गैर-आक्रामक गुर्दा प्रत्यारोपण निगरानी के लिए एक मूत्र सामान्य अस्वीकृति मॉड्यूल (यूसीआरएम) स्कोर

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सार

एलोग्राफ़्ट बायोप्सी में व्यक्त 11 जीनों से युक्त एक सामान्य अस्वीकृति मॉड्यूल (सीआरएम) को पहले तीव्र अस्वीकृति (एआर) के लिए बायोमार्कर के रूप में काम करने की सूचना दी गई थी, जो भ्रष्टाचार की चोट की सीमा से संबंधित है, और भविष्य में एलोग्राफ़्ट क्षति की भविष्यवाणी करता है। हमने किडनी ट्रांसप्लांट के मरीजों के यूरिन सेल पेलेट पर इस जीन पैनल के इस्तेमाल की जांच की। बायोप्सी-पुष्टि तीव्र अस्वीकृति, सीमा रेखा एआर (बीएआर), बीके वायरस नेफ्रोपैथी (बीकेवीएन), और सामान्य प्रोटोकॉल बायोप्सी (एसटीए) के साथ स्थिर किडनी ग्राफ्ट वाले रोगियों से मूत्र कोशिका तलछट एकत्र किए गए थे, मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला का उपयोग करके इन 11 जीनों की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया था। प्रतिक्रिया (क्यूपीसीआर)। हमने इन 11 सीआरएम जीनों को उनकी बहुतायत, स्वसंबंध और व्यक्तिगत अभिव्यक्ति स्तरों के लिए मूल्यांकन किया, एसटीए की तुलना में 10/11 जीन की अभिव्यक्ति को एआर में ऊंचा किया गया। संवेदनशीलता=93.6 प्रतिशत, विशिष्टता=97.6 प्रतिशत)। एयू सीआरएम स्कोर, अभिव्यक्ति के स्तर के ज्यामितीय माध्य के आधार पर, एआर को एसटीए से उच्च सटीकता (एयूसी=0 .9886) के साथ अलग कर सकता है और विशेष रूप से ट्यूबलर शोष, ग्लोमेरुलोस्केलेरोसिस के बजाय ट्यूबलाइटिस और अंतरालीय सूजन के हिस्टोलॉजिक उपायों के साथ सहसंबद्ध है। अंतरंग प्रसार, ट्यूबलर टीकाकरण, या तीव्र ग्लोमेरुलिटिस। यह मूत्र जीन अभिव्यक्ति-आधारित स्कोर एआर की गैर-आक्रामक और मात्रात्मक निगरानी को सक्षम कर सकता है।

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परिचय

किडनी प्रत्यारोपण (KTx) किसी भी कारण से अंतिम चरण के गुर्दे की बीमारी (ESRD) के उपचार के लिए पसंदीदा तरीका है [1]। जबकि यह चिकित्सीय दृष्टिकोण दुनिया भर में एक नियमित अभ्यास बन गया है, जीवन और अस्तित्व की रोगी गुणवत्ता में काफी सुधार [2], एलोग्राफ़्ट अस्वीकृति की प्रतिरक्षा जीव विज्ञान की बेहतर समझ और उपन्यास के आगमन के बावजूद दीर्घकालिक किडनी एलोग्राफ़्ट परिणामों में अपेक्षित सुधार नहीं हुआ है। और अधिक शक्तिशाली प्रतिरक्षादमनकारी एजेंट [3]। लगातार और खराब ग्राफ्ट के जीवित रहने का प्रमुख कारण गैर-आक्रामक रूप से ग्राफ्ट प्रतिरक्षा चोट के बोझ को निर्धारित करने में असमर्थता है और वास्तविक कार्यात्मक गिरावट और ऊतकीय चोट से पहले तीव्र अस्वीकृति की भविष्यवाणी करना है। वास्तव में, जबकि यह सर्वविदित है कि केटीएक्स रोगियों को लगातार प्रतिरक्षा और गैर-प्रतिरक्षा संबंधी चोटों से अवगत कराया जाता है [4, 5], आवधिक केटीएक्स निगरानी सीरम क्रिएटिनिन (6, जेड) और छिटपुट केटीएक्स निगरानी जैसे एलोग्राफ़्ट डिसफंक्शन के असंवेदनशील सरोगेट मार्करों पर निर्भर है। सीरम क्रिएटिनिन [8] की गड़बड़ी की अनुपस्थिति में उप-नैदानिक ​​​​हिस्टोलॉजिकल ग्राफ्ट चोट का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल एलोग्राफ़्ट बायोप्सी पर आधारित है। हालांकि केवल सीरम क्रिएटिनिन पर आधारित ग्राफ्ट डिसफंक्शन का आकलन गैर-विशिष्ट, स्थापित, एलोग्राफ़्ट क्षति के लिए संवेदनशीलता है, तीव्र अस्वीकृति (एआर) के निदान के लिए इसकी कम विशिष्टता है, क्योंकि सीरम क्रिएटिनिन में वृद्धि अन्य कारणों से हो सकती है जो सीधे तौर पर एलोग्राफ़्ट अस्वीकृति से संबंधित नहीं हैं, जैसे कि इम्यूनोसप्रेसिव (आईएस) दवा से संबंधित नेफ्रोटॉक्सिसिटी, तीव्र ट्यूबलर नेक्रोसिस, संक्रमण , और इंटरस्टिशियल फाइब्रोसिस और ट्यूबलर एट्रोफी (आईएफटीए) इसके अलावा, जबकि निगरानी बायोप्सी के उपयोग को निदान के लिए स्वर्ण मानक उपकरण के रूप में पोस्ट किया गया है। लॉगराफ्ट घाव, यह दृष्टिकोण प्रक्रिया रुग्णता (रक्तस्राव का जोखिम) के साथ महंगा, आक्रामक है; प्रक्रिया जिसमें बेहोश करने की क्रिया की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से बाल चिकित्सा केटीएक्स रोगियों के लिए) [9], अंतर-संचालक रीड वेरिएबिलिटी से भरा होता है, और अक्सर फोकल हिस्टोलॉजिकल चोट के खराब प्रतिनिधि होते हैं, इसलिए, गैर-आक्रामक जैविक मार्करों का उपयोग जो सटीक रूप से अनुमान लगा सकते हैं और बोझ को माप सकते हैं सटीक KTx निगरानी [10-12] के लिए एलोग्राफ़्ट में प्रतिरक्षा क्षति एक महत्वपूर्ण प्रगति होगी।

केटीएक्स रोगियों के मूत्र में प्रोटिओमिक, आरएनए और माइक्रोआरएनए बायोमार्कर की पूछताछ को हमारे समूहों और अन्य लोगों द्वारा प्रदर्शित किया गया है[13-17] गुर्दे के एलोग्राफ़्ट की धारावाहिक निगरानी के लिए एक इष्टतम जैविक तरल पदार्थ है क्योंकि यह एक अल्ट्राफिल्ट्रेट है किडनी और किडनी ग्राफ्ट में पाई जाने वाली जैविक प्रक्रियाओं और सूजन संबंधी बोझ को प्रतिबिंबित करता है [18]। कई अध्ययनों के बावजूद, जिन्होंने किडनी प्रत्यारोपण में एआर के विश्लेषण के लिए एक गैर-आक्रामक नैदानिक ​​दृष्टिकोण के रूप में मूत्र बायोमार्कर का मूल्यांकन किया है, एकल बायोमार्कर जैसे कि विशेष केमोकाइन और रिसेप्टर्स जैसे CXCR3, CXCL9, या CXCL10 पर विशेष ध्यान दिया गया है [{{ 6}}] विभिन्न केटीएक्स रोगियों में एआर की आणविक जटिलता और विविधता को पकड़ना मुश्किल बनाते हैं। चिकित्सीय हस्तक्षेप [25, 26] के बाद एआर की संभावित निगरानी और भ्रष्टाचार की चोट की वसूली के लिए प्रयोग करने योग्य तरीके से चोट के बोझ को मापने के लिए इस विषमता को पकड़ना आवश्यक है।

इस अध्ययन में, हम 11 जीन [27] के एक सामान्य अस्वीकृति मोड-यूले (सीआरएम) का उपयोग करने से प्राप्त ज्ञान को लागू करते हैं, मूल रूप से चार अलग-अलग प्रकार के ठोस से बायोप्सी नमूनों के सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रत्यारोपण ऊतक माइक्रोएरे डेटासेट के विस्तृत मेटा-विश्लेषण का उपयोग करके विकसित किया गया है। अंग। ऊतक (tCRM) में CRM जीन सभी AR रोगियों में अधिक व्यक्त किए गए थे, भले ही अंग के प्रकार, इम्युनोसुप्रेशन प्रोटोकॉल में अंतर, या जीन अभिव्यक्ति की पूछताछ करने वाले प्लेटफार्मों में अंतर। एक संयुक्त जीन-स्कोर (tCRM स्कोर) के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण द्वारा निर्धारित एक मात्रात्मक सीमा ने मानव किडनी अलोग्राफ़्ट के 8 स्वतंत्र समूहों (n=236 नमूनों) में ऊतक जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षरों के क्रॉस-सत्यापन द्वारा एआर की उपस्थिति की सटीक भविष्यवाणी की। बायोप्सी [27]। tCRM स्कोर को qPCR द्वारा KTx बायोप्सी नमूनों पर एक अलग अध्ययन में अलग-अलग जीन-सेट थ्रेशोल्ड [28] के साथ AR और पुरानी एलोग्राफ़्ट चोट (CAl) दोनों के निदान के रूप में मान्य किया गया था। इसके अलावा, सीआरएम जीन के इस सेट को क्रोनिक लंग एलोग्राफ़्ट डिसफंक्शन (सीएलएडी) [29] के साथ फेफड़े के प्रत्यारोपण रोगियों से बायोप्सीड ऊतक के एक स्वतंत्र सेट में मान्य किया गया था।

इस अध्ययन में, हम एआर और अन्य प्रतिरक्षा-मध्यस्थता चोटों के गैर-आक्रामक निदान के लिए, ज्ञात ऊतक विज्ञान के साथ एलोग्राफ़्ट बायोप्सी के साथ जोड़े गए केटीएक्स रोगियों के मूत्र के नमूनों पर उपयोग के लिए सीआरएम जीन सेट का आकलन करते हैं। इसके अलावा, हम एक मूत्र सीआरएम (यूसीआरएम) स्कोर विकसित करते हैं जो एसटीए और एआर रोगियों के बीच सटीक रूप से भेदभाव करता है। हम इस स्कोर को ट्यूबुलिटिस और अंतरालीय सूजन के ऊतक विज्ञान स्कोर के साथ सहसंबंधित करके बार का पता लगाने में इस स्कोर की नैदानिक ​​​​क्षमता का मूल्यांकन करते हैं।

CSITANCHE के प्रभाव: प्रतिरक्षा में सुधार

सामग्री और तरीके

मूत्र के नमूने और अध्ययन दल

2000 और 2011 के बीच स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी में नामांकित KTx प्राप्तकर्ताओं के बायोबैंक मूत्र के नमूने (n=1760) और 2014 और 2016 के बीच नामांकित UCSF मेडिकल सेंटर को अध्ययन में शामिल किया गया था। अध्ययन को कैलिफोर्निया सैन फ्रांसिस्को, सीए विश्वविद्यालय की संस्थागत समीक्षा बोर्ड और नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी रोगियों ने हेलसिंकी की घोषणा के पूर्ण पालन में, अनुसंधान में भाग लेने के लिए लिखित सूचित सहमति प्रदान की। रिपोर्ट की जा रही नैदानिक ​​और अनुसंधान गतिविधियां इस्तांबुल की घोषणा के सिद्धांतों के अनुरूप हैं, जैसा कि अंग तस्करी और प्रत्यारोपण पर्यटन पर इस्तांबुल की घोषणा में उल्लिखित है। एआर के लिए यूसीआरएम थ्रेशोल्ड स्थापित करने में उपयोग किए गए मूत्र के नमूनों के लिए, 178 मूत्र के नमूनों की पहचान युग्मित किडनी एलोग्राफ़्ट बायोप्सी के साथ की गई थी, जिसमें या तो Banff श्रेणीबद्ध AR [30,31] या कोई चोट/स्थिर (STA) ग्राफ्ट (Eig 1) की स्पष्ट रूप से परिभाषित विकृतियाँ नहीं थीं। इसके अलावा, हमने बीके वायरल नेफ्रोपैथी में यूसीआरएम परख के लिए हस्ताक्षर का भी मूल्यांकन किया, जो एआर के निदान के लिए एक महत्वपूर्ण कन्फ्यूडर है और अक्सर एलोग्राफ़्ट बायोप्सी पर महत्वपूर्ण सूजन के साथ प्रस्तुत करता है। कुल मिलाकर, 28 नमूनों को कम सामग्री और खराब गुणवत्ता वाले आरएनए से संबंधित क्यूसी मुद्दों के कारण खारिज कर दिया गया था, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिरक्षा-मध्यस्थता केटीएक्स चोट के क्रॉस-सेक्शनल विश्लेषण के लिए 150 व्यक्तियों के 150 मूत्र नमूनों की अंतिम गणना हुई। मूत्र संग्रह के समय प्रत्येक मूत्र के नमूने का एक बायोप्सी के साथ मिलान किया गया था, जिसका मूल्यांकन स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय (रिचर्ड सिबली) या यूसीएसएफ (ज़ोल-टैन लाज़िक) में एक केंद्रीय कर्मचारी रोगविज्ञानी द्वारा किया गया था।

रोगी की विशेषताएं

150 unique urine samples were assessed for the uCRM assay in 150 unique kidney transplant patients. Baseline clinical and demographic variables by AR, bAR, BKVN, or STA phenotype are shown in Table1, There were no significant differences between the groups in the demographic variables, except in recipient age (p= 0.025) and in donor-source (p=0.0008). These samples were used in cross-sectional analyses for modeling of gene expression data and subsequent development and validation of the uCRM threshold for biopsy-proven AR. Samples were collected from both pediatric (n=94) and adult (n=56)patients to enable a model-independent of recipient age or baseline immunosuppression. Based on the matched biopsy diagnosis, urine samples were categorized in the following categories: AR(n=64;45 biopsies met criteria for Banff confirmed AR with >i2,t2, and infiltration by >4 मोनोन्यूक्लियर सेल/ट्यूबलर क्रॉस-सेक्शन, जबकि 19 आईएल/आई2 और टी0/t1 के साथ बॉर्डरलाइन एआर के लिए मानदंड और 1-4 मोनोन्यूक्लियर सेल/ट्यूबलर क्रॉस-सेक्शन द्वारा घुसपैठ), एसटीए (एन { {8}}), बीके वायरस नेफ्रैटिस (एन =43), मरीजों को टैक्रोलिमस और माइकोफेनोलेट मोफेटिल पर आधारित कैल्सीनुरिन-इनहिबिटर आईएलएस रेजिमेन मिला, स्टेरॉयड के साथ या बिना, और इंडक्शन थेरेपी या तो थाइमोग्लोबुलिन या एंटी-आईएल के साथ {{ 12}} रिसेप्टर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (डेक्लिज़ुमैब या बेसि। इन्फ्लिक्सिमाब) [32]। प्रत्यारोपण के बाद 731 दिनों के दौरान मूत्र के नमूने प्राप्त किए गए (रेंज 169-1335 दिन)।

चोट फेनोटाइप की परिभाषा

All kidney biopsies were blindly and centrally analyzed at each institution by staff pathologists (RS and ZL)and were graded by the Banff dassification[31,33] for acute rejection.Intragraft C4d stains were performed [34] to assess for acute humoral rejection(AHR)[35]. Transplant injury was defined as>सीरम क्रिएटिनिन में अपने पिछले स्थिर-राज्य बेसलाइन मूल्य से 20 प्रतिशत की वृद्धि और एक संबद्ध बायोप्सी जिसे या तो एआर या बीकेवीएन के रूप में वर्गीकृत किया गया था। एआर को न्यूनतम पर परिभाषित किया गया था, बैनफ स्कीमा के अनुसार, एक ट्यूबलिटिस स्कोर 1 से अधिक या उसके बराबर होता है। बीचवाला सूजन स्कोर सीडी और डीएसए नकारात्मक दोनों के साथ 1 से अधिक या बराबर। Tcell की मध्यस्थता वाले AR (TCMR) और एंटीबॉडी-मध्यस्थता अस्वीकृति (ABMR) दोनों मामलों को प्रेरित किया गया था, हालांकि सभी देखे गए ABMR मामलों में TCMR और ABMR का मिश्रित फेनोटाइप था, क्योंकि शुद्ध ABMR का पालन कम जोखिम वाले, असंवेदनशील समूहों में शायद ही कभी देखा जाता है। टीसीएमआर के कुछ मामलों में सीमा रेखा परिवर्तन (बीएआर) देखे गए, जो मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की घुसपैठ की विशेषता है।<25% of="" the="" parenchyma)or="" foci="" of="" mild="" tubulitis(1-4="" mononuclear="" cells/tubular="" cross-section),="" and="" for="" purposes="" of="" molecular="" correlation="" analysis,="" these="" have="" been="" shown="" as="" bar,="" as="" the="" burden="" of="" histological="" inflammation="" was="" overall="" lower="" for="" these="" biopsy="" samples.="" bkvn="" was="" defined="" as="" the="" positivity="" of="" polyomavirus="" pcr="" in="" peripheral=""><1000-28,800,000), together="" with="" a="" positive="" sv40="" stain="" in="" the="" concomitant="" renal="" allograft="" biopsy.="" normal="" (sta)="" allografts="" were="" defined="" by="" an="" absence="" of="" significant="" injury="" pathology="" on="" the="" 6-month="" protocol="" biopsy,="" as="" defined="" by="" banff="" schema,="" stable="" graft="" function,="" no="" proteinuria,="" and="" no="">

अंजीर 1. अध्ययन का नमूना चयन और अध्ययन योजनाबद्ध। 2000 और 2016 के बीच 1,760 मूत्र के नमूने एकत्र किए गए थे।

जिनमें से 643 में मैचिंग बायोप्सी डेटा था। इन 643 में से 178 में एआर, बीएआर, बीकेवीएन या एसटीए के सुपरिभाषित फेनोटाइप थे।

आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण और क्यूपीसीआर मात्रा का ठहराव के बाद, 28 नमूनों ने क्यूए/क्यूसी पास नहीं किया, 150 को छोड़कर

सांख्यिकीय विश्लेषण और मॉडलिंग के लिए नमूने।

मूत्र संग्रह, प्रसंस्करण, कुल आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण, और क्यूपीसीआर

बायोप्सी प्रक्रिया से पहले और एआर के लिए किसी भी उपचार गहनता से पहले किडनी प्रत्यारोपण रोगियों से मूत्र (50 एमएल; बाँझ कंटेनर) एकत्र किया गया था। हमारे पहले बताए गए प्रोटोकॉल [36] के बाद मूत्र कोशिका तलछट से आरएनए निकाला गया था। संक्षेप में, मूत्र कोशिकाओं को 200 मिनट के लिए 2000xg पर 50-एमएल मूत्र के नमूने को सेंट्रीफ्यूज करके प्राप्त किया गया था। आरएनए का उपयोग करके मूत्र कोशिका छर्रों से निकाला गया था। आरनेसी प्लस माइक्रो किट (क्यूजेन, वालेंसिया, सीए)। आरएनए गुणवत्ता का मूल्यांकन नैनोड्रॉप एनडी -2000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (थर्मोफिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए) के साथ 260/280 अनुपात के साथ किया गया था। सुपरस्क्रिप्ट वीआईएलओ "मास्टर मिक्स (इनविट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए) का उपयोग करके निकाले गए आरएनए के 50 एनजी का उपयोग करके सीडीएनए संश्लेषण किया गया था। क्यूपीसीआर को कुल आरएनए के 50 एनजी से संश्लेषित सीडीएनए पर किया गया था, फिर 1.56 एनजी सीडीएनए को विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन और नमूने के माध्यम से संसाधित किया गया था। मल्टीप्लेक्स में 1l uCRM जीन के लिए पूल किए गए Taqman assays के साथ कमजोर पड़ने, Taqman PreAmp मास्टर मिक्स (ABI) से 5ul अंतिम मात्रा के साथ, एक थर्मल साइक्लर में 18 चक्रों के लिए, फिर डीएनए सस्पेंशन बफर (TEKnova, CA) के साथ पतला। माइक्रोफ्लुइडिक qPCR था 96.96 गतिशील सरणियों (फ्लुइडिगम, साउथ सैन फ्रांसिस्को, सीए-विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन से पतला नमूने के 2.25 उल का उपयोग करके, प्रत्येक जीन प्रतिलेख (एस 1टेबल), ताकमान यूनिवर्सल मास्टर मिक्स (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) के लिए ताकमान एसेज़ (एबीआई) के साथ प्रदर्शन किया। फोस्टर सिटी, सीए) और लोडिंग रिएजेंट (फ्लुइडिग्म), एचएक्स आईएफसी कंट्रोलर के माध्यम से चिप को भड़काना और लोड करके और बायोमार्क (फ्लुइडजीएम) सिस्टम में क्यूपीसीआर का प्रदर्शन करके। आरएनए अभिव्यक्ति की सापेक्ष मात्रा की गणना तुलनात्मक साइ का उपयोग करके की गई थी। क्ली थ्रेशोल्ड (सीटी) विधि। राइबोसोमल आरएनए अंतर्जात संदर्भ और सार्वभौमिक आरएनए (एगिलेंट इंक, सांता क्लारा, सीए) का उपयोग करके अभिव्यक्ति मूल्यों को सामान्य किया गया।

सांख्यिकीय

सभी qPCR assays डुप्लिकेट में चलाए गए थे। सभी डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। प्रति फेनोटाइप सीआरएम जीन के कॉम-पेरिसन के लिए, गीसर-ग्रीनहाउस सुधार के साथ एक मिश्रित-प्रभाव वाले मॉडल का उपयोग किया गया था, जिसमें बेनियामिनी, क्राइगर और येकुटिली की दो-चरण रैखिक-चरण प्रक्रिया का उपयोग करके कई तुलना सुधार किए गए थे। मॉर्फियस (ब्रॉड इंस्टीट्यूट) में पियर्सन सहसंबंध और श्रेणीबद्ध डस्टिंग का प्रदर्शन किया गया। मशीन लर्निंग प्रेडिक्शन मॉडल के लिए, डेटा को एक प्रशिक्षण सेट (80 प्रतिशत) और एक परीक्षण सेट (20 प्रतिशत) में विभाजित किया गया था। सबसे सटीक यूसीआरएम स्कोर कट-ऑफ निर्धारित करने के लिए परीक्षण सेट पर मान्य एक निर्णय वृक्ष वर्गीकरण मॉडल का उपयोग किया गया था। रैंडम फ़ॉरेस्ट (VSURF) का उपयोग करते हुए चर चयन का उपयोग AR y STA को वर्गीकृत करने के साथ-साथ व्यक्तिगत जीन महत्व का मूल्यांकन और रैंक करने के लिए किया गया था। रैंडम फ़ॉरेस्ट वैरिएबल महत्व आउटपुट को वैरिएबल (जीन) के मॉडल की औसत प्रतिशत कमी की अशुद्धि के रूप में परिभाषित किया गया है (यादृच्छिक रूप से अनुमत) मॉडल से बाहर रखा गया था। गणित 11.3 (वोल्फ्राम रिसर्च, शैंपेन। आईएल) में वितरित स्टोकेस्टिक पड़ोसी एम्बेड-डिंग एल्गोरिदम (टी-एसएनई) का उपयोग करके फेनोटाइप पृथक्करण की कल्पना करने के लिए अनसुनी डस्टिंग किया गया था। CRM जीन का नेटवर्क विश्लेषण GeneMANIA [37] का उपयोग करके किया गया था। जनसांख्यिकीय चर पर आंकड़े असतत के लिए ची-स्क्वायर विश्लेषण और आईएमपी 14.2 (एसएएसइंस्टीट्यूट, कैरी, एनसी) में निरंतर चर के लिए क्रुस्कल-वालिस परीक्षण का उपयोग करके किए गए थे। जब तक अन्यथा न कहा जाए। अन्य सभी विश्लेषण प्रिज्म 8.0.1 (ग्राफपैड, कार्ल्सबैड, सीए) के साथ किए गए और देखे गए।

अध्ययन की स्वीकृति

अध्ययन को स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी मेडिकल स्कूल और यूसीएसएफ मेडिकल सेंटर दोनों की नैतिक समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी वयस्क रोगियों और गैर-वयस्क रोगियों के माता-पिता/अभिभावकों ने हेलसिंकी की घोषणा के पूर्ण पालन में, अनुसंधान में भाग लेने के लिए लिखित सूचित सहमति प्रदान की। रिपोर्ट की जा रही नैदानिक ​​और अनुसंधान गतिविधियां इस्तांबुल की घोषणा के सिद्धांतों के अनुरूप हैं, जैसा कि अंग तस्करी और प्रत्यारोपण पर्यटन पर इस्तांबुल की घोषणा में उल्लिखित है।

CSITANCHE के प्रभाव: प्रतिरक्षा में सुधार

परिणाम

एआर, बार, बीकेवीएन और एसटीए फेनोटाइप वाले सभी 150 केटीएक्स प्राप्तकर्ताओं के लिए आधारभूत नैदानिक ​​और जनसांख्यिकीय चर तालिका 1 में दिखाए गए हैं।

सापेक्ष बहुतायत, और murine सेल तलछट में CRM जीन अभिव्यक्ति का सहसंबंध

सापेक्ष प्रचुरता। मूत्र तलछट में सीआरएम जीन टेप के सापेक्ष बहुतायत को निर्धारित करने के लिए, चक्र थ्रेशोल्ड (सीटी) मूल्यों का उपयोग बहुतायत के मीट्रिक के रूप में किया गया था। Ct मान जितना कम होगा, CRM जीनों में इसकी बहुतायत उतनी ही अधिक होगी। 11 सीआरएम जीनों में, BASP1 मूत्र कोशिका तलछट में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रतिलेख था। BASP1 के बाद TAP1, PSMB9, और ISG20 4 शीर्ष प्रचुर मात्रा में प्रतिलेखों के रूप में थे। CRM जीन-सेट में मूत्र तलछट में LCK और CD6 कम से कम प्रचुर मात्रा में प्रतिलेखों में से थे। चूँकि Ct मान 14 के निम्नतम Ct मान से लेकर उच्चतम Ct मान 20 तक था, इसलिए BASP1 और CD6 जीन लिपियों के बीच 64- गुना अंतर था, जिसमें CD6 सबसे कम प्रचुर मात्रा में प्रतिलेख था।

अंजीर 2. मूत्र में सीआरएम जीन की प्रचुरता के सापेक्ष बहुतायत और सहसंबंध और गुर्दा प्रत्यारोपण के विभिन्न नैदानिक ​​फेनोटाइप में सीआरएम जीन की अभिव्यक्ति। ए। पियरसन सहसंबंध मैट्रिक्स मूत्र कोशिका तलछट में उनकी अभिव्यक्ति में 11 सीआरएम जीनों के बीच सहसंबंध का प्रदर्शन करता है। वर्ग का आकार सहसंबंध की ताकत के एक दृश्य संकेतक के रूप में कार्य करता है। बी. एआर, बीएआर, बीकेवीएन, और एसटीए में सीआरएम जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करते हुए फेनोटाइप द्वारा पर्यवेक्षित क्लस्टरिंग के साथ हीटमैप। सी. एआर, बार, बीकेवीएन, और एसटीए मूत्र सेल गोली में सीआरएम जीन के वितरण को दर्शाने वाले वायलिन प्लॉट। इंगित करता है कि एआर बनाम एसटीए कई तुलनाओं के बाद महत्वपूर्ण था। # इंगित करता है कि कई तुलनाओं के बाद बार बनाम एसटीए महत्वपूर्ण था। अतिरिक्त आँकड़े तालिका 2 में उपलब्ध हैं।

सीआरएम जीन जीन के बीच जीन अभिव्यक्ति का सहसंबंध।

इसके बाद, हमने 11 सीआरएम जीनों के बीच जीन अभिव्यक्ति के सहसंबंध का मूल्यांकन किया। सहसंबंध बहुत कमजोर (सीएक्ससीएल9 और एनकेजी7 के लिए आर=-0.17 और आर=-0.10 सीएक्ससीएल10 और आरयूएनएक्स3) से लेकर बहुत मजबूत (आर=0.77 INPP5D और TAP1 के लिए और CD6 और LCK के लिए समान मान)। यद्यपि CXCL9 और CXCL10 केमोकाइन के एक ही वर्ग में हैं, उनके बीच जीन अभिव्यक्ति सहसंबंध केवल मध्यम (r=0.46) था। सहसंबंध मैट्रिक्स की चित्रमय प्रस्तुति चित्र 2क में प्रस्तुत की गई है। पर्यवेक्षित क्लस्टरिंग का उपयोग करके उत्पन्न एक हीटमैप एसटीए फेनोटाइप (छवि 2 बी) की तुलना में एआर, बीएआर और बीकेवीएन में सीआरएम जीन के जीन अभिव्यक्ति मूल्यों में काफी वृद्धि दर्शाता है।

