सिनामोमम ऑस्मोफ्लोयम कनेहिरा से एक नया प्राकृतिक एंटीऑक्सीडेंट बायोमटेरियल मेलानोजेनेसिस को दबाता है और डीएनए क्षति से बचाता है

संपर्क: ali.ma@wecistanche.com

युंग-शु हो 1, जेन-यी वू 1,* और ची-यू चांग 2

सार:Cinnamomoum ​​osmophloeum Kanehira (COK) ताइवान में एक स्वदेशी वृक्ष प्रजाति है। रासायनिक रचनाएँ,एंटीऑक्सिडेंटगतिविधि, मशरूमटायरोसिनेसनिषेध, मेलेनिन संश्लेषण दमन, और भाप आसवन द्वारा सीओके के पत्तों से हाइड्रोसोल के डीएनए क्षति के खिलाफ सुरक्षा की जांच की गई। हमने 1,1-डाइफिनाइल-2-पिक्रीलहाइड्राजाइल रेडिकल मैला ढोने, मेटल आयन चेलेटिंग, कम करने की शक्ति, और ट्रोलॉक्स समकक्ष एंटीऑक्सीडेंट क्षमता (टीईएसी) का प्रदर्शन किया और कुल फेनोलिक सामग्री और एंटीऑक्सिडेंट गतिविधियों के बीच सहसंबंधों को निर्धारित किया। निष्कर्षों से पता चला है कि COK हाइड्रोसोल के एंटी-ऑक्सीडेटिव गुण उनके फिनोल सामग्री के साथ निकटता से संबंधित हैं। इसके अतिरिक्त, हाइड्रोसोल के प्रमुख घटकों, सिनामाल्डिहाइड और बेंजाल्डिहाइड में मोनोफेनोलस और डिफेनोलेज़ गतिविधियों दोनों के खिलाफ खुराक पर निर्भर एंटी-टायरोसिनेज प्रभाव था। जीसी-एमएस विश्लेषण से पता चला कि हाइड्रोसोल के प्रमुख जैव सक्रिय घटक ट्रांस-सिनामाल्डिहाइड (87.7 प्रतिशत) थे। बेंजाल्डिहाइड (7.0 प्रतिशत), और सिनामाइल एसीटेट (5.3 प्रतिशत)। इसके अलावा, हमने पाया कि बेंजाल्डिहाइड की उपस्थिति के साथ हाइड्रोसोल शुद्ध सिनामाल्डिहाइड की तुलना में अधिक शक्तिशाली है, और बढ़ाता हैटायरोसिनेसहाइड्रोसोल की निरोधात्मक गतिविधि। काइनेटिक विश्लेषणों में, लाइनविवर-बर्क प्लॉट्स और रिप्लॉट्स ने दिखाया कि COK हाइड्रोसोल एक मिश्रित प्रकार का अवरोधक है। इसके अतिरिक्त, हमने पाया कि सीओके हाइड्रोसोल की बहुत कम खुराक ने माइक्रोफथाल्मिया से जुड़े ट्रांसक्रिप्शन कारक के मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन-प्रेरित संश्लेषण को दबा दिया, जिससे बी 16- एफ 10 मेलेनोमा कोशिकाओं में मेलेनिन संश्लेषण में कमी आई। इन परिणामों ने प्रदर्शित किया कि भाप आसवन का उपयोग करके सीओके के पत्तों से हाइड्रोसोल का उत्पादन एक सुरक्षित और प्रभावोत्पादक स्रोत प्रदान कर सकता है।त्वचा-सफेदकॉस्मेटिक और फार्मास्युटिकल अनुप्रयोगों के लिए एजेंट, के साथएंटीऑक्सिडेंट, एंटी-टायरोसिनेज, एंटी-मेलानोजेनेसिस, और डीएनएप्रोटेक्टिव गतिविधियां।

कीवर्ड: एंटीऑक्सिडेंटगतिविधि; सिनामोमम ऑस्मोफ्लोयम; हाइड्रोसोल;टायरोसिनेसनिरोधात्मक गतिविधि;सफेद; डीएनए क्षति सुरक्षात्मक प्रभाव

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1 परिचय

मानव त्वचा विकार जैसे कि लेंटिगो, उम्र के धब्बे, मेलास्मा और घातक मेलानोमा को मेलेनिन के गठन और संचय से जोड़ा गया है [1]। टायरोसिनेस और मेलानोजेनेसिस का निषेध त्वचा संबंधी विकारों और हाइपरपिग्मेंटेशन सिंड्रोम को ठीक कर सकता है। इसके अतिरिक्त, त्वचा को गोरा करने वाले एजेंटों और कॉस्मीस्यूटिकल उत्पादों के लिए वैश्विक बाजार का हाल ही में विस्तार हुआ है क्योंकि कई गहरे रंग के व्यक्तियों द्वारा हल्के त्वचा के रंग को प्राथमिकता दी जाती है [2]। इसलिए, प्रभावी और सुरक्षितटायरोसिनेसऔर मेलेनिन संश्लेषण अवरोधकों को रंजकता बीमारी और अन्य मेलेनिन से संबंधित मानव स्वास्थ्य मुद्दों की रोकथाम के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है [3,4]। इसके अतिरिक्त, पर्यावरण विषाक्त पदार्थ मनुष्यों के लिए विभिन्न ऑक्सीडेटिव तनाव का कारण बनते हैं, और प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों या प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) [5] का उत्पादन कर सकते हैं। अत्यधिक मुक्त कण और आरओएस भड़काऊ सिग्नलिंग मार्ग से जुड़े होते हैं, जो अंततः सेलुलर क्षति, उम्र बढ़ने, तंत्रिका संबंधी विकार, मधुमेह, एथेरोस्क्लेरोसिस, सूजन, हृदय रोग, कैंसर और मेलेनोजेनेसिस [6,7] का कारण बनते हैं। कई अध्ययनों से पता चलता है किएंटीऑक्सीडेंटफ्री रेडिकल मैला ढोने वाले या रोस मैला ढोने वालों [7,8] के रूप में कार्य करके ऑक्सीडेटिव दबाव के नुकसान को रोक सकते हैं। इसके अलावा, आरओएस पीढ़ी के अवरोधक और आरओएस मैला ढोने वाले दोनों मेलेनिन वर्णक उत्पादन को कम कर सकते हैं [9]। विशेष रूप से,टायरोसिनेसएक प्रमुख एंजाइम है जो मेलेनिन संश्लेषण प्रक्रियाओं [10] के दौरान पहले दो चरणों में दर-सीमित कदम को उत्प्रेरित करता है, और टायरोसिनेस का डाउन-रेगुलेशन त्वचा की बीमारी की रोकथाम और उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है।त्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वालाएजेंट [11]। इसलिए, प्राकृतिक एंटीऑक्सिडेंट का विकास जो अवांछित त्वचा हाइपरपिग्मेंटेशन की रोकथाम या उपचार के लिए प्रभावी रूप से टायरोसिनेस को रोकता है और डीएनए क्षति से सुरक्षा आवश्यक है।

