रेनल फाइब्रोसिस के इलाज के लिए एक प्रभावी तरीका

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भाग Ⅰ: एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम प्रोटीन TXNDC5 किडनी फाइब्रोब्लास्ट में TGF- सिग्नलिंग को लागू करके वृक्क फाइब्रोसिस को बढ़ावा देता है

येन-टिंग चेन, पेई-यू झाओ और एट अल।

परिचय

रेनल फाइब्रोसिस, ट्यूबलोइंटरस्टिशियल द्वारा विशेषताफाइब्रोसिसऔर ग्लोमेर्युलर स्केलेरोसिस, अधिकांश का एक सामान्य रोग संबंधी अभिव्यक्ति है, यदि सभी नहीं, तो प्रकारदीर्घकालिकगुर्दाबीमारी(सीकेडी)(1). की प्रगतिगुर्देफाइब्रोसिससीकेडी के रोगियों में धीरे-धीरे नुकसान होता हैगुर्दासमारोह, जिसके परिणामस्वरूप अंत-चरण वृक्क रोग (ESRD) हो सकता है जिसके लिए डायलिसिस की आवश्यकता होती है यागुर्दाप्रत्यारोपण (2)। जबकि कई आणविक निर्धारकों और मार्गों को की प्रक्रिया में योगदान करने के लिए दिखाया गया हैगुर्दा फाइब्रोसिस, ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर-बीटा (TGF-) को आमतौर पर रीनल फाइब्रोजेनेसिस (3) का मास्टर रेगुलेटर माना जाता है। चोट लगने के बादगुर्दा, बांध-वृद्ध ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (TECs) को G2 / M चरण में गिरफ्तार किया जाता है और बड़ी मात्रा में TGF- का स्राव करता है, जिससे मायोफिब्रोब्लास्ट (4-6) में आसन्न वृक्क फाइब्रोब्लास्ट की सक्रियता और परिवर्तन होता है। सक्रिय मायोफिब्रोब्लास्ट, एक चिकनी पेशी एक्टिन (एक एसएमए) की अभिव्यक्ति द्वारा चित्रित किया गया है, अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव हैं और फाइब्रिलर कोलेजन, इलास्टिन, फाइब्रोनेक्टिन और सीसीएन 2 (आमतौर पर संयोजी ऊतक विकास कारक के रूप में जाना जाता है) जैसे बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन का उत्पादन करते हैं। सीटीजीएफ) (7,8)। गुर्दे की चोट के प्रारंभिक चरण के दौरान,फाइब्रोसिसएक अनुकूली और आत्म-सीमित शारीरिक प्रतिक्रिया के रूप में शुरू किया गया था जो ऊतक की मरम्मत और संरचनात्मक अखंडता (9) को बनाए रखने में मदद करता है। हालांकि, पुरानी, ​​​​बार-बार गुर्दे की चोट के बाद, मायोफिब्रोब्लास्ट की सक्रियता और प्रसार बनी रहती है, जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक ईसीएम उत्पादन और संचय होता है, जिससे कार्यात्मक किडनी पैरेन्काइमा का नुकसान होता है और अंततः, गुर्दे की विफलता (1O,11)।

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आधुनिक चिकित्सा में प्रगति के बावजूद, कुछ नैदानिक ​​उपचार इसके खिलाफ प्रभावी साबित हुए हैंगुर्दा फाइब्रोसिस. एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम अवरोधक (एसीईआई) और एंजियोटेंसिन रिसेप्टर ब्लॉकर्स (एआरबी), उदाहरण के लिए, प्रोटीनमेह को कम करने के लिए दिखाया गया है,गुर्देफाइब्रोसिस, और सीकेडी (12,13) ​​की प्रगति को धीमा कर देता है। दूसरी ओर, पेंटोक्सिफायलाइन, एक गैर-विशिष्ट फॉस्फोडिएस्टरेज़ अवरोधक, टीजीएफ - 1- प्रेरित ईसीएम और सीसीएन 2 अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए दिखाया गया है, जिससे ट्यूबलोइंटरस्टीशियल क्षीण हो जाता हैफाइब्रोसिस(14)। हालांकि, एसीईआई और एआरबी का उपयोग उनके काल्पनिक प्रभावों और हाइपरकेलेमिया जैसे संभावित प्रतिकूल प्रभावों से सीमित है। इसके अलावा, न तो एसीईएल/एआरबी और न ही पेंटोक्सिफायलाइन उपचार इसकी प्रगति को रोक सकते हैंगुर्देफाइब्रोसिसऔर सीकेडी(15,16)। इसलिए, उपन्यास मध्यस्थों या मार्गों की पहचान करना अनिवार्य है जो रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण हैंगुर्देफाइब्रोसिससीकेडी के खिलाफ प्रभावी चिकित्सा विकसित करने के लिए (क्रोनिक किडनी रोग).

हाल ही में, हमने 5 (TXNDC5) वाले थिओरेडॉक्सिन डोमेन की पहचान की, जो एक ईआर-निवासी, फ़ाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध प्रोटीन है, जिसमें प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड आइसोमेरेज़ (पीडीआई) की एंजाइम गतिविधि होती है, जो कार्डियक के एक महत्वपूर्ण मध्यस्थ के रूप में होता है।फाइब्रोसिस(17)। हमने दिखाया कि अत्यधिक TXNDC5 हृदय के विकास को बढ़ावा देता हैफाइब्रोसिसरेडॉक्स-आश्रित कार्डियक फ़ाइब्रोब्लास्ट सक्रियण और ईसीएम उत्पादन के माध्यम से। Txndc5 का आनुवंशिक विलोपन कार्डियक को ठीक करता हैफाइब्रोसिसऔर चूहों में एगोनिस्ट द्वारा प्रेरित सिकुड़ा हुआ रोग (17)। मायोकार्डियल फाइब्रोजेनेसिस में TXNDC5 की देखी गई आवश्यक भूमिका के आधार पर, हमने अनुमान लगाया कि TXNDC5 ऊतक के विकास में भी महत्वपूर्ण योगदान दे सकता है।फाइब्रोसिसगैर-हृदय अंगों में, विशेष रूप सेगुर्दा फाइब्रोसिस.

वर्तमान अध्ययन में, हमने दिखाया कि TXNDC5 मानव और माउस फाइब्रोटिक किडनी दोनों में अत्यधिक अपग्रेड किया गया था, विशेष रूप से कोलेजन-स्रावित गुर्दे फाइब्रोब्लास्ट में। Txndc5 के वैश्विक विलोपन ने स्पष्ट रूप से . की सीमा को कम कर दिया हैगुर्देफाइब्रोसिसगुर्दे की चोट के कई माउस मॉडल में। यंत्रवत् रूप से, हमने दिखाया कि अत्यधिक TXNDC5, TGF द्वारा प्रेरित - 1 ATF के माध्यम से 6- निर्भर ER तनाव मार्ग, संवर्द्धनगुर्देफाइब्रोसिसपोस्टट्रांसलेशनल स्थिरीकरण और टीजीएफ-रिसेप्टर टाइप I (TGFBR1) के अपग्रेडेशन के माध्यम से किडनी फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण / प्रसार और ईसीएम उत्पादन को बढ़ावा देकर। महत्वपूर्ण रूप से, हमने दिखाया कि Txndc5 के फ़ाइब्रोब्लास्ट-विशिष्ट विलोपन को प्रेरित करने से प्रभावी रूप से विकास और प्रगति में सुधार हुआगुर्दा फाइब्रोसिसचूहों में विभिन्न प्रकार की चोटों से प्रेरित, यह सुझाव देता है कि TXNDC5 को लक्षित करना इलाज के लिए एक उपन्यास और शक्तिशाली दृष्टिकोण हो सकता हैगुर्देफाइब्रोसिसऔर संरक्षित करेंगुर्दासमारोह.

चित्रा 1. TXNDC5 को CKD . के रोगियों से माउस फाइब्रोटिक किडनी और किडनी के नमूनों में काफी हद तक अपग्रेड किया गया था( क्रोनिक किडनी रोग).

(ए) आईएचसी धुंधला (एन=3) और (बी) इम्युनोब्लॉट्स (एन=6) ने दिखाया कि TXNDC5 की प्रोटीन अभिव्यक्ति UUO या uIRI द्वारा प्रेरित माउस फाइब्रोटिक किडनी में अपग्रेड की गई थी, जो कि contralateral किडनी (CL) की तुलना में थी। . स्केल बार: 50 माइक्रोन।

(सी) मात्रात्मक आरटी-पीसीआर ने दिखाया कि Txndc5 प्रतिलेख UUO और uIRI (n=4–7) से प्रेरित माउस फाइब्रोटिक किडनी में अपग्रेड किया गया था।

(डी) सीकेडी (जीएसई66494) के रोगियों से मानव गुर्दे के नमूनों पर माइक्रोएरे डेटा के पुनर्विश्लेषण से पता चला है कि सीकेडी रोगियों (स्वस्थ नियंत्रण n=8, CKD n {{ से गुर्दे के ऊतकों में TXNDC5, COL3A1 और FN1 को काफी हद तक अपग्रेड किया गया था। 6}})। ए-सी के लिए, डेटा 3 या अधिक स्वतंत्र प्रयोगात्मक प्रतिकृति के प्रतिनिधि हैं।

सभी पैनलों के लिए, डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *P < {{0}}.05,="" **p=""><0.01, ***p=""><0.001 2-साइडेड="" टी-टेस्ट="" (a–c)="" या="" मान-="" व्हिटनी="" टेस्ट="">

परिणाम

TXNDC5was को मानव और माउस फाइब्रोटिक किडनी में महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किया गया था। रोगजनन में TXNDC5 की संभावित भागीदारी की जांच करने के लिएगुर्दा फाइब्रोसिस, हमने पहले एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध (UUO), एकतरफा इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट (uIRI), या फोलिक एसिड (FA) के प्रशासन द्वारा प्रेरित फाइब्रोटिक माउस किडनी के ऊतकों में इसकी प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित किया। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अध्ययनों से पता चला है कि सभी 3 माउस मॉडल से गुर्दे के वर्गों में TXNDC5 धुंधला होने की तीव्रता में उल्लेखनीय वृद्धि हुई हैगुर्देफाइब्रोसिस(चित्र 1ए और पूरक चित्र 1ए; इस लेख के साथ ऑनलाइन उपलब्ध पूरक सामग्री;https://doi.org/10.1172/JCI143645DS1)। इम्युनोब्लॉटिंग और क्वांटिटेटिव रