कैमेलिया जैपोनिका एसेंशियल ऑयल इनहिबिट्स-एमएसएच-प्रेरित मेलेनिन उत्पादन और बी16एफ10 मेलानोमा कोशिकाओं में टायरोसिनेस गतिविधि को रोकता है

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सी यंग हा, जी यंग जंग, और जे-क्यूंग यांगो

आवश्यक तेल सुगंधित तेल होते हैं जो पत्तियों, तनों, छिलके, पंखुड़ियों और सुगंधित पौधों की जड़ों से निकाले जाते हैं जो प्रकृति में उगाए जाते हैं या जैविक तरीकों से उगाए जाते हैं और प्राकृतिक पदार्थों के रूप में विभिन्न चिकित्सा प्रभाव होते हैं। कैमेलियाजापोनिका के बीजों से निकाला गया आवश्यक तेल विभिन्न कार्यात्मक गुणों को प्रदर्शित करता है; हालांकि, इसकीटायरोसिनेसनिरोधात्मक गतिविधि की व्यापक जांच नहीं की गई है। -इस अध्ययन की रासायनिक संरचना और tyrosinase निरोधात्मक गतिविधि की जांच करने के लिए किया जाता हैकैमेलिया जैपोनिकसीड आवश्यक तेल(सीजेएस-ईओ)। Hexamethylcyclotrisiloxane (42.36 प्रतिशत) और Octamethylcyclotetrasiloxane (23.28 प्रतिशत) CJS-EO के दो प्राथमिक घटक हैं, जैसा कि गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से पहचाना जाता है।वांई निरोधात्मक गतिविधियोंसीजेएस-ईओऔर सकारात्मक नियंत्रण अर्बुटिन का मशरूम टायरोसिनेस के खिलाफ आगे मूल्यांकन किया जाता है।वांई परिणाम बताते हैं कि CJS-EO और arbutin बाधित करते हैंटायरोसिनेसगतिविधि। इसके अलावा, CJS-EO मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन-उपचारित समूह में मेलानोजेनेसिस को महत्वपूर्ण रूप से रोकता है, और मेलेनिन की एक महत्वपूर्ण मात्रा को दबा दिया जाता है। CJS-EO के कारण का पता लगाने के लिएटायरोसिनेसनिरोधात्मक प्रभाव और मेलेनिन कमी प्रभाव, आनुवंशिक और प्रोटीन विश्लेषण किए जाते हैं। हमारे परिणामों के आधार पर, हम अस्थायी रूप से यह निष्कर्ष निकालते हैं किसीजेएस-ईओटायरोसिनेस से संबंधित प्रोटीन जैसे हानिकारक कारकों से मेलानोसाइट्स को रोक सकता है। इन परिणामों से पता चलता है कि CJS-EO में पोटेंटेंटिटीरोसिनेज गतिविधि है और यह एक अच्छी त्वचा हो सकती है-सफेदप्रतिनिधि।

करने के लिए क्लिक करेटायरोसिनेस इनहिबिटर के लिए सिस्टैंच यूके।

परिचय

त्वचा का रंग एपिडर्मिस में मेलेनिन, डर्मिस की रक्त वाहिकाओं में हीमोग्लोबिन और चमड़े के नीचे के ऊतकों में कैरोटीन जैसे पिगमेंट से प्रभावित होता है। उनमें से, बाहरी त्वचा का रंग मेलेनिन वर्णक की मात्रा और वितरण से निर्धारित होता है [1]। मेलेनिन संश्लेषण में शामिल एंजाइमों को अच्छी तरह से जाना जाता हैटायरोसिनेस, टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन-1 (TRP-1), और डोपाक्रोम टॉटोमेरेज़(DCT, TRP-2) [2]। उनमें से, टायरोसिनेस एक एंजाइम है जो प्रारंभिक प्रतिक्रिया में कार्य करता है, जो मेलेनिन संश्लेषण का दर-निर्धारण चरण है, और टायरोसिनेस को डीओपीए क्विनोन [3] में ऑक्सीकरण करता है। इसलिए, पदार्थ जो रोकते हैंटायरोसिनेस,TRP-1, और TRP-2 मेलेनिन संश्लेषण को बाधित कर सकते हैं और इस प्रकार एक त्वचा प्राप्त कर सकते हैं-सफेदसमारोह [4]। मेलेनिन मानव त्वचा में यूवी किरणों और बाहरी हानिकारक कारकों से त्वचा की रक्षा करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, जब यह अधिक मात्रा में उत्पन्न होता है और त्वचा पर जमा हो जाता है, तो यह मेलास्मा, झाईयां, त्वचा के धब्बे आदि पैदा कर सकता है, और मेलेनिन अग्रदूतों की विषाक्तता और त्वचा कैंसर जैसे रोगों के कारण कोशिका मृत्यु का कारण बन सकता है [5–7]।

एल-एस्कॉर्बिक एसिड, अर्बुटिन, और लैक्टिक एसिड को प्रतिनिधि मेलेनिन उत्पादन अवरोधक के रूप में विकसित किया गया है, लेकिन त्वचा की जलन या सुरक्षा मुद्दों के कारण उनके उपयोग को सख्ती से नियंत्रित किया जाता है। इसलिए, एक प्राकृतिक सफेद करने वाले एजेंट को खोजने के लिए सक्रिय रूप से अनुसंधान किया जा रहा है जो सुरक्षित और प्रभावी है [8]।

पौधे के आवश्यक तेल विभिन्न कार्यात्मक गुणों को प्रदर्शित करने के लिए जाने जाते हैं, जैसे कि मजबूत जीवाणुरोधी गतिविधि और एंटीएजिंग और त्वचा पुनर्जनन प्रभाव [9, 10]। सिनामोमम कैसिया एसेंशियल ऑयल [4], पॉलीगोनम ओडोरैटम एसेंशियल ऑयल [11], और विटेक्स नेगुंडो लिन लीफ एसेंशियल ऑयल [12] में पाया गया है।टायरोसिनेसनिरोधात्मक गतिविधियाँ।

कैमेलिया जपोनिका ("त्सुबाकी" का जापानी नाम) एक लोकप्रिय पेड़ है, जो एक बगीचे के पौधे और जापान में तेल सामग्री और लोक चिकित्सा के स्रोत दोनों के रूप में लोकप्रिय है [13]। कोरिया में, सी. जपोनिका एक सदाबहार पेड़ है जो थियासी परिवार और जीनस कैमेलिया [14] से संबंधित है। सी. जैपोनिका सीड ऑयल का त्वचा और बालों के स्वास्थ्य को सुनिश्चित करने के लिए कॉस्मेटिक प्रोटेक्टेंट के रूप में और सुखदायक एजेंट के रूप में उपयोग का एक लंबा इतिहास रहा है [15]। सी. जैपोनिकासीड तेल में एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि [16], जीवाणुरोधी गतिविधि [17], विरोधी भड़काऊ गतिविधि [18], और स्किनबैरियर फ़ंक्शन [19] सहित विभिन्न जैविक गतिविधियों को प्रदर्शित करने की सूचना मिली है। इसके व्यापक उपयोग के बावजूद, कुछ अध्ययनों ने त्वचा पर सी। जैपोनिका के बीज के तेल के प्रभावों की जांच की है-सफेद-संबद्धटायरोसिनेसगतिविधि।

इसलिए, इस अध्ययन में, सी की रासायनिक संरचना। जपोनिका बीज आवश्यक तेल (सीजेएस-ईओ) की जांच गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) का उपयोग करके की गई थी, औरटायरोसिनेसइस आवश्यक तेल की निरोधात्मक गतिविधि की जांच की गई। इस निरोधात्मक गतिविधि को संबोधित करने के लिए, के प्रभावसीजेएस-ईओB16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं में ऑन-एमएसएच-उत्तेजित मेलानोजेनेसिस और टायरोसिनेस निषेध का मूल्यांकन किया गया।

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1. संयंत्र सामग्री।

C. जपोनिका के बीज मार्च 2021 में Seohyeon Herbal Medicine Farming Association, Nonsan, South Korea से खरीदे गए थे। ग्योंग्सांग नेशनल यूनिवर्सिटी के प्रायोगिक वन के एक प्रतिनिधि ही-गॉन कांग द्वारा पौधों की सामग्री की पहचान की गई थी।

Cistanche पारंपरिक चीनी दवाओं में से एक है

2.2. अभिकर्मक।

मशरूमटायरोसिनेसT -3824 (सिग्मा-एल्ड्रिच, यूएसए) से खरीदा गया था, और माउस B16F10 मेला नोमा को CRL -6475 (अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन, मानस, वीए, यूएसए) से खरीदा गया था। सेल संस्कृति के लिए आवश्यक मीडिया और अभिकर्मकों को इनविट्रोजन (यूएसए), सिग्मा (यूएसए), और ननक (यूएसए) से खरीदा गया था। फॉरवेस्टर्न ब्लॉटिंग, एक पश्चिमी धब्बा किट और एक अर्धसूत्री हस्तांतरण प्रणाली (बायो-रेड, यूएसए) का उपयोग किया गया था, और एक छवि विश्लेषण प्रणाली (बायो-रेड, यूएसए) का उपयोग करके परिणामों की पुष्टि की गई थी। सांताक्रूज बायोटेक (यूएसए) से एंटीबॉडी खरीदे गए थे। डाइमिथाइल सल्फोऑक्साइड (DMSO) को सिग्मा--एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदा गया था।

2.3. निष्कर्षण और नमूना तैयार करना।

पहले थोड़े संशोधनों के साथ प्रकाशित एक विधि का उपयोग करके निष्कर्षण किया गया था [4]। संक्षेप में, सी. जपोनिका के बीज (500 ग्राम) को एक बर्तन में रखा गया और 4 घंटे के लिए 2000 एमएल पानी का उपयोग करके आसवन के माध्यम से निकाला गया। -ई वाष्प उत्पन्न एक बंद शीतलन प्रणाली का उपयोग करके ठंडा किया गया था, और परिणामस्वरूप तरल एक कंटेनर में एकत्र किया गया था। -ई तेल आसुत द्रव के शीर्ष की ओर तैरता है, जबकि पानी तरल के निचले चरण में बस जाता है; इसलिये,सीजेएस-ईओतरल के ऊपरी चरण को हटाकर प्राप्त किया गया था, जिसमें वांछित तेल था, और फिर उपयोग होने तक -20 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था। सेल प्रयोगों के लिए डीएमएसओ में सीजेएस-ईओ के 500 पीपीएमस्टॉक समाधान का उपयोग किया गया था।

2.4. जीसी-एमएस विश्लेषण।

के वाष्पशील घटकसीजेएस-ईओGC-MS (Clarus 600 GC-MS, PerkinElmer, Shelton, CT, USA) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। इस्तेमाल किया गया विश्लेषण कॉलम पर्किनएल्मर एलीट-5 एमएस (3{{10}} मिमी × 0.3 मिमी × 0.25 माइक्रोन) था। मोबाइल चरण के रूप में हीलियम गैस (1.0 एमएल/मिनट) का उपयोग किया गया था। ओवन का तापमान 10 डिग्री/मिनट की दर से 40 डिग्री से 100 डिग्री तक बढ़ाया गया और फिर 1.0 मिनट के लिए बनाए रखा गया। इसके बाद, तापमान को 10 डिग्री / मिनट की दर से बढ़ाकर 230 डिग्री कर दिया गया और फिर 5 मिनट तक बनाए रखा गया। इंजेक्टर का तापमान 200 डिग्री पर सेट किया गया था, और डिटेक्टर का तापमान 250 डिग्री पर सेट किया गया था। -ई विश्लेषण किए गए परिणामों की पहचान एनआईएसटी मास स्पेक्ट्रल सर्च प्रोग्राम (संस्करण 2.0 ग्राम, राष्ट्रीय मानक और प्रौद्योगिकी संस्थान, गेथर्सबर्ग, एमडी, यूएसए) का उपयोग करके की गई थी।

2.5. कोश पालन।

B16F10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं को कोरिया सेल लाइन बैंक से खरीदा गया था। 10 प्रतिशत FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम, WEL GENE, डेगू, कोरिया) और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (गिब्को BRL) 37 डिग्री और 5 प्रतिशत CO2 स्थितियों के साथ पूरक DMEM (WELGENE, डेगू, कोरिया) का उपयोग करके सेल संस्कृति का प्रदर्शन किया गया था। सेल नंबरों के प्रसार के कारण होने वाली अधिक घनत्व घटना को हल करने के लिए, ट्रिप्सिन (Hyclone, USA) का उपयोग करके सुसंस्कृत B16F10 कोशिकाओं को उचित संख्या में बनाए रखा गया था।

2.6. सेल व्यवहार्यता परख।

B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं को सेल संस्कृति के लिए एक 6-वेल प्लेट में 3 ×104/एमएल पर बोया गया था।सीजेएस-ईओएक उपयुक्त सांद्रता (31.25 पीपीएम से 500 पीपीएम) प्रति कुएं में उपचारित किया गया। -ई माध्यम को 72 घंटों के बाद हटा दिया गया था, और 200 μL 3- (4, 5- डाइमिथाइलथियाज़ोल -2- yl) -2, 5- डिपेनिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) घोल (Promega, Madison, WI, USA) का इलाज किया गया। एमटीटी अभिकर्मक को 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सीओ 2 इनक्यूबेटर में ऊष्मायन के बाद सफाई से हटा दिया गया था। दागी गई कोशिकाओं के लिए, डीएमएसओ के 2 एमएल को कुओं में उत्पन्न सभी फॉर्मेज़न को भंग करने के लिए इलाज किया गया था। सेल व्यवहार्यता को एलिसा रीडर (स्पेक्ट्रामैक्स 190, आणविक उपकरण एलएलसी, सैन जोस, सीए, यूएसए) के साथ 540 एनएम पर अवशोषण द्वारा मापा गया था।

2.7. टायरोसिनेस गतिविधि परख।

टायरोसिनेसगतिविधि का अनुमान L-DOPA ऑक्सीकरण की दर को मापकर लगाया गया था [20]। B16F10 कोशिकाओं (2 × 105 कोशिकाओं / कुएं) को -मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (-MSH) के साथ इलाज किया गया था औरसीजेएस-ईओऔर 3 दिनों के लिए सुसंस्कृत। कोशिकाओं को काटा गया, लसीका बफर (1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100, 0 .1 एम पीएमएसएफ) जोड़ा गया, और फिर कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए 4 डिग्री पर प्रतिक्रिया करके लाइस किया गया। -ई सतह पर तैरनेवाला सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 12,000×g पर 15 मिनट के लिए एकत्र किया गया था। एकत्रित सतह पर तैरनेवाला में प्रोटीन की मात्रा का ठहराव, 10 mmol/mL L-DOPA जोड़ा गया। इसके बाद, कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री पर एक CO2 इनक्यूबेटर में ऊष्मायन किया गया था और 490 एनएम पर अवशोषण एक अवशोषक माइक्रोप्लेट रीडर (स्पेक्ट्रामैक्स 190, आणविक उपकरण एलएलसी, सैन जोस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके दर्ज किया गया था। प्राप्त किए गए डेटा की गणना निम्न सूत्र का उपयोग करके की गई: टायरोसिनेस गतिविधि (प्रतिशत) - (नमूना का ओडी 490/नियंत्रण का ओडी490) × 100।

2.8. मेलेनिन सामग्री परख।

B16F10 कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए CJS-EO और -MSH के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किए गए कोशिकाओं के संस्कृति माध्यम को नवीनीकृत करने और दो बार पीबीएस के साथ धोने के बाद 12 घंटे के लिए एसिक्स-वेल प्लेट (2 × 105 सेल / कुएं) में बीज दिया गया था [21]। B16F10 कोशिकाओं का इलाज -MSH और . के साथ किया गयासीजेएस-ईओएक साथ, 3 दिनों के लिए सुसंस्कृत, और कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार काटा और धोया गया। उसके बाद, इसे 1N NaOH से उपचारित किया गया जिसमें 10% DMSO था और 1 घंटे के लिए 80 डिग्री पर प्रतिक्रिया करता था। मेलेनिन सामग्री विश्लेषण के लिए, अवशोषण को 475 एनएम पर एक अवशोषक माइक्रोप्लेट रीडर (स्पेक्ट्रामैक्स 190, आणविक उपकरण एलएलसी, सैन जोस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया था। सीजेएस-ईओ-उपचारित कोशिकाओं के -ई प्रतिशत मूल्य की गणना नकारात्मक नियंत्रण के संबंध में की गई थी। विस्तार से, प्रत्येक नमूने की प्रोटीन सांद्रता को निर्धारित करने के लिए बीसीए प्रोटीन परख किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, यूएस) का उपयोग किया गया था। -मेलेनिन सामग्री को सेलुलर प्रोटीन एकाग्रता (अवशोषण मेलेनिन / कुरूप प्रोटीन) के लिए सामान्यीकृत किया गया था।

2.9. जीन की जांच।

B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं को DMEM (GIBCO, USA) में 1 × 106 कोशिकाओं के घनत्व पर 100 मिमी डिश में 10 प्रतिशत गोवाइनसेरम और 1 प्रतिशत एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक किया गया था; बाद में, उन्हें 37 डिग्री पर 5 प्रतिशत CO2 में ऊष्मायन किया गया। एक नए 10 प्रतिशत DMEM माध्यम में बदलने के बाद,सीजेएस-ईओएक संस्कृति प्लेट में जोड़ा गया था और 3 डी के लिए सुसंस्कृत किया गया था, और सर्फैक्टेंट के रूप में 1 प्रतिशत एमिसॉफ्ट को मध्यम मात्रा के 1/1, 000 के अनुरूप मात्रा में जोड़ा गया था। 3 डी के बाद, टीआरआईज़ोल का 1 एमएल (इंविट्रोजन, यूएसए) ) के mRNA अभिव्यक्ति स्तर की जांच के लिए कोशिकाओं में जोड़ा गया थासफेद-संबंधित जीन, और RNA को Invitrogen'sRNA आइसोलेशन विधि का उपयोग करके अलग किया गया था। एक पराबैंगनी डिटेक्टर का उपयोग करके 260 एनएम पर आरएनए की मात्रा निर्धारित करने के बाद, एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) किया गया था। आरटी-पीसीआर के लिए, एक ऑल-इन-वन आरटी-पीसीआर किट (सुपर बायो, कोरिया) का उपयोग किया गया था, प्रयोग निर्माता के निर्देशों के आधार पर किया गया था, और प्राइमर और प्रतिक्रिया की स्थिति इस प्रकार थी: एक्टिन का अनुक्रम 5′- था। जीएजी एसीसी टीटीसी एएसी एसीसी सीसीए जीसीसी-3';एंटीसेंस, 5′-जीजीसी कैट सीटीसी टीटीजी सीटीसी जीएए जीटीसी-3'; 30 मिनट के लिए 50 डिग्री पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन; रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस 3 मिनट के लिए 96 डिग्री पर निष्क्रिय, 30 एस के लिए 94 डिग्री, और 1 मिनट के लिए 62 डिग्री, इसके बाद 1 मिनट के लिए 72 डिग्री पर 25 चक्र। अनुक्रमटायरोसिनेस5′-जीजीसी सीएजी सीटीटी टीसीए जीजीसी आगा जीजीटी 3' था; एंटीसेंस, 5′-टीजीजी टीजीसी टीटीसी एटीजी जीजीसी एएए एटीसी-3'; 30 एस के लिए 90 डिग्री पर विकृत; 60 डिग्री पर 30 मिनट के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन; रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस 1 मिनट के लिए 94 डिग्री पर निष्क्रिय। इसके बाद, 30 चक्रों के लिए 94 डिग्री पर 30 एस के लिए, 30 एस के लिए 56 डिग्री और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री पर एक पीसीआर का प्रदर्शन किया गया। टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन 1 (TRP-1) का अनुक्रम 5′-GCT GCA GGAGCC TTC TTT CTC-3' था; एंटीसेंस, 5′-एएजी एसीजी सीटीजी सीएसीटीजीसी टीजीजी टीसीटी-3'; 30 एस के लिए 90 डिग्री पर विकृत; 30 मिनट के लिए 60 डिग्री पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन; रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस 1 मिनट के लिए 94 डिग्री पर निष्क्रिय। इसके बाद, 30 चक्रों के लिए 30 चक्रों के लिए 94 डिग्री पर 30 सेकंड के लिए, 56 डिग्री पर 30 सेकंड के लिए और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री पर एक पीसीआर का प्रदर्शन किया गया। -ई अनुक्रमटायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन 2 था5′-टीजीए सीसीजी टीजीए जीसीए एटीजी जीसीसी-3'; एंटीसेंस, 5′-सीजीजीटीटीजी टीजीए सीसीए एटीजी जीजीटी जीसीसी-3'; 30 मिनट के लिए 50 डिग्री पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन; रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस को 3 मिनट के लिए 96 डिग्री, 1 मिनट के लिए 94 डिग्री और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री पर निष्क्रिय करना। इसके बाद, 25 चक्रों में 1 मिनट के लिए 72 पीसीआर प्रतिक्रियाएं की गईं।

2.10. प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच।

माउस B16F10मेलेनोमा कोशिकाओं को 100 मिमी डिश में डीएमईएम में 5 × 105 कोशिकाओं के घनत्व पर 10 प्रतिशत एफबीएस और 1 प्रतिशत एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक किया गया और फिर 5 प्रतिशत सीओ 2 में 1 डी के लिए 37 डिग्री पर सुसंस्कृत किया गया। इसके बाद, उनका एक नए माध्यम से आदान-प्रदान किया गया, औरसीजेएस-ईओअलग-अलग सांद्रता में इलाज किया गया था और 3 डी के लिए सुसंस्कृत किया गया था। एमिसॉफ्ट के 1 प्रतिशत जलीय घोल को एसरफैक्टेंट के रूप में मध्यम मात्रा के 1/1000 के अनुरूप मात्रा में जोड़ा गया था। -ई सुसंस्कृत कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया और 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित किया गया और फिर एक सेलडिसप्शन बफर (40 मिमी ट्रिस-सीएल [पीएच 7.4], 10 मिमी EDTA, 120 मिमी NaCl, 0.1 प्रतिशत एनपी -40, 1 मिमी में स्थानांतरित किया गया। PMSF, और प्रोटीजइनहिबिटर कॉकटेल)। इसके अलावा कोशिकाओं को नष्ट करने के बाद, सेंट्रीफ्यूजेशन 15, 000 आरपीएम पर 4 डिग्री फॉर 10 मिनट पर किया गया था, और सतह पर तैरनेवाला को अलग करने के लिए बरामद किया गया था। -ई पृथक प्रोटीन को सिग्मा की बीसीए विधि का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, और एसडीएस-पेज का प्रदर्शन किया गया था। एसडीएस-पेज जेल को पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करने के बाद, प्रोटीन को एक प्राथमिक एंटीबॉडी और पेरोक्सीडेज के साथ संयुग्मित एक माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके लेबल किया गया था और फिर एक पश्चिमी धब्बा पहचान किट (इंट्रोन, कोरिया) का उपयोग करके एक्स-रे फिल्म को उजागर किया गया था। इसके बाद, अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण किया गया।

3। परिणाम

3.1. सीजेएस-ईओ की रासायनिक संरचना।

CJS-EO 18 प्रतिशत w/w की उपज पर प्राप्त किया गया था। सीजेएस-ईओ की रासायनिक संरचना का जीसी-एमएस (तालिका 1) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। -ई चोटियों को जीसी में अलग किया गया था, और एमएस के माध्यम से 17 यौगिकों की पहचान की गई थी, जो कुल शिखर क्षेत्र (तालिका 1) का 90 प्रतिशत था। -इम के रासायनिक घटकसीजेएस-ईओहेक्सामेथाइलसाइक्लोट्रिसिलोक्सेन (42.36 प्रतिशत), ऑक्टामेथाइलसाइक्लोटेट्रासिलोक्सेन (23.28 प्रतिशत), डेकामिथाइलसाइक्लोपेंटासिलोक्सेन (5.81 प्रतिशत), हेक्सानेडियोइक एसिड (5.56 प्रतिशत), और वैनिलिन (2.96 प्रतिशत) थे। पिछले शोध में, जीसी-एमएस विश्लेषण ने बौहिनिया एक्यूमिनाटालिन [22] के पत्ते और तने के अर्क में हेक्सामेथिलसाइक्लोट्रिसिलोक्सेन का पता लगाया। मोरिंगा ओलीफेरा में -ई वाष्पशील घटक मुख्य रूप से एस्टर, एसिड, एल्डिहाइड और हाइड्रोकार्बन से बने होते हैं, और हाइड्रोकार्बन मुख्य रूप से हेक्सामिथाइलसाइक्लोट्रिसिलोक्सेन [23] होते हैं। इसी तरह, हमारे अध्ययन में, हेक्सामेथिलसाइक्लोट्रिसिलोक्सेन को सीजेएस-ईओ के मुख्य रासायनिक घटक के रूप में पुष्टि की गई थी। सीजेएस-ईओ, वैनिलिन के मुख्य रासायनिक घटकों में से एक, यूजेनिया कैरियोफिलाटा और ओसीमम बेसिलिकम [24], हिसोपस ऑफिसिनैलिस एल। (लैमियासी) आवश्यक तेल [25], और कैलिया क्लेमाटिडिया आवश्यक तेल [26] के आवश्यक तेल में पाया गया था। पिछले अध्ययनों में, मोनो फिनोलेज़ और डिफेनोलेस की गतिविधियों पर वैनिलिन का निरोधात्मक प्रभाव निहित हैटायरोसिनेसपहले रिपोर्ट किया गया था [27]। दिलचस्प बात यह है कि हेक्सामेथिलसाइक्लोट्रिसिलोक्सेन सहित कम आणविक भार चक्रीय वाष्पशील मिथाइलसिलोक्सेन यौगिकों का उपयोग विभिन्न प्रकार के सौंदर्य प्रसाधनों और व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों और कई अन्य उपभोक्ता उत्पादों [28] में किया गया है। भविष्य में, मेलेनिन उत्पादन और टायरोसिनेस गतिविधि को बाधित करने के लिए जिम्मेदार यौगिक को निकाला जाना है और इसका उपयोग प्राकृतिक सौंदर्य प्रसाधन या दवा में किया जा सकता है।