Cinnamomum osmophloeum Kanehira (COK) एक ताइवानी स्वदेशी दालचीनी प्रजाति है जिसका चीनी हर्बल दवा के रूप में कई उपयोग किया जाता है। COK आवश्यक तेलों के सक्रिय यौगिक औषधीय जीवाणुरोधी [12] के रूप में उत्कृष्ट क्षमता दिखाते हैं। हालांकि COK के पत्तों के अल्कोहल के अर्क के पिछले अध्ययनों ने एंटी-टाइरोसिनेस गतिविधियों का प्रदर्शन किया, इनमें से लगभग सभी अध्ययन COK से इथेनॉल के अर्क या आवश्यक तेलों पर केंद्रित थे। इसके अलावा, किसी भी मात्रात्मक और व्यवस्थित अध्ययन ने रिपोर्ट नहीं किया हैएंटीऑक्सिडेंटगुण,टायरोसिनेसनिरोधात्मक गतिविधियाँ और COK के पत्तों के जल अर्क (हाइड्रोसोल) द्वारा मेलेनिन संश्लेषण का दमन। इसलिए, यह अध्ययन B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव और मेलानोजेनेसिस पर COK हाइड्रोसोल के प्रभावों की जांच करने और डीएनए क्षति से बचाने के लिए आयोजित किया गया था। यह अध्ययन रासायनिक संरचना की पहली विस्तृत रिपोर्ट है औरएंटीऑक्सिडेंट, टायरोसिनेस निषेध, मेलानोजेनेसिस दमनकारी, और डीएनए COK के पत्तों से हाइड्रोसोल की सुरक्षात्मक गतिविधियों को नुकसान पहुंचाता है।

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1. रसायन और एंटीबॉडी

मशरूमटायरोसिनेस, ब्यूटाइलेटेड हाइड्रॉक्सीटोल्यूइन (बीएचटी), -टोकोफेरोल, 6-हाइड्रॉक्सी-2,5,7,8-टेट्रामेथिलक्रोमैन-2-कार्बोक्जिलिक एसिड (ट्रोलॉक्स), ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (टीसीए), गैलिक एसिड, पोटैशियमफेरिकैनाइड, फेरिक क्लोराइड, फेरस क्लोराइड, फेरोज़ीन, 1,1-डिपेनिल-2-पिक्रिलहाइड्राज़िल (DPPH),2,20-एज़िनो-बीआईएस-3-एथिलबेन्ज़थियाज़ोलिन{{14} } सल्फोनिक एसिड (ABTS), फोलिन-सियोकाल्टू अभिकर्मक, L-टायरोसिन, और L-3,4-डाइहाइड्रॉक्सीफेनिलएलनिन (L-DOPA) मर्क कंपनी (डार्मस्टाड, जर्मनी) से प्राप्त किए गए थे। सभी रसायन। और अध्ययन में प्रयुक्त सॉल्वैंट्स विश्लेषणात्मक ग्रेड या उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमैटोग्राफी के थे। माइक्रोफथाल्मिया से जुड़े ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (एमआईटीएफ) और -एक्टिन के खिलाफ एंटीबॉडी क्रमशः सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (डेनवर, एमए, यूएसए) और सिग्मा केमिकल कंपनी (सेंट लुइस, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे।

2.2. हाइड्रोसोल तैयारी: भाप आसवन का उपयोग करके सीओके के पत्तों से निष्कर्षण

ताइवान में एक 13-साल पुराने COK के पेड़ (नंबर 186, योंगपिंग रोड, झोंग्लिआओ टाउनशिप, नान्टो काउंटी, ताइवान) की पत्तियों को हवा में सुखाया गया। स्टेनलेस स्टील की चक्की का उपयोग करके, पत्तियों को फिर एक महीन पाउडर (<10 जाल="" से="" कम)="" में="" पीस="" लिया="" गया="" और="" फिर="" कमरे="" के="" तापमान="" पर="" संग्रहीत="" किया="" गया।="" इसके="" बाद,="" 4="" घंटे="" के="" लिए="" भाप="" आसवन="" का="" उपयोग="" करके="" 3.5="" किलोग्राम="" सूखे="" cok="" पत्ती="" के="" पाउडर="" को="" निकाला="" गया।="" यह="" प्रक्रिया="" चार="" बार="" दोहराई="" गई।="" एक="" निर्वात="" का="" उपयोग="" करके,="" अर्क="" को="" फ़िल्टर="" किया="" गया="" और="" फिर,="" एक="" रोटरी="" बाष्पीकरण="" का="" उपयोग="" करके,="" सूखा="" अर्क="" प्राप्त="" किया="" गया="" (चित्र="" 1)।="" अंतिम="" वजन="" प्राप्त="" करने="" के="" लिए="" अर्क="" को="" अंत="" में="" वाष्पित="" कर="" दिया="" गया="">

2.3. गैस क्रोमैटोग्राफी/मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी/एमएस) हाइड्रोसोल का विश्लेषण

थर्मो-जीसी/एमएस उपकरण जिसमें थर्मो वैक्सएमएस क्रॉस-लिंक्ड 5 प्रतिशत फिनाइल- 95 प्रतिशत मिथाइलपॉलीसिलोक्सेन केशिका स्तंभ (60 मीटर × 0.25 मिमी आईडी, फिल्म मोटाई {{1 0}}.25 माइक्रोन) का उपयोग वाहक गैस के रूप में 1.0 एमएल/मिनट की निरंतर प्रवाह दर पर विथेलियम के रूप में किया गया था। स्तंभ को इंजेक्शन के बाद 5 मिनट के लिए 200 C पर बनाए रखा गया था और फिर 5 C / मिनट से 260 C तक गर्म किया गया था। शुद्ध आवश्यक तेल (1.0 एमएल) को 1:100 के विभाजन अनुपात के साथ इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्टर, ट्रांसफर लाइन और आयन स्रोत का तापमान क्रमशः 250 C, 250 C, और 200 C था। 70 eVionisation ऊर्जा और 60 µA आयनीकरण धारा पर इलेक्ट्रॉन प्रभाव मोड में MS का पता लगाया गया; उपकरण को 50-350 एमयू की सीमा में पूर्ण-स्कैन अधिग्रहण मोड में संचालित किया गया था। समान शर्तों के तहत इंजेक्ट किए गए प्रामाणिक संदर्भ मानकों के साथ क्रोमैटोग्राफिक चोटियों के प्रतिधारण समय और सूचकांकों की तुलना करके यौगिकों की पहचान की गई थी। एमएस विखंडन पैटर्न की तुलना शुद्ध यौगिकों के साथ की गई थी, और मासस्पेक्ट्रम डेटाबेस को राष्ट्रीय मानक और प्रौद्योगिकी संस्थान (एनआईएसटी) एमएसस्पेक्ट्रल डेटाबेस [13] का उपयोग करके खोजा गया था।