बायोप्सी-पुष्टि एआर और बीकेवीएन के साथ मूत्र तलछट में यूसीआरएम जीन अभिव्यक्ति

एआर और बार में सीआरएमजीन की जीन अभिव्यक्ति। इसके बाद, हमने एआर, बीएआर, बीकेवीएन और एसटीए में उनकी सापेक्ष अभिव्यक्ति के लिए 11 सीआरएम जीनों में से प्रत्येक की जीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया। विश्लेषण के परिणामों का सारांश तालिका 2 और अंजीर 2C.1 में प्रस्तुत किया गया है। एसटीए से मूत्र तलछट की तुलना में 11 जीनों में से एआर मूत्र तलछट में काफी वृद्धि हुई थी। हालाँकि, केवल पाँच CRM जीन (Cd6, Cxcll0, Cxd9, Nkg7, और Psmb9) को STA की तुलना में bAR नमूनों में महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किया गया था और bAR समूह में उनकी अभिव्यक्ति Banff श्रेणीबद्ध AR समूह की तुलना में अपेक्षाकृत कम थी, यह उजागर करते हुए कि uCRM जीन कर सकते हैं एलोग्राफ़्ट ईआईजी 2सी के भीतर भड़काऊ बोझ को दर्शाता है।

तालिका 2. विभिन्न फेनोटाइप में सीआरएम जीन के जीन अभिव्यक्ति स्तर

BKVN में CRMजीन की जीन अभिव्यक्ति। CD6, CXCL10, CXCL9, LCK, NKG7, और PSMB9 की अभिव्यक्ति को STA रोगियों के नमूनों की तुलना में BKVN के रोगियों के साथ मूत्र के नमूनों में अलग-अलग विनियमित किया गया था। बीकेवीएन और एसटीए नमूनों के बीच सांख्यिकीय रूप से भिन्न जीन अभिव्यक्ति मूल्यों वाले छह जीनों में से केवल एनकेजी7 की अभिव्यक्ति बीकेवीएन मूत्र में काफी कम थी।

गुर्दा प्रत्यारोपण अस्वीकृति की पहचान करने के लिए एक मूत्र सीआरएम (यूसीआरएम) जीन अभिव्यक्ति स्कोर का निर्धारण

क्योंकि सीआरएम जीन-सेट की अभिव्यक्ति ट्रांसप्लांट फेनोटाइप्स में समरूप नहीं थी और विभिन्न जीनों (एस 1 अंजीर) के बीच पर्याप्त शारीरिक क्रॉस-टॉक थी, हमने फेनोटाइप्स को और अलग करने और वर्गीकृत करने के लिए नॉनलाइनियर पर्यवेक्षित तरीकों का इस्तेमाल किया। uCRM जीन और फेनोटाइप के बीच संबंधों को निर्धारित करने के लिए t-SNE के माध्यम से अनसुनी क्लस्टरिंग का प्रदर्शन किया गया था। अंजीर 3 ए टी-एसएनई प्लॉट दिखाता है, यह दर्शाता है कि 11 सीआरएम जीन एसटीए नमूनों से एआर को लगभग पूरी तरह से अलग कर सकते हैं। यादृच्छिक वन महत्व स्कोर पर निर्भर वीएसयूआरएफ मॉडल ने निर्धारित किया कि एसटीए से एआर को संतुष्ट करने में पीएसएमबी 9 और सीएक्ससीएल 10 दो सबसे महत्वपूर्ण जीन थे। अंजीर 3 बी इन 2 जीनों के महत्व को और दर्शाता है। जीन भार के महत्व की साजिश यह दर्शाती है कि मॉडल से बाहर रखे जाने पर 2 जीनों में से कोई भी मॉडल की अशुद्धि में लगभग 20 प्रतिशत की कमी के अनुरूप है। ये दो जीन एआर बनाम एसटीए को लगभग 1 एल जीन मॉडल के रूप में उच्च सटीकता के साथ वर्गीकृत कर सकते हैं, 93.6 प्रतिशत की संवेदनशीलता और 97,6 प्रतिशत की विशिष्टता के साथ। इन दो जीनों के लिए जीन एक्सप्रेशन थ्रेशोल्ड एक निर्णय ट्री क्लासिफायरियर द्वारा निर्धारित किए गए थे और इन दो जीनों के लॉग-स्केल मानों को चित्र 3C में दर्शाया गया है। CXCL10 के लिए 28 की सीमा और PSMB9 के लिए 3 सही ढंग से वर्गीकृत 86/88 AR और STA मामलों में 97.7 प्रतिशत की समग्र सटीकता के लिए। विशेष रूप से, एआर और एसटीए फ़िनो-प्रकारों के बीच बार के नमूने गिर गए, जो इन दो जीनों के उन्नयन को एलोग्राफ़्ट सूजन की डिग्री में सुझाते हैं।