3.2. CJS-EO द्वारा प्रेरित मेलेनोमा कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता।

हमारे परिणामों से पता चला है कि murine मेलेनोमा B16F10 कोशिकाओं का उपचार 31.25 से 500 पीपीएम की एकाग्रता के साथ किया जाता हैसीजेएस-ईओ24 घंटे के लिए सेल व्यवहार्यता में किसी भी बदलाव को प्रेरित नहीं किया। 31.25 से 500 पीपीएम की सांद्रता पर, सेल व्यवहार्यता 90 प्रतिशत से 100 प्रतिशत थी, जो कम साइटोटोक्सिसिटी (चित्र 1) का संकेत देती है। इसलिए, सभी सांद्रता (31.25 से 500 पीपीएम) सीजेएस-ईओ के प्रभावों के आगे मूल्यांकन के लिए उपयुक्त थे।टायरोसिनेसB16F10 कोशिकाओं में गतिविधि और मेलेनिन संश्लेषण।

3.3. CJS-EO की इंट्रासेल्युलर टायरोसिनेस गतिविधि का निषेध।

का असरसीजेएस-ईओएल-डीओपीए के ऑक्सीकरण पर बायट्रोसिनेज उत्प्रेरित, साथ ही साथ अर्बुटिन, एक प्रसिद्धटायरोसिनेसअवरोधक, जांच की गई। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, CJS-EO andarbutin ने खुराक पर निर्भर तरीके से L-DOPA ऑक्सीडेएक्टिविटी पर शक्तिशाली निरोधात्मक प्रभाव प्रदर्शित किया। -ई परिणाम बताते हैं कि सीजेएस-ईओ और अर्बुटिन ने समान टाइरोसिनेस निरोधात्मक गतिविधियों का प्रदर्शन किया। सांख्यिकीय विश्लेषण के आधार पर, अर्बुटिन में 125 और 500 पीपीएम पर सीजेएस-ईओ की तुलना में काफी अधिक टाइरोसिनेज निरोधात्मक गतिविधि थी। हालांकि, 31.25, 32.50 और 250 पीपीएम पर, समान निरोधात्मक प्रभाव (महत्वपूर्ण नहीं) टायरोसिनेस पर इंगित किए गए थे, जब प्रसिद्ध टाइरोसिनेस अवरोधक अर्बुटिन पर सीजेएस-ईओ की टायरोसिनेस निरोधात्मक गतिविधि के साथ तुलना की गई थी।

3.4. B16F10 कोशिकाओं में मेलेनिन सामग्री पर CJS-EO का प्रभाव।

यह पुष्टि करने के लिए कि क्या सीजेएस-ईओ ने मेलेनिन उत्पादन के निषेध में योगदान दिया है, सीजेएस-ईओ की प्रत्येक एकाग्रता के साथ उपचार के बाद मेलेनिन स्राव में अंतर का विश्लेषण -एमएसएच उत्तेजना द्वारा मेलेनिन उत्पादन को बढ़ावा देने वाले वातावरण के तहत किया गया था।सीजेएस-ईओ31.25, 62.5, 125, 250, और 500 पीपीएम की सांद्रता पर उसी तरह व्यवहार किया गया था जैसे किटायरोसिनेसगतिविधि। सीजेएस-ईओ ने -एमएसएच-उपचार समूह में मेलेनोजेनेसिस को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया, और मेलेनिन की एक महत्वपूर्ण मात्रा को दबा दिया गया (चित्रा 3 (बी))।-यह सकारात्मक नियंत्रण, आर्बुटिन (चित्रा 3 (ए)) में अवलोकन के समान था। विशेष रूप से, उपचारित समूह में 32.25 पीपीएम की न्यूनतम सांद्रता पर, अनुपचारित समूह (0 पीपीएम) की तुलना में मेलेनिन की मात्रा काफी कम हो गई। इसलिए, यह निष्कर्ष निकाला गया कि सीजेएस ईओ मेलेनिन बी16 एफ10 कोशिकाओं के संश्लेषण या स्राव को प्रभावी ढंग से रोकता है। 31.25, 62.5, 125, 250, और 500 पीपीएमसीजेएस-ईओ-उपचारित समूहों में, मेलेनिन सामग्री में क्रमशः 1.1, 1.5, 2.6, 2.7 और 4.3 गुना की कमी आई, अनुपचारित समूह की तुलना में, एक प्रमुख मेलेनिन स्राव निरोधात्मक का संकेत है। प्रभाव। -ई साइटोटोक्सिसिटी टेस्ट, टायरोसिनेस इनहिबिशन टेस्ट और मेलेनिन कंटेंट टेस्ट के नतीजे बताते हैं कि सीजेएस-ईओ प्राकृतिक सामग्री के रूप में बेहद मूल्यवान है।सफेदप्रसाधन सामग्री।