2.4.कुल फेनोलिक सामग्री

अर्क की कुल फेनोलिक सामग्री (टीपीसी) को पहले वर्णित [14] फोलिन-सियोकाल्टु एसेज़ का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। संक्षेप में, हाइड्रोसोल के नमूने (100 µ एल) को 100 µ एल एलिकोट्स ऑफ फोलिन-सियोकाल्टू रिएजेंट ({3}} गुना कमजोर पड़ने) और सोडियम कार्बोनेट के 10 µ एल एलिकोट्स (10 प्रतिशत, डब्ल्यू/वी) के साथ मिश्रित किया गया था। 30 मिनट के लिए भंडारण के बाद, अवशोषण 735 एनएम मापा गया था। टीपीसी को ताजा सामग्री के प्रति 100 ग्राम मिलीग्राम में गैलिक एसिड समकक्ष (जीएई) के रूप में व्यक्त किया जाता है।

2.5. डीपीपीएच फ्री रेडिकल स्कैवेंजिंग एसेज़

जैसा कि पहले बताया गया है, डीपीपीएच परख का उपयोग करते हुए, हाइड्रोसोल की कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधियों को संशोधनों के साथ [15] निर्धारित किया गया था। संक्षेप में, हाइड्रोसोल नमूनों के अलग-अलग तनुकरण (तीन प्रतियों में 75 µL) को DPPH (0.02 g/100 mL) के 15 0 μL विभाज्य में जोड़ा गया और 30 मिनट के बाद 517 एनएम पर अवशोषण मापा गया। बीएचटी का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण (0.5 मिलीग्राम / एमएल इथेनॉल) के रूप में किया गया था। कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधियों को निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके निषेध अनुपात (प्रतिशत) के रूप में व्यक्त किया गया था:

अवरोध अनुपात (प्रतिशत)=[1 - (ए/बी)] × 100 प्रतिशत

जहां ए हाइड्रोसोल नमूने का अवशोषण है और बी रिक्त स्थान का अवशोषण है।

2.6. भिन्नात्मक निरोधात्मक सांद्रता

आंशिक निरोधात्मक सांद्रता (FIC) की परख को पहले [16] रूप में वर्णित किया गया था, संशोधनों के साथ। संक्षेप में, FeSO4 (20 µL; 2 mM) को हाइड्रोसोलसम्पल्स (200 µ l) के विभिन्न तनुकरणों के साथ मिश्रित किया गया था। फेरोज़ीन (40 µ एल; 5 मिमी) जोड़ने के बाद, प्रतिक्रियाओं को 10 मिनट के लिए आगे बढ़ने दिया गया और फिर अवशोषण को 562 एनएम पर मापा गया। इसके अलावा, 0.5 मिलीग्राम / एमएल एथिलीन डायमाइन टेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। फेरोज़ीन-Fe2 प्लस कॉम्प्लेक्सफॉर्मेशन के प्रतिशत निषेध की गणना निम्न सूत्र का उपयोग करके की गई थी:

धातु केलेटिंग प्रभाव (प्रतिशत)=[1 - (ए/बी)] × 100 प्रतिशत

जहां ए हाइड्रोसोल नमूने का अवशोषण है और बी रिक्त स्थान का अवशोषण है।

2.7. शक्ति परख को कम करना

COK हाइड्रोसोल की कम करने की शक्ति Fe3 प्लस toFe2 प्लस की कमी की निगरानी के द्वारा निर्धारित की गई थी जैसा कि पहले [17] में वर्णित है, संशोधनों के साथ। संक्षेप में, हाइड्रोसोल के 50 μL कमजोर पड़ने, 50-μLaliquots of फॉस्फेट बफर (पीएच 6.6, 200 मिमी) और 50- पोटेशियम फेरिकैनाइड के μL एलिकोट्स (1 प्रतिशत, w/v) थे जोड़ा गया। 20 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद, टीसीए के 50 डिग्री सेल्सियस (10 प्रतिशत, डब्ल्यू/वी) जोड़ा गया था; और मिश्रण को 3 मिनट के लिए 9,000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। अंत में, 50 µ एल सतह पर तैरनेवाला 50 µ एल आसुत जल और 50 µ एल फेरिक क्लोराइड पानी में (0.1 प्रतिशत, डब्ल्यू/वी) के साथ मिलाया गया था, और प्रतिक्रिया समय के 10 मिनट के बाद अवशोषण को 700 एनएम पर खाली के खिलाफ मापा गया था। इस्तेमाल किए गए सकारात्मक नियंत्रण ब्यूटाइलेटेड हाइड्रॉक्सीटोल्यूनि (बीएचटी) और -टोकोफेरोल थे।

2.8. Trolox समतुल्य एंटीऑक्सीडेंट क्षमता (TEAC) परख

एंटीऑक्सिडेंटCOK हाइड्रोसोल की गतिविधियों का मूल्यांकन संशोधनों के साथ पहले वर्णित विधि [15,18] के अनुसार किया गया था। संक्षेप में, केंद्रित एबीटीएस रेडिकल कटियन (एबीटीएस • प्लस) समाधान फॉस्फेट बफर खारा (पीएच 7.4) में 0 .8 0 ± 0.05 के अंतिम अवशोषण के लिए 734 एनएम पर पतला था। 1 एमएल एबीटीएस प्लस समाधान के साथ मिश्रण (0.02 एमएल) के नमूने के बाद, 5 मिनट के बाद 734 एनएम पर अवशोषण में कमी आई थी। ट्रोलॉक्स को एक मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और हाइड्रोसोल गतिविधियों को ट्रॉक्सकैलिब्रेशन कर्व्स की साजिश रचकर टीईएसी के रूप में व्यक्त किया गया था। हाइड्रोसोल नमूनों के मोलर समकक्ष टीईएसी मूल्यों की गणना ट्रोलॉक्स समाधान के अवशोषण में कमी के अनुसार की गई थी। BHT और -tocopherol का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था।

2.9. मशरूम टायरोसिनेस के निषेध पर हाइड्रोसोल के प्रभाव

मशरूमटायरोसिनेसगतिविधि को स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग करके मापा गया था जैसा कि पहले वर्णित है, संशोधनों के साथ [19]। संक्षेप में, 20 µ एल एल-टायरोसिन या 20 µ एल एल-डोपा इन पीबीएस (पीएच 6.8; 80 µ एल) और 80 µ एल पीबीएस परीक्षण हाइड्रोसोल के साथ या बिना 96- अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट्स में जोड़े गए, और फिर 20 µ एल मशरूमटायरोसिनेज (100 यू/ एमएल) जोड़ा गया। 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण और ऊष्मायन के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण में डोपाक्रोमप्रोडक्शन (या खपत) 475 एनएम अवशोषण पर निर्धारित किया गया था। कोजिक एसिड, जो टायरोसिनेस को रोकता है, का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। टायरोसिनेस के प्रतिशत अवरोध की गणना निम्नानुसार की गई:

निषेध (प्रतिशत) ≡ {[(ए - बी) - (सी - डी)]/(ए - बी)} × 100 प्रतिशत

जहां ए हाइड्रोसोल नमूने की अनुपस्थिति में एंजाइम के साथ अवशोषण को इंगित करता है, बी एंजाइम या हाइड्रोसोल नमूने के बिना अवशोषण को इंगित करता है, सी एंजाइम के साथ अवशोषण को इंगित करता है, और हाइड्रोसोल और डिंडीकेट एंजाइम के बिना लेकिन हाइड्रोसोल के साथ अवशोषण को इंगित करता है। हमने भी 50 प्रतिशत की गणना कीटायरोसिनेसनमूनों की निरोधात्मक सांद्रता (IC50) उन लोगों के रूप में जो टायरोसिनेस गतिविधि को 50 प्रतिशत तक रोकते हैं।

2.10. मशरूम टायरोसिनेस निषेध का काइनेटिक विश्लेषण

प्रतिक्रिया मिश्रण में सब्सट्रेट के रूप में एल-टायरोसिन या एल-डीओपीए (0.25 मिलीग्राम/एमएल) के 20 μL, 0.2 एम सोडियम फॉस्फेट बफर में 100 μLof मशरूम टायरोसिनेस (20 यूनिट/एमएल) शामिल थे ( पीएच 6.8) और 200 µ एल की कुल मात्रा में प्रत्येक हाइड्रोसोल नमूने के 80 µ एल. परख 25 डिग्री सेल्सियस पर किया गया था, और प्रत्येक हाइड्रोसोल नमूने के निरोधात्मक कैनेटीक्स के साथटायरोसिनेसलाइनविवर-बर्क भूखंडों का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। पारस्परिक समीकरण का उपयोग मिश्रित प्रकार के गैर-प्रतिस्पर्धी निषेध से तेजी से संतुलन के लिए किया गया था, जैसा कि समीकरण (1) [20] में व्यक्त किया गया था। हाइड्रोसोल नमूनों के लिए Ki मान ढलान प्रतिकृति (समीकरण (2)) से अनुमानित किए गए थे। हाइड्रोसोल के लिए Ki मानों की गणना 1/v अक्ष अवरोधन प्रतिकृति (समीकरण (3)) से की गई थी।

जहाँ Vmax का अधिकतम वेग हैटायरोसिनेसगतिविधि, एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स (ES) से सब्सट्रेट (S) का पृथक्करण स्थिरांक Ksis, एंजाइम-अवरोधक परिसर से अवरोधक [I] का पृथक्करण स्थिरांक Kiis और एंजाइम-सब्सट्रेट से अवरोधक का पृथक्करण स्थिरांक Kiis है। -इनहिबिटर कॉम्प्लेक्स (ईएसआई)।

2.11. सेल संस्कृति और सेल व्यवहार्यता परख

B16-F10 मेलेनोमा कोशिकाएं (BCRC60031) बायोरिसोर्स कलेक्शन एंड रिसर्च सेंटर (BCRC), ताइवान से प्राप्त की गईं। B16-F10 कोशिकाओं को Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (गिब्को, कैलिफ़ोर्निया, यूएसए) में संवर्धित किया गया था, जिसमें 5 प्रतिशत CO2 में 37 C पर 10 प्रतिशत FBS था। ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा, कोशिकाओं को काटा गया। सेल व्यवहार्यता को ली द्वारा वर्णित 3-(4,5-डाइमिथाइल-थियाज़ोल-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) परख का उपयोग करके मापा गया था। ].

2.12. सेलुलर मेलेनिन सामग्री

ली द्वारा वर्णित विधि का उपयोग करके मेलेनिन सामग्री को मापा गया। [15]। संक्षेप में, B16-F10 कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट्स में 0.8 × 105 सेल प्रति कुएं के घनत्व पर सुसंस्कृत किया गया था और फिर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। तब सेल थे 24 घंटे के लिए विभिन्न सांद्रता में 100-एनएम-मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (-एमएसएच), कोजिक एसिड (पॉजिटिवकंट्रोल) और हाइड्रोसोल के साथ इलाज किया जाता है। पीबीएस के साथ दो बार धोने के बाद, कोशिकाओं को 100 मिमी सोडियम फॉस्फेट (पीएच 6.8), 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 और 0.1 मिमी फेनिलमेथेनसल्फोनील फ्लोराइड युक्त बफर लाइसेडिन था और 30 मिनट के लिए −80 C पर संग्रहीत किया गया था। कोशिकाओं को इकट्ठा करने के बाद, सेल गोली 1N NaOH में भंग कर दी गई थी जिसमें 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 प्रतिशत डीएमएसओ था। इसके बाद, 405 एनएम पर अवशोषण मापा गया।

2.13. पश्चिमी धब्बा

कोशिकाओं को धारा 2.11 में वर्णित के रूप में lysed किया गया था और एक एंटी-MITF एंटीबॉडी का उपयोग करके MITF प्रोटीन के लिए पश्चिमी सोख्ता के अधीन किया गया था।

2.14. डीएनए सुरक्षा परख

ऑक्सीडेटिव डीएनए क्षति को पहले से वर्णित विधि [21,22] का उपयोग करके थोड़े संशोधनों के साथ सर्कुलर सुपरकोल्डपीसीआई नियो प्लास्मिड डीएनए के निकेड सर्कुलर या आगे के डिग्रेडेड रूपों में रूपांतरण के अनुसार निर्धारित किया गया था। 20 µ l के रिएक्शन मिश्रण में 2.5 µ l सुपरकोल्डpCI नियो (150 ng/µL), 10 µ l एक फेंटन रिएक्शन सॉल्यूशन जिसमें 30 mM हाइड्रोजन पेरोक्साइड, 100- µMferric क्लोराइड और 100 शामिल हैं 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल बफर (पीएच 7.6), और हाइड्रोसोल के 5μL (0.3325-5.32 मिलीग्राम / एमएल) या क्वेरसेटिन (सकारात्मक नियंत्रण; 250 माइक्रोग्राम / एमएल) में माइक्रोएम एस्कॉर्बिक एसिड। प्रतिक्रिया मिश्रण 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था और प्लास्मिड डीएनए रूपों को 0.7 प्रतिशत agarose जैल पर अलग किया गया था और सेफ व्यू ™ (एप्लाइड बायोलॉजिकल मैटेरियल्स (एबीएम) इंक, रिचमंड, कनाडा) का उपयोग करके दाग दिया गया था।

अर्ध-मात्रा निर्धारित करने के लिएएंटीऑक्सिडेंटअर्क की गतिविधियों, पीसीआई नियो के सुपरकोल्ड और निकेड फॉर्म की मात्रा को एक अल्फाइमेजर मिनी (प्रोटीनसिंपल) इंस्ट्रूमेंट का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, और बैंड इंटेंसिटीसन agarose जैल को गेलप्रो सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, पीसीआई नियोप्लाज्मिड को क्रमशः अकेले और फेंटन अभिकर्मक मिश्रण के साथ जोड़ा गया था। डेटा को नकारात्मक नियंत्रण में उस (100 प्रतिशत) के सापेक्ष सुपरकोल्ड डीएनए की मात्रा के रूप में व्यक्त किया जाता है। अर्क की सुरक्षात्मक गतिविधियों की गणना निम्नलिखित समीकरणों [23] का उपयोग करके सुपरकोल्ड और निकेड प्लास्मिड डीएनए की मात्रा से की गई थी:

सुपरकोल्ड प्लास्मिड (प्रतिशत) का संरक्षण =सुपरकोल्ड फॉर्म इंटेंसिटीpCI नियो डीएनए बैंड इंटेंसिटी × 100

निकेड प्लास्मिड का संरक्षण (प्रतिशत) =निकेड फॉर्म इंटेंसिटीpCI नियो डीएनए बैंड इंटेंसिटी × 100

2.15. सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी डेटा को ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त किया जाता है। उपचार के बीच अंतर को छात्र के t -est या ANOVA का उपयोग करके पहचाना गया और उसके बाद Scheffe का परीक्षण किया गया। अंतर को महत्वपूर्ण माना जाता था जब p <>

3) परिणाम और चर्चा

3.1. हाइड्रोसोल में वाष्पशील यौगिकों की पहचान

जीसी/एमएस का उपयोग करके हाइड्रोसोल की सामग्री का विश्लेषण किया गया। मानकों के अवधारण समय के अनुसार घटकों की पहचान की गई थी और मात्राएं एलुएंट्स (चित्रा 2) के चरम क्षेत्रों से निर्धारित की गई थीं। जैसा कि चित्र 2ए-डी में उल्लिखित है, ट्रांस-सिनामाल्डिहाइड, बेंजाल्डिहाइड, और सिनामाइल एसीटेट सीओके हाइड्रोसोल में प्रमुख यौगिक थे और मौजूद थे क्रमशः 87.7 प्रतिशत, 7.0 प्रतिशत और 5.3 प्रतिशत। यूजेनॉल पहले सी. वर्म के आवश्यक तेलों में 7.29 प्रतिशत [24] पाया जाता था, लेकिन वर्तमान COK हाइड्रोसोल (चित्र 2) में नहीं पाया गया। निष्कर्षण प्रक्रियाओं और परख विधियों में अंतर सी. कैसिया आवश्यक तेलों [25] की सिनामाल्डिहाइड सामग्री में अंतर में योगदान कर सकता है।

3.2. COK के पत्तों से हाइड्रोसोल के एंटीऑक्सीडेंट गुण

3.2.1. डीपीपीएच रेडिकल स्कैवेंजिंग गतिविधि

चित्र 3क में, 1.06×10−2 से 5.32×10−1 मिलीग्राम/एमएल तक हाइड्रोसोल की डीपीपीएच कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधियां 5.04 के बीच थीं। प्रतिशत ± 0.96 प्रतिशत और 41.76 प्रतिशत ± 2.50 प्रतिशत, क्रमशः। ये डेटा सीओके हाइड्रोसोल द्वारा खुराक पर निर्भर कट्टरपंथी मैला ढोने का संकेत देते हैं। इसकी तुलना में, सकारात्मक नियंत्रण BHT और -tocopherolscavenged 94.32 प्रतिशत ± 0.08 प्रतिशत और 93.82 प्रतिशत ± 0.13 प्रतिशत DPPH प्रतिक्रियाशील मूलक, क्रमशः, 0.5 mg/mL पर। COK हाइड्रोसोल की कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधि सिनामाल्डिहाइड (चित्र 2) के कारण सबसे अधिक संभावना है। कई अध्ययनों से पता चलता है कि फेनोलिक्स और फ्लेवोनोइड्स हाइड्रोजन परमाणुओं को दान करके डीपीपीएच रेडिकल्स के गठन को रोकते हैं। इसलिए, सिनामोमम प्रजातियों की डीपीपीएच कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधियाँ हाइड्रोजन दाता [26,27] के रूप में कार्यों को भी प्रतिबिंबित कर सकती हैं।

3.2.2 धातु आयन केलेशन

हमने 1.06 × 10−3 और 5.32 × 10−1 मिलीग्राम/एमएल पर हाइड्रोसोल की Fe2 प्लस बाध्यकारी क्षमता का आकलन किया, जैसा कि चित्र 3ए में दिखाया गया है। हाइड्रोसोल घटकों द्वारा धातु केलेशन में एकाग्रता के साथ मामूली वृद्धि हुई, लेकिन 6 मिलीग्राम/एमएल पर, ईडीटीए (चित्रा 3ए) की चेलेटिंग गतिविधि का केवल 37.3 प्रतिशत था।

3.2.3. शक्ति को कम करना

जैसा कि चित्र 3ए में दिखाया गया है, हाइड्रोसोल घटकों की कम करने की शक्ति एकाग्रता-निर्भर थी और बीएचटी और -टोकोफेरोल (0.22 ± 0.01 और {{9) की तुलना में अधिक थी। }}.33 ± 0.15, क्रमशः) 0.5 मिलीग्राम/एमएल पर। पिछले अध्ययनों में, बुओएच अंशों में सी। ऑस्मोफ्लोयम टहनियों से कच्चे तेल के अर्क की कम करने की शक्ति सभी अंशों में सबसे अधिक थी और एकाग्रता के साथ रैखिक रूप से बढ़ी थी [28]। क्योंकिएंटीऑक्सिडेंटअर्क में यौगिकों के बीच क्षमता भिन्न होती है, अर्क की समग्र एंटीऑक्सीडेंट गतिविधियां निष्कर्षण विलायक पर दृढ़ता से निर्भर करती हैं। हालाँकि, C. ऑस्मोफ्लोयम टहनियों से पानी के अर्क की अपचायक शक्ति (OD मान {0}}.7) वर्तमान C के समान (OD मान=0.66 ± 0.01) थी। ऑस्मोफ्लोयम हाइड्रोसोल (चित्र 3ए), जो भाप आसवन का उपयोग करके उत्पादित किए गए थे। शक्ति को कम करना आम तौर पर कम करने वाले एजेंटों और एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि की उपस्थिति से जुड़ा होता है, जो हाइड्रोजन परमाणुओं को कम करने के प्रावधान द्वारा मुक्त कट्टरपंथी श्रृंखला प्रतिक्रियाओं की समाप्ति को दर्शाता है। सी. ऑस्मोफ्लोयम की अपचायक शक्ति संभवतः फेनोलिक यौगिकों में हाइड्रॉक्सिल समूहों की उपस्थिति के कारण है (चित्र 2), जो इलेक्ट्रॉन दाताओं के रूप में कार्य कर सकता है।

3.2.4। टीईएसी एसेज़

वर्तमान हाइड्रोसोल के टीईएसी मूल्यों को 5.32 × 10−3 मिलीग्राम/एमएल से अधिक सांद्रता में बढ़ाया गया था, जो कि संदर्भ यौगिकों -टोकोफेरोल और बीएचटी की तुलना में अधिक थे, जैसा कि चित्र 3ए में दिखाया गया है। एबीटीएस प्लस की कट्टरपंथी साइट के लिए स्टेरिक पहुंच है TEAC assays में गतिविधि के लिए मुख्य मानदंड। तदनुसार, वर्तमान हाइड्रोसोल घटकों के फिनाइल समूह ट्रोलॉक्स की तुलना में थोड़ा कम बाधित हैं।

3.2.5. टीपीसी और एंटीऑक्सीडेंट गतिविधियों के बीच संबंध

जैसा कि चित्र 3बी में दिखाया गया है, जीएई में 1.75 ± 0.438 से 100.41 ± 1.581 मिलीग्राम/जी तक टीपीसी और डीपीपीएच फ्रीरेडिकल मैला ढोने की गतिविधि के बीच अत्यधिक महत्वपूर्ण संबंध था। . DPPH मुक्त कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधि, FIC गतिविधि, कम करने की शक्ति और TEAC के साथ TPC के सहसंबंध गुणांक क्रमशः 0.980, 0.925, 0.967 और 0.902 थे (चित्र 3B)। सामूहिक रूप से, ये आंकड़े दर्शाते हैं किएंटीऑक्सिडेंटCOK हाइड्रोसोल की गतिविधियाँ फिनोल सामग्री के साथ घनिष्ठ रूप से संबंधित हैं।

3.3. टायरोसिनेस गतिविधि पर COK हाइड्रोसोल एकाग्रता का प्रभाव

हमने मशरूम द्वारा L-tyrosine और L-DOPA के ऑक्सीकरण पर COK हाइड्रोसोल सांद्रता के प्रभावों को निर्धारित कियाटायरोसिनेसऔर कोजिक एसिड की गतिविधि के साथ तुलना की, जो एक प्रसिद्ध टायरोसिनेस अवरोधक है (चित्र 3सी,डी)। वर्तमान हाइड्रोसोल संभावित रूप से और खुराक पर निर्भर एल-टायरोसिन और एल-डीओपीए ऑक्सीडेज गतिविधियों को मशरूम टाइरोसिनेज (चित्रा 3सी) की गतिविधियों को रोकता है, लेकिन एल-डीओपीए (डिफेनोलस गतिविधि) की तुलना में एल-टायरोसिन सब्सट्रेट (मोनोफेनोलस गतिविधि) की उपस्थिति में उच्च टायरोसिनेज निरोधात्मक गतिविधि थी। IC5{{10}} मोनोफेनोलेस और डाइफेनोलसेएक्टिविटी के खिलाफ कोजिक एसिड का मान 4 था।0 × 10−5 और 7.8 × 10−3 mg/mL (चित्र 3C), क्रमशः, वर्तमान हाइड्रोसोल (7.96 × 10−4 मिलीग्राम/एमएल और 0.35 मिलीग्राम/एमएल, क्रमशः; चित्रा 3डी) की तुलना में काफी अधिक है। इसलिए, 90 प्रतिशत टायरोसिनेस निरोधात्मक गतिविधि (मोनोफेनोलस गतिविधि) को प्राप्त करने के लिए, हाइड्रोसोल और कोजिक एसिड को क्रमशः 0.52 मिलीग्राम / एमएल और 4.0 × 10−3 मिलीग्राम / एमएल की आवश्यकता होती है, जब एल-टायरोसिन को सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 3 सी, डी) ) यद्यपि टायरोसिनेस निरोधात्मक प्रभावों के लिए COK हाइड्रोसोल्थन कोजिक एसिड की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है, इन प्रयोगों में शक्तिशाली टायरोसिनेस निरोधात्मक गतिविधि स्पष्ट थी।

विविधटायरोसिनेसतैयारी, गतिविधि परख विधियों, और अवरोधक शुद्धता और घटकों ने एंजाइम अवरोधक कैनेटीक्स [29] में अंतर में योगदान दिया हो सकता है। हालांकि, पौधे के अर्क की जैविक गतिविधियों में उनके जैव सक्रिय घटकों का योगदान होता है, जो पौधों की प्रजातियों, फसल के समय, मौसम, भौगोलिक उत्पत्ति, कृषि संबंधी प्रथाओं और निष्कर्षण विधियों से प्रभावित हो सकते हैं। कई हालिया अध्ययनों में प्राकृतिक स्रोतों से अवरोधकों की पहचान और विशेषता की गई है, और निरोधात्मक गतिविधियों और प्राकृतिक अवयवों के बीच संबंध अच्छी तरह से स्थापित हैं (तालिका 1)। विशेष रूप से, कई एल्डिहाइड और अन्य यौगिकों को अलग किया गया है और टायरोसिनेसिनहिबिटर के रूप में विशेषता है। इनमें सिनामाल्डिहाइड, 2-हाइड्रॉक्सी-4-मेथॉक्सी बेंजाल्डिहाइड, एनिसल्डिहाइड, क्यूमिनाल्डिहाइड, क्यूमिक एसिड, फ्लेवोनोल्स, फ्लेवोन और आइसोफ्लेवन्स [4,19,30-37] शामिल हैं। वर्तमान हाइड्रोसोल में 87.7 प्रतिशत सिनामाल्डिहाइड और 7.0 प्रतिशत बेंजाल्डिहाइड शामिल है, जो यह सुझाव देता है कि सिनामाल्डिहाइड, उसके बाद बेंजाल्डिहाइड, हाइड्रोसोल की टायरोसिनेस निरोधात्मक गतिविधि के लिए जिम्मेदार मुख्य पदार्थ है। तालिका 1 के अनुसार, हमने पाया कि बेंजाल्डिहाइड की उपस्थिति वाला हाइड्रोसोल अधिक शक्तिशाली है। शुद्ध सिनामाल्डिहाइड, और बढ़ाता हैटायरोसिनेसहाइड्रोसोल की निरोधात्मक गतिविधि। बेंजाल्डिहाइड की भी डाइफेनोलेज़ गतिविधि और मशरूमटायरोसिनेस [38] की मोनोफेनॉलेज़ गतिविधि दोनों को बाधित करने की पुष्टि की गई थी। बेंजाल्डिहाइड-प्रकार के अवरोधकों का टायरोसिनेस निरोधात्मक तंत्र संभवतः एंजाइम [33,39] में एक प्राथमिक अमीनो समूह के साथ शिफ बेस बनाने की उनकी क्षमता से आता है। बेंजाल्डिहाइड की पैरा स्थिति में एक इलेक्ट्रॉन-दान करने वाले समूह के अलावा टायरोसिनेसिनहिबिटरी गतिविधि बढ़ जाती है, शायद शिफ आधार को स्थिर करना।