एआर, बॉर्डरलाइन एआर और एसटीए मामलों पर यूसीआरएम स्कोर के वर्गीकरण प्रदर्शन का पता लगाने के लिए, एक निर्णय ट्री क्लासिफायरियर का उत्पादन किया गया था (चित्र 4ए)। निर्णय वृक्ष ने प्रत्येक फेनोटाइप के लिए इष्टतम यूसीआरएम स्कोर थ्रेसहोल्ड निर्धारित किया। सही ढंग से वर्गीकृत 44/49 एआर मामलों में 4 से अधिक अंक; 1.8 से कम स्कोर 33/35 एसटीए मामलों को सही ढंग से वर्गीकृत किया गया। 14/23 सीमा रेखा मामले इन दो थ्रेसहोल्ड के बीच थे। फेनोटाइप द्वारा uCRM स्कोर का वितरण Fig4B में दर्शाया गया है। AR, bAR और STA के लिए माध्य uCRM स्कोर (SEM) 8.195 ({13}}.631),3.265 (0.412{{21) थे। }}), और 1.404(0.162) क्रमशः, और सभी तुलनाएँ कई तुलना सुधारों के बाद महत्वपूर्ण थीं। यूसीआरएम स्कोर एआर और एसटीए के बीच उच्च सटीकता के साथ अंतर कर सकता है- 3.63 की सीमा पर, संवेदनशीलता और विशिष्टता क्रमशः 95.35 प्रतिशत और 97.78 प्रतिशत थी (ईआईजी 4 सी। जब एआर और बार और एसटीए के संयोजन के बीच अंतर होता है, तो यूसीआरएम स्कोर बरकरार रहता है) एक ही दहलीज पर एक उच्च सटीकता, संवेदनशीलता और विशिष्टता क्रमशः 87.10 प्रतिशत और 97.78 प्रतिशत थी (S2A अंजीर)।

बीकेवीएन नमूनों को शामिल करते समय, सभी फ़ेनोटाइप बार और बीकेवीएन (एस2बीफ़िग) को छोड़कर कई तुलना सुधारों के बाद एक दूसरे से काफी भिन्न थे। एआर और बार, एसटीए और बीकेवीएन के संयोजन के बीच अंतर करते समय, यूसीआरएम स्कोर ने अभी भी एक उच्च, लेकिन कम सटीकता बरकरार रखी है। समान 3.63 थ्रेसहोल्ड का उपयोग करते हुए, संवेदनशीलता और विशिष्टता क्रमशः 76.92 प्रतिशत और 97.78 प्रतिशत थी (S2CFig)।

कॉमस्कोर एआर-विशिष्ट बायोप्सी हिस्टोलॉजिकल घावों के साथ संबंध रखता है विशेष रूप से, यूसीआरएम स्कोर को एसटीए से बीएआर तक एआर तक बढ़ाने की प्रवृत्ति ने सुझाव दिया कि यूसीआरएम स्कोर सूजन के उन्नयन का पता लगा सकता है जो चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक थे। जैसे, हमने मूल्यांकन किया कि क्या यूसीआरएम स्कोर एक ही रोगी से मिलान किए गए बायोप्सी में देखे गए हिस्टोलॉजिकल एआर घावों की सीमा से जुड़ा था, एक साथ एकत्र किया गया था। जैसा कि अंजीर 5ए और 5बी में देखा गया है, यूसीआरएम स्कोर ट्यूबुलिटिस (टी) की सीमा और एआर (आर =0 .5479, पी में अंतरालीय सूजन (i) बायोप्सी स्कोर के साथ सहसंबद्ध है।<0.0001 and="" r="0.4420,"><0.0001 for="" the="" ucrm="" score="" regarding="" t="" and="" ii,="" respectively).="" there="" was="" no="" correlation="" between="" the="" ucrm="" score="" and="" measures="" of="" tubular="" atrophy="" (ta),glomerulosclerosis="" (gs),mesangial="" matrix="" (mm),="" intimal="" proliferation="" (cv),="" medial="" arteriolar="" hyaline="" (ah),="" tubular="" vacuolization(tv),="" arteritis="" (v),="" or="" acute="" glomerulitis="">

CSITANCHE के प्रभाव: विरोधी थकान

बहस

विश्वसनीय और गैर-आक्रामक निगरानी उपकरण विकसित करने के लिए प्रत्यारोपण दवा में तत्काल आवश्यकता है जो प्रत्यारोपण चिकित्सकों को एलोग्राफ़्ट क्षति के जोखिम का अनुमान लगाने में मदद कर सकता है, अधिमानतः एलोग्राफ़्ट क्षति पहले ही स्थापित हो चुकी है। जबकि कई ट्रांसक्रिप्शनल बायोमार्कर एआर के साथ जुड़े हुए हैं, अधिकांश अध्ययनों ने मूल रूप से एक अद्वितीय या एकल ट्रांसक्रिप्शनल कारक पर ध्यान केंद्रित किया है और एलोग्राफ़्ट अस्वीकृति [11,38] की जैविक प्रक्रिया की संपूर्ण आणविक जटिलता को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। इसके अलावा, जबकि प्रतिरक्षा-मध्यस्थता वाले एलोग्राफ़्ट चोट की उपस्थिति के निदान के लिए वर्तमान स्वर्ण मानक एलोग्राफ़्ट बायोप्सी है, यह सर्वविदित है कि इस प्रक्रिया में बार-बार अनियमित नमूनाकरण प्रतिनिधित्व, इसकी उच्च लागत और दोहराव के लिए अव्यवहारिकता के संदर्भ में महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। तकनीक की आक्रामक प्रकृति के कारण स्क्रीनिंग।

कई रिपोर्टों ने गुर्दा प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं [20-22] के मूत्र के नमूनों में एआर की भविष्यवाणी करने वाले विभिन्न बायोमार्करों के अध्ययन के महत्व को दिखाया है। ग्रानजाइम B. CXCL10.CXCL9.IFN-y, और CXCR3 जैसे प्रतिरक्षा प्रभावकारी अणुओं और प्रतिलेखों के मूत्र स्तर में वृद्धि। एआर के साथ अत्यधिक जुड़ा हुआ दिखाया गया है और कुछ मामलों में, यहां तक ​​कि एआर के आगमन की पहले से भविष्यवाणी भी कर सकते हैं [19,24,39-43]। हमारे समूह [2 जेड, 29,44] द्वारा हाल ही में रिपोर्ट किए गए डेटा का लाभ उठाते हुए, एआर के दौरान एलोग्राफ़्ट बायोप्सी में जीन अभिव्यक्ति का एक सामान्य अस्वीकृति मॉड्यूल दिखाते हुए, ऊतक अंग के प्रकार के बावजूद, इस अध्ययन का मुख्य लक्ष्य यह जांचना था कि क्या मूल्यांकन गुर्दा प्रत्यारोपण रोगियों के मूत्र में सीआरएम का एक आदर्श गैर-आक्रामक बायोमार्कर के रूप में उपयोगी हो सकता है जो एआर के आगमन की भविष्यवाणी करता है।