3.5. आनुवंशिक जांच।

जीन का निर्धारण करने के लिएसीजेएस-ईओजो मेलेनिन बायोसिंथेसिस मार्ग में शामिल जीनों की अभिव्यक्ति को प्रभावित करके मेलेनिन बायोसिंथेसिस को रोकता है, आरटी-पीसीआर विधि का उपयोग करके एक प्रयोग किया गया था, और परिणाम चित्र 4 में दिखाए गए हैं। -एमएसएच का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था, और सीजेएस-ईओ ने निरोधात्मक प्रभाव दिखाया। सभी सांद्रता में टायरोसिनेस, टीआरपी-1, और टीआरपी-2 की अभिव्यक्ति। विशेष रूप से, सीजेएस-ईओ ने 125 पीपीएम या उससे अधिक पर 50 प्रतिशत से अधिक द्वारा टायरोसिनेस की अभिव्यक्ति को रोक दिया। हमने पाया कि की निरोधात्मक प्रभावकारिताटायरोसिनेस, टीआरपी-1 और टीआरपी-2 अभिव्यक्ति में कमी आई क्योंकि सीजेएस ईओ की एकाग्रता में वृद्धि हुई। -इस प्रयोग के परिणाम बताते हैं कि सीजेएस-ईओ के मेलानोजेनेसिस निरोधात्मक प्रभाव ने टायरोसिनेस, टीआरपी-1, और टीआरपी-2 की अभिव्यक्ति को रोकने में योगदान दिया।

3.6. प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच।

मेलेनिन बायोसिंथेसिस में शामिल प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर सीजेएस-ईओ के प्रभाव की पुष्टि पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके की गई थी, और परिणाम चित्र 5 में दिखाए गए हैं। जब सीजेएस-ईओ की तुलना -एमएसएच-उपचारित समूह के साथ की गई, जो एक नकारात्मक नियंत्रण समूह था, तो यह था पुष्टि की किसीजेएस-ईओएक निरोधात्मक प्रभाव प्रदर्शित किया; वास्तव में, CJS-EO ने tyrosinase और TRP-2 पर सबसे प्रमुख निरोधात्मक प्रभाव प्रदर्शित किया। -एमएसएच-उपचारित समूह की तुलना में, टायरोसिनेस और टीआरपी -2 के 500 पीपीएम पर निषेध की डिग्री क्रमशः 46.6 प्रतिशत और 40.7 प्रतिशत थी। हालांकि टीआरपी -1 ने कम से कम निरोधात्मक प्रभाव का संकेत दिया, लेकिन -एमएसएच-उपचारित समूह की तुलना में इसमें महत्वपूर्ण कमी देखी गई। इसलिए, प्रोटीन विश्लेषण ने वंशावली विश्लेषण के समान प्रवृत्ति दिखाई, और यह पुष्टि की गई कि CJS-EO ने प्रेरित कियाटायरोसिनेस, टीआरपी-1, और टीआरपी-2 मेलेनिन कमी को प्रेरित करने के लिए।

4। चर्चा

टायरोसिनेसएंजाइमी ऑक्सीडेटिव मार्ग के माध्यम से मेलेनिन उत्पादन में शामिल एक एंजाइम है, जो त्वचा, बालों और आंखों के रंग के साथ-साथ कुछ खाद्य पदार्थों के भूरे रंग को निर्धारित करता है [29]। मेलेनिन हाइपरपिग्मेंटेशन [30] से जुड़े डर्माटोलोगिक विकारों के उपचार के लिए क्लिनिकल मेडिसिन में एंटीट्रोसिनसेएक्टिविटी प्रदर्शित करने वाले रासायनिक एजेंटों का उपयोग किया गया है। मेलेनिन उत्पादन कुछ हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं में योगदान कर सकता है जो घातक कैंसर के लिए विशिष्ट हैं [31]। इसलिए, एंटीटायरोसिनेस पदार्थ त्वचा कैंसर के उपचार की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। हाल के वर्षों में, रासायनिक या सिंथेटिक यौगिकों के बजाय प्राकृतिक उत्पादों के उपयोग ने बढ़ती रुचि प्राप्त की है क्योंकि वे अधिक किफायती, पर्यावरण के अनुकूल और सुरक्षित हैं [32]। इसके अलावा, हरित प्रौद्योगिकी और कम लागत वाले कच्चे माल का अनुसंधान और विकास महत्वपूर्ण है। उद्योग के साथ-साथ पौधों के संसाधनों के उपयोग में सुधार के लिए। हाल ही में, कुछ पौधों की एंटीटायरोसिनेस गतिविधि की सूचना मिली है [33]। हालांकि, प्राकृतिक पौधों के आवश्यक तेलों से संबंधित आंकड़े दुर्लभ हैं। इसलिए, उच्च एंटीटाइरोसिनेस गतिविधि वाले पौधों के आवश्यक तेलों की पहचान ने महत्वपूर्ण रुचि प्राप्त की है। -ई रंजकता के एटियलजि को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। मेलेनिन जैवसंश्लेषण टीआरपी-1 और टीआरपी-2 [34] जैसे मेलानोसाइट-विशिष्ट एंजाइमों द्वारा उत्प्रेरित होता है।टायरोसिनेसमेलानोसाइट मेलेनिनबायोसिंथेसिस के लिए महत्वपूर्ण है और कई दशकों [34] के लिए जाना जाता है। इसलिए, रंजकता के उपचार के लिए टायरोसिनेस एक महत्वपूर्ण सूचकांक है। हमारे अध्ययन में, CJS-EO ने मेलेनिनसिंथेसिस को कम किया और एंटीटायरोसिनेस गतिविधि को प्रभावित किया; इसलिए, हमने निष्कर्ष निकाला कि सीजेएस-ईओ द्वारा एंटीमेलानोजेनेसिस को अन्य एंजाइमों (टीआरपी -1 और टीआरपी -2) के साथ जोड़ा जा सकता है। उच्च एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि प्रदर्शित करने के लिए वाष्पशील पदार्थों की सूचना दी गई है [35]। वाष्पशील के रूप में, CJS-EO को तीखी गंध की विशेषता है। इसे पौधों द्वारा द्वितीयक मेटाबोलाइट्स के रूप में संश्लेषित किया जाता है और व्यापक रूप से इसके जीवाणुनाशक, विषाणुनाशक, कवकनाशी, एंटीकैंसर, एंटीऑक्सिडेंट और एंटीडायबिटिक गतिविधियों के कारण उपयोग किया जाता है [36]। -ई सीजेएस-ईओ इस अध्ययन में जांच की गई मुख्य रूप से हेक्सामेथिलसाइक्लोट्रिसिलोक्सेन से बना था, जो कुल रासायनिक सामग्री का 42.36 प्रतिशत था। हेक्सामेथिलसाइक्लोट्रिसिलोक्सेन युक्त टॉक्सिकोडेंड्रोन वर्निसिफ्लुम को केंद्रीय, रोगाणुरोधी और एंटीट्यूमर गतिविधियों सहित विभिन्न जैविक और औषधीय गतिविधियों को प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है [37]। हमारे अध्ययन में, सीजेएस-ईओ की उच्च सांद्रता ने मेलानोसाइट्स पर केवल मामूली साइटोटोक्सिक प्रभाव का संकेत दिया। इसलिए, CJS-EO का -MSH- प्रेरित B16F10 सेल प्रसार पर निरोधात्मक प्रभाव देखा गया। -रेसल्ट्स ने दिखाया कि सीजेएस-ईओ के साथ दिखावा एक खुराक पर निर्भर तरीके से एमएसएच-प्रेरित सेल प्रसार को कम करता है (चित्र 3), और ये परिणाम एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले प्योररब्यूटिन के समान थे। पारंपरिक चिकित्सा में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश प्राकृतिक आवश्यक तेल में, शुद्ध यौगिकों के बजाय जटिल यौगिकों वाले अर्क का उपयोग किया जाता है। इन प्राकृतिक आवश्यक तेलों में आमतौर पर अत्यधिक विशिष्ट जैव-सक्रियताओं के साथ अस्थिरता वाले यौगिक नहीं होते हैं, लेकिन व्यापक अंतःक्रियाओं के साथ अस्थिरता यौगिक होते हैं [38]। इसलिए, सीजेएस-ईओ के लिए मुश्किल है, जिसमें कई घटक होते हैं, शुद्ध अर्बुटिन की तुलना में उच्च एंटीमेलानोजेनेसिस प्रभाव होता है। भविष्य में, इसमें निहित वाष्पशील घटकों को अलग करना आवश्यक हैसीजेएस-ईओऔर अलग किए गए एकल घटक पर एंटीमेलानोजेनेसिस प्रभाव का अध्ययन करें। हमारे परिणामों के आधार पर, गीला रूप से निष्कर्ष निकाला है कि सीजेएस-ईओ टीआरपी जैसे हानिकारक कारकों से मेलानोसाइट्स को रोक सकता है -1 (आंकड़े 4 और 5)।वांइसलिए, हमने मान लिया कि हेक्सामेथिलसाइक्लोट्रिसिलोक्सेन सीजेएस-ईओ में प्रमुख जैविक रूप से सक्रिय यौगिक था। के बारे में मौजूदा अध्ययनसफेदसीजेएस-ईओ की संपत्ति अपर्याप्त है; इसलिए, इसे मुख्य सामग्री से संबंधित भविष्य के अध्ययनों में बुनियादी डेटा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जो कि सफेद करने की प्रभावशीलता प्रदर्शित करते हैं।

5। निष्कर्ष

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, बी 16 एफ 10 मेलेनोमा कोशिकाओं में मेलेनिन उत्पादन को रोकने में सीजेएस-ईओ की प्रभावकारिता की रिपोर्ट करने वाला यह पहला अध्ययन है। हमारी टिप्पणियों ने संकेत दिया कि सीजेएस-ईओइनहिबिटेड-एमएसएच-प्रेरित मेलानोजेनेसिस के माध्यम सेटायरोसिनेसनिष्क्रियता और B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं में मेलेनिन जैवसंश्लेषण में शामिल प्रोटीन की अभिव्यक्ति का एक साथ दमन।सीजेएस-ईओसुरक्षित होने के लिए जाना जाता है, और हमने इस अध्ययन में इसकी पुष्टि की है कि यह नॉनसाइटोटॉक्सिक है।वांइसलिए, CJS-EO को संभावित रूप से एक प्रभावी त्वचा के रूप में नियोजित किया जा सकता है-सफेदपूरक और वैकल्पिक चिकित्सा-आधारित अरोमाथेरेपी के भविष्य के विकास के लिए एजेंट।