3.4. COK Hydrosol द्वारा मशरूम टायरोसिनेस निषेध के काइनेटिक मोड

मोनोफेनोलेस पर हाइड्रोसोल के गतिज व्यवहार और सब्सट्रेट के रूप में एल-टायरोसिन और एल-डीओपीए का उपयोग करने वाले टायरोसिनेस की डाइफेनोलेस गतिविधि का क्रमशः अध्ययन किया गया।टायरोसिनेसहाइड्रोसोल के निरोधात्मक गतिकी का विश्लेषण लाइनविवर-बर्क डबल-पारस्परिक भूखंडों का उपयोग करके किया गया था, जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है। चित्र 4ए, बी में, चार रेखाएं हाइड्रोसोल की तीन सांद्रता (लाइन 2 - लाइन 4) द्वारा निर्जन एंजाइम (लाइन 1) और निषेध का प्रतिनिधित्व करती हैं, और ये रेखाएं 1/एस अक्ष के ऊपर 1/वी अक्ष के बाईं ओर प्रतिच्छेद करती हैं। अप्रतिबंधित प्रायोगिक स्थितियों के तहत, टायरोसिनेस द्वारा उत्प्रेरित एल-टायरोसिन और एल-डीओपीए ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया का अधिकतम वेग (वीमैक्स) {{10}}.055 OD475/मिनट और 0.096 ∆OD475/मिनट बिना समाहित किए थे हाइड्रोसोल (चित्रा 4ए, बी में रेखा 1, क्रमशः)। मशरूम के लिए गतिज पैरामीटर किमी (माइकलिस स्थिरांक)टायरोसिनेसएल-टायरोसिन और एल-डीओपीए को क्रमशः सब्सट्रेट के रूप में प्लॉट करने वाले लाइनविवर-बर्क से प्राप्त, यह दर्शाता है कि किमी 0 .534 मिलीग्राम/एमएल और 0 .511 मिलीग्राम/एमएल बिना हाइड्रोसोल (लाइन) के था 1 चित्रा 4ए, बी में)।

निर्जन एंजाइम से और हाइड्रोसोल के तीन विभिन्न सांद्रता से प्राप्त चार रेखाएं, 1/एस अक्ष के ऊपर 1/वी अक्ष के बाईं ओर प्रतिच्छेद करती हैं। हाइड्रोसोल की बढ़ी हुई सांद्रता के परिणामस्वरूप Vmax में कमी और Km में वृद्धि हुई। विशेष रूप से, जब एल-टायरोसिन को सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था, हाइड्रोसोल की बढ़ती सांद्रता के परिणामस्वरूप विभिन्न ढलानों और अवरोधों के साथ कई लाइनें होती हैं, लेकिन ये एक दूसरे को दूसरे चतुर्थांश में काटती हैं (चित्र 4ए में रेखा 1-4)। इसी तरह के परिणाम तब प्राप्त हुए जब एल-डीओपीए को सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 4बी में रेखा 1-4), इस दावे का समर्थन करते हुए कि हाइड्रोसोल टायरोसिनेस के मिश्रित प्रकार के अवरोधकों को वहन करता है। मिश्रित प्रकार के निषेध के अनुसार, हाइड्रोसोल घटकों की संभावना मुक्त एंजाइम और एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स को बांधती है। मिश्रित प्रकार के अवरोध कई तरह से उत्पन्न हो सकते हैं: हाइड्रोसोल का निषेध उत्पन्न हो सकता है क्योंकि वे प्रतिक्रिया पैटर्न में बाद के मध्यवर्ती के साथ बातचीत करते हैं लेकिन प्रारंभिक एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स [40] के साथ नहीं। इस प्रकार, हमने पृथक्करण स्थिरांक (की और की, क्रमशः) मुक्त एंजाइम (ई) और एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के लिए बाध्यकारी अवरोधक के लिए डबल-पारस्परिक भूखंडों और ढलान और ऊर्ध्वाधर अवरोधन के भूखंडों का उपयोग करके एल-टायरोसिन (चित्रा 4C, डी) या एल की उपस्थिति में हाइड्रोसोल की सांद्रता। सबस्ट्रेट्स के रूप में DOPA (चित्र 4E, F)। जैसा कि चित्र 4ए, बी में दिखाया गया है, कि मान जब एल-टायरोसिन का उपयोग किया गया था क्योंकि सब्सट्रेट एल-डीओपीए की उपस्थिति में उससे लगभग 1.28 गुना कम था, जो एल-डोपा की तुलना में एल-टायरोसिन के साथ अधिक प्रभावी निरोधात्मक एंजाइम बंधन का संकेत देता है। इसके अतिरिक्त, Ki का मान L-DOPA के ऑक्सीकरण के लिए Ki मान से 1.71 गुना अधिक था, यह दर्शाता है कि मुक्त एंजाइम के लिए हाइड्रोसोल घटकों की आत्मीयता एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स की तुलना में अधिक मजबूत है। ये आंकड़े बताते हैं कि हाइड्रोसोल की आत्मीयता को प्रभावित करता है एल-डोपा के लिए एंजाइम लेकिन सक्रिय साइट को बांधता नहीं है। इसके अलावा, Ki का मान L-टायरोसिन के ऑक्सीकरण के लिए लगभग समान था, यह दर्शाता है कि मिश्रित अवरोधक गैर-प्रतिस्पर्धी अवरोधक हैं, जो एक मुक्त एंजाइम और एक एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स को L- का उपयोग करके समान संतुलन स्थिरांक से बांधते हैं। सब्सट्रेट के रूप में टायरोसिन (चित्र 4क)। हालांकि, मुक्त एंजाइम और एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के लिए संतुलन बाध्यकारी स्थिरांक, क्रमशः एल-डोपा का उपयोग सब्सट्रेट (चित्रा 4 बी) के रूप में अलग-अलग हैं, यह दर्शाता है कि मिश्रित प्रकार (प्रतिस्पर्धी और गैर-प्रतिस्पर्धी मिश्रित) अवरोधक न केवल बंध सकते हैं एक मुक्त एंजाइम लेकिन सब्सट्रेट के रूप में एल-डोपा का उपयोग करके एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के साथ भी। पिछले अध्ययनों से यह भी पता चला है कि सी कैसिया आवश्यक तेल और सिनामाल्डिहाइड मिश्रित प्रकार के अवरोधक हैं [19]। इसके विपरीत, सी कैसिया की छाल से अलग किए गए ट्रांस-सिनामाल्डिहाइड ने मशरूम द्वारा एल-डोपा के ऑक्सीकरण के लिए प्रतिस्पर्धी निषेध का संकेत दिया।टायरोसिनेस[32], जबकि सिनामाल्डिहाइड को पी की जड़ से अलग किया जाता है। सेर्नुआ एक गैर-प्रतिस्पर्धी निषेध था [35]।

3.5. मेलानोजेनेसिस पर हाइड्रोसोल सांद्रता के एकाग्रता-निर्भर प्रभाव

अलग-अलग सांद्रता ({0}}.0035–10.64 mg/mL) पर सेल व्यवहार्यता और मेलानोजेनेसिस पर हाइड्रोसोल के प्रभावों को परखने के लिए, हमने B16-F10 मेलेनोमा कोशिकाओं में -MSH का उपयोग करके मेलानोजेनेसिस को प्रेरित किया और तुलना की सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोजिक एसिड का उपयोग करने वाले प्रभाव (चित्र 5)। इस सेल व्यवहार्यता परख के परिणाम ने संकेत दिया कि B16F10 मेलानोमा कोशिकाओं (चित्रा 5 ए) में 0.0035-1.064 मिलीग्राम / एमएल की सांद्रता में हाइड्रोसोल की कोई साइटोटोक्सिसिटी नहीं थी। चूंकि मेलेनोजेनेसिस अवरोधक विकसित किए जा रहे हैं, सुरक्षा और प्रभावशीलता कई अनुप्रयोगों के लिए सबसे महत्वपूर्ण विचार होना चाहिए। हालांकि, हाइड्रोसोल के साथ B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं के उपचार के परिणामस्वरूप 5.32–10.64 mg/mL की सांद्रता में सेल व्यवहार्यता में उल्लेखनीय कमी आई। की सुरक्षा और प्रभावकारिता की जांच के अध्ययन के परिणामों के अनुसारत्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वालाB16F1 0 सेल संस्कृतियों में उत्पाद, 1.064 mg/mL सेल-आधारित प्राथमिक स्क्रीनिंग के लिए एक थ्रेशोल्ड एकाग्रता है। इसलिए, हाइड्रोसोल द्वारा B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं में एंटी-टायरोसिनेज के तंत्र की जांच करने के लिए 0.1064-1.064 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता का उपयोग किया गया था।

विभिन्न सांद्रता में हाइड्रोसोल उपचारों द्वारा मेलानोजेनेसिस का दमन कोशिकाओं में मेलेनिन सामग्री के aspercentages (चित्रा 5 बी) निर्धारित किया गया था। हमने पश्चिमी सोख्ता (चित्र 5c) का उपयोग करके MITF अभिव्यक्ति स्तरों का भी विश्लेषण किया। इन प्रयोगों में, मेलेनिन सामग्री और MITF अभिव्यक्ति के स्तर को खुराक-निर्भरता से COK हाइड्रोसोल द्वारा दबा दिया गया था, यह सुझाव देते हुए कि COK हाइड्रोसोल MITF संश्लेषण को दबाकर कोशिकाओं में मेलेनिन सामग्री को कम करता है।

3.6. डीएनए सुरक्षा परख

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां डीएनए को नुकसान पहुंचाने और सेल की उम्र बढ़ने और कैंसर का कारण बनने के लिए जानी जाती हैं। डीएनएनिकिंग एसेज़ डीएनए को नुकसान पहुंचाने वाले रेडिकल्स [41] के उत्पादन को संवेदनशील रूप से निर्धारित करने के लिए एक सुविधाजनक सेल-फ्री मॉडल सिस्टम प्रदान करते हैं। इन प्रयोगों में, फेंटन प्रतिक्रियाओं ने हाइड्रॉक्सिल रेडिकल्स उत्पन्न किए जो सुपरकोल्ड प्लास्मिड डीएनए को तोड़ते हैं और इसे डीएनए के निकित रूप में परिवर्तित करते हैं, जिससे इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता कम हो जाती है। [42,43]। इस प्रकार, हाइड्रोसोल की डीएनए सुरक्षात्मक गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए, हमने फेंटन रिएक्टेंट्स [44] के साथ pCI नियो डीएनए को इनक्यूबेट किया। जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है, सुपरकोल्ड और निकेड प्लास्मिड फॉर्म स्पष्ट रूप से agarose जेल पर उनके सापेक्ष इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता दर से अलग हैं; supercoiledDNA सबसे तेज गति से चला गया, और निकला हुआ डीएनए क्रमशः सबसे धीमा चला गया। हाइड्रोसोल के साथ उपचार के बाद, डीएनए क्षति को 1.33-5.32 मिलीग्राम/एमएल के हाइड्रोसोल सांद्रता में थोड़ा कम किया गया था, क्रमशः सुपरकोल्ड फॉर्म की 28-58 प्रतिशत सुरक्षा के साथ (गलियां 6-8)। 0.3325–0.665 मिलीग्राम/एमएल के हाइड्रोसोल सांद्रता पर, नकारात्मक नियंत्रण (गलियां 4 और 5) के सापेक्ष कोई सुरक्षा नहीं देखी गई। इसके विपरीत, क्वेरसेटिन ने हाइड्रॉक्सिल रेडिकल से प्लास्मिड डीएनए को प्रभावी ढंग से संरक्षित किया- मध्यस्थता विखंडन, जैसा कि पहले दिखाया गया था [45]। सी से हाइड्रोसोल अर्क के सुरक्षात्मक प्रभाव दिखाने वाले ये पहले डेटा हैं। ओस्मोफ्लोयम कनेहिरा फेंटन प्रतिक्रियाओं द्वारा डीएनए क्षति पर छोड़ देता है। ये प्रभाव पॉलीफेनोल यौगिकों की उपस्थिति के कारण होने की संभावना है।

4। निष्कर्ष

COK का ताइवान में लंबे समय से औषधीय पौधे के रूप में उपयोग किया जाता रहा है। हालांकि, हमारे ज्ञान के लिए, यह पहली रिपोर्ट है जिसमें दिखाया गया है कि सीओके के पत्तों से भाप आसवन द्वारा तैयार किए गए हाइड्रोसोल में एंटीऑक्सीडेंट गतिविधियां होती हैं, जैसा कि परख में देखा गया हैएंटीऑक्सिडेंटगतिविधि और डीएनए क्षति। हमने यह भी दिखाया कि यह हाइड्रोसोल मेलानोजेनेसिस को दबा देता है। जीसी/एमएस विश्लेषणों में, सीओके हाइड्रोसोल में प्रमुख यौगिकों को सिनामाल्डिहाइड और बेंजाल्डिहाइड पाया गया, और ये एजेंट टाइरोसिनेस के मोनोफेनोलस और डिफेनोलेस गतिविधियों के खिलाफ संभावित रूप से निरोधात्मक थे। टायरोसिनेस निषेध कैनेटीक्स के हमारे आकलन में, सीओके हाइड्रोसोल ने एल-टायरोसिन और एल-डीओपीए ऑक्सीडेज गतिविधियों दोनों के मिश्रित-प्रकार की खुराक पर निर्भर निषेध का प्रदर्शन किया।टायरोसिनेस. वर्तमान हाइड्रोसोल यौगिकों ने MITF प्रोटीन अभिव्यक्ति को भी दबा दिया, जिससे -MSH- प्रेरित मेलेनिन संश्लेषण कम हो गया।

अंत में, टायरोसिनेस अवरोधकों के लिए सुरक्षा एक प्रमुख विचार है, विशेष रूप से उन कॉस्मेटिक और खाद्य उत्पादों के लिए, जिनका उपयोग विनियमित मात्रा में किया जा सकता है। COK पहले से ही एक खाद्य और भोजन और सौंदर्य प्रसाधनों के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला प्राकृतिक योजक है। इसके अलावा, सिनामाल्डिहाइड को आम तौर पर मानव उपभोग के लिए सुरक्षित माना जाता है। COK हाइड्रोसोल प्रभावी और सुरक्षित होने के साथ एक उत्कृष्ट प्राकृतिक बायोमटेरियल हैटायरोसिनेसऔर मेलेनिन संश्लेषण निरोधात्मक गतिविधि और डीएनए क्षति से बचाने की क्षमता। इसलिए, हम मानते हैं कि सीओके हाइड्रोसोल को कई अनुप्रयोगों के लिए एक सुरक्षित और प्रभावी डिपिगमेंटिंग एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।