राकृतिक मध्यस्थ HOBt की तुलना में LMS द्वारा मेलेनिन विरंजन के लिए अधिक कुशल हैं। HOBt को इसकी उच्च रेडॉक्स क्षमता और HOBt [5] के N OH समूह की उत्प्रेरक भूमिका के कारण लैकेस के लिए एक कुशल सिंथेटिक मध्यस्थ माना गया है। लक्ष्य सबस्ट्रेट्स को ऑक्सीडाइज़ करने के लिए मध्यस्थों की दक्षता स्थिर रेडिकल बनाने की क्षमता के साथ-साथ मध्यस्थों की रेडॉक्स क्षमता [19,35] के बजाय भारी अल्काइल प्रतिस्थापन के कारण होने वाली स्टेरिक बाधा पर अत्यधिक निर्भर है। HOBt के ऑक्सीकृत मध्यवर्ती की निम्न स्थिरता को चक्रीय वोल्टामेट्री [6] के माध्यम से निर्धारित किया गया है। इसलिए, HOBt का उपयोग करके LMS द्वारा कम विरंजीकरण उपज लैकेस की प्रतिक्रिया स्थितियों के तहत HOBt की कम स्थिरता के कारण हो सकती है। हालांकि सीरिंजल्डिहाइड की रेडॉक्स क्षमता एचओबीटी की तुलना में कम थी, लेकिन सीरिंजल्डिहाइड ने एचओबीटी [6] की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक स्थिरता दिखाई।

जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, इस कार्य में उपयोग किए जाने वाले प्राकृतिक मध्यस्थों में बेंजीन रिंग [12,19] पर विभिन्न पदों पर विभिन्न पदार्थ (जैसे, हाइड्रॉक्सिल, मेथॉक्सी, कार्बोक्सिल, कीटोन, या एल्डिहाइड) होते हैं। दो मेथॉक्सी समूहों (एसीटोसिरिंगोन और सीरिंजल्डिहाइड) वाले मध्यस्थों ने एक मेथॉक्सी समूह वाले मध्यस्थों की तुलना में उच्च विरंजीकरण दर दिखाई। बिना मेथॉक्सी समूह वाले पी-कौमारिक एसिड द्वारा प्राप्त विरंजीकरण दर लैकेस के प्रकार पर निर्भर थी। एलएसीटी के साथ पी-कौमारिक एसिड ने एक मेथॉक्सी समूह वाले लोगों की तुलना में उच्च विरंजीकरण दर दिखाई, जबकि एलसीएम के साथ पी-कौमारिक एसिड ने 5 एच प्रतिक्रिया में सबसे कम विरंजीकरण दर दिखाई। फिलैट एट अल। प्राकृतिक मध्यस्थों [36] के साथ फंगल लैकेस द्वारा फ्लेक्सोग्राफिक स्याही के विरंजन के लिए भी इसी तरह के परिणाम दिखाए गए। रिंग में दो मेथॉक्सी प्रतिस्थापन के साथ फेनोलिक प्राकृतिक मध्यस्थ (एसीटोसिरिंगोन, मिथाइल सिरिंज, और सिरिंगल्डिहाइड) बिना किसी मेथॉक्सी समूह वाले पी-कौमारिक एसिड की तुलना में तेजी से लैकेस द्वारा ऑक्सीकृत किया गया था। यह इंगित करता है कि पी-कौमारिक एसिड की पार्श्व श्रृंखला के दोहरे बंधन की तुलना में मेथॉक्सी समूह इलेक्ट्रॉन दाताओं के रूप में अधिक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। जब एक मेथॉक्सी समूह वाले मध्यस्थों की तुलना की गई, तो निम्नलिखित क्रम में विरंजकता की उपज में वृद्धि हुई: एसिटोवैनिलोन> वैनिलिन> वैनिलिल अल्कोहल> वैनिलिक एसिड। एसिटोवैनिलोन, जिसमें एक कीटोन समूह होता है, ने एल्डिहाइड, हाइड्रॉक्सिल और कार्बोक्सिल समूहों के साथ मध्यस्थों की तुलना में उच्च विरंजीकरण दर और उपज दिखाई। एल्डिहाइड समूह वाले सीरिंजल्डिहाइड की तुलना में कीटोन समूह के साथ एसिटोसाइरिंगोन ने रंग हटाने की उच्च दर और उपज भी दिखाई।

निम्नलिखित प्रयोगों में, एसीटोसाइरिंगोन, सिरिंगल्डेहाइड, और एसिटोवैनिलोन, जो उच्च मेलेनिन रंग हटाने की क्षमता दिखाते हैं, को एलएमएस के लिए मध्यस्थ के रूप में मेलेनिन को रंगहीन करने के लिए चुना गया था। समय के साथ एलएमएस द्वारा विरंजीकरण प्रतिक्रिया पर मध्यस्थ के प्रभाव की जांच की गई (चित्र S1)। एसीटोसिरिंगोन, सिरिंगल्डिहाइड, और एसिटोवैनिलोन के साथ एलएसीटी का उपयोग करने वाली डीकोलराइजेशन प्रतिक्रिया क्रमशः 1 घंटे की प्रतिक्रिया के बाद 21 प्रतिशत, 18 प्रतिशत और 1 प्रतिशत डीकोलराइजेशन पैदावार देती है। एसीटोसिरिंगोन और सीरिंजल्डिहाइड के साथ एलसीएम का उपयोग करने वाली डीकलराइजेशन रिएक्शन के परिणामस्वरूप क्रमशः 1 घंटे की प्रतिक्रिया के बाद 19 प्रतिशत और 18 प्रतिशत डीकोलराइजेशन उपज होती है। जब एक ही मध्यस्थ का उपयोग किया गया था, तो दोनों लैककेस ने समान प्रतिक्रिया प्रोफ़ाइल दिखाई। प्रारंभिक प्रतिक्रिया के दौरान एसिटोसिरिंगोन और सीरिंजल्डिहाइड ने विरंजकता दर में काफी वृद्धि की। इन परिणामों से पता चलता है कि डाइमेथॉक्सी समूहों वाले एसिटोसाइरिंगोन और सीरिंजल्डिहाइड एक मेथॉक्सी समूह वाले एसिटोवैनिलोन की तुलना में एलएमएस द्वारा विरंजकता की प्रारंभिक दर को बढ़ाने में अधिक कुशल थे। फिलैट एट अल। यह भी बताया कि मध्यस्थों की रिंग संरचनाओं में मेथॉक्सी समूह सबस्ट्रेट्स [36] के ऑक्सीकरण के लिए त्वरक के रूप में कार्य करते हैं। दूसरी ओर, एसिटोवैनिलोन द्वारा 24 घंटे की प्रतिक्रिया के बाद रंग हटाने की उपज सीरिंजल्डिहाइड के समान थी, हालांकि एसीटोवैनिलोन ने प्रतिक्रिया दर में मामूली वृद्धि की।

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