जबकि कई व्यक्तिगत सीआरएम जीन और जीन उत्पादों का व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन किया गया है, यह केटीएक्स में एआर की भविष्यवाणी में सीआरएम जीन के सामूहिक, गैर-उपयोग की पहली रिपोर्ट है। उदाहरण के लिए, मूत्र CXCL9 mRNA और प्रोटीन और CXCL10 mRNA का मूल्यांकन पहले AR के निदान के लिए बहुकेंद्रीय अध्ययनों में किया गया था [13,45,46.PSMB9 गुर्दे की बायोप्सी में टेप भी पहले भ्रष्टाचार की गुणवत्ता और तीव्र अस्वीकृति की भविष्यवाणी से जुड़े थे। 47]।

हमने केटीएक्स रोगियों से मूत्र तलछट पर जीन अभिव्यक्ति डेटा का विश्लेषण सीआरएम टेप के सापेक्ष बहुतायत और सीआरएमजीन (छवि 2 ए) के बीच अभिव्यक्ति के उनके सहसंबंध के लिए किया है। ऊतक किडनी और फेफड़े के एलोग्राफ़्ट नमूनों में सीआरएम स्कोर का विश्लेषण करने वाले हमारे पहले रिपोर्ट किए गए अध्ययन के अनुरूप, CRMgenes ने AR और अन्य प्रत्यारोपण चोटों जैसे AR और BKVN (चित्र 2B और 2C) में अभिव्यक्ति में वृद्धि की थी। इस रिपोर्ट में, हमने नए विकसित uCRM स्कोर और हिस्टोलॉजिकल इंफ्लेमेटरी स्कोर (किडनी बायोप्सी के t और ii स्कोर) के बीच एक मजबूत संबंध भी देखा। चूंकि इनमें से अधिकांश सीआरएम जीन लगभग विशेष रूप से घुसपैठ करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं में व्यक्त किए जाते हैं, मूत्र तलछट में सीआरएम जीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति से पता चलता है कि ग्राफ्ट की चोट से गुजरने वाले किडनी प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के मूत्र में घुसपैठ करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं की वृद्धि हुई है।

इसके बाद, हमने व्यक्तिगत सीआरएम जीन, कॉमस्कोर के व्यक्तिगत जीन अभिव्यक्ति मूल्यों से गणना किए गए एक संयुक्त स्कोर का उपयोग किया, जो कि गुर्दे के प्रत्यारोपण के रोगियों को तीव्र अस्वीकृति या बिना किसी चोट के रोगी में वर्गीकृत करने के लिए एक मीट्रिक के रूप में और एआर के लिए एक सीमा निर्धारित करता है। इस अध्ययन के परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि यूसीआरएम परख की शक्ति न केवल एआर के साथ रोगियों की पहचान कर रही है, बल्कि एलोग्राफ़्ट में होने वाली चोट की डिग्री को भी माप रही है, क्योंकि एसटीए रोगियों में स्कोर कम मूल्यों से बीएआर रोगियों में मध्यवर्ती मूल्यों तक बढ़ जाता है, और एआर रोगियों में उच्च मूल्यों के लिए, जैसा कि ट्यूबुलिटिस और अंतरालीय सूजन हिस्टोलॉजी स्कोर में परिलक्षित होता है। हम मानते हैं कि यूसीआरएम स्कोर की प्रत्यारोपण निगरानी में संभावित उपयोगिता है और यह बायोप्सी के लिए सहायक या संदर्भित परीक्षण के रूप में काम कर सकता है। कम यूसीआरएम स्कोर वाला रोगी अनावश्यक प्रोटोकॉल बायोप्सी से बचने में सक्षम हो सकता है जबकि उच्च यूसीआरएम स्कोर वाले रोगी को भ्रष्टाचार की स्थिति का आकलन करने के लिए सीरियल मॉनिटरिंग या एक कारण बायोप्सी की आवश्यकता हो सकती है।

हम इस अध्ययन की कई सीमाओं को स्वीकार करते हैं जिसमें (i) अध्ययन का सीमित नमूना आकार, (ii) अन्य प्रत्यारोपण चोट फेनोटाइप्स की अनुपस्थिति जैसे कि पुरानी एलोग्राफ़्ट चोट या दवा विषाक्तता, और (i) एक अनुदैर्ध्य में uCRM स्कोर के मूल्यांकन की कमी शामिल है। बड़े समूह आकार में नमूना। इन आशाजनक निष्कर्षों से पता चलता है कि नैदानिक ​​​​सेटिंग में यूसीआरएम स्कोर की संभावित उपयोगिता को मान्य करने और पूरी तरह से मूल्यांकन करने के लिए अतिरिक्त, संभावित अध्ययन की आवश्यकता है। संक्षेप में, हम एक गैर-आक्रामक, मूत्र-आधारित बायोमार्कर प्रस्तुत करते हैं, जो 11 जीनों से बना एक सामान्य अस्वीकृति मॉड्यूल से विकसित होता है जो किडनी प्रत्यारोपण रोगियों में प्रत्यारोपण की चोट और अस्वीकृति की पहचान कर सकता है।

CSITANCHE के प्रभाव: याददाश्त में सुधार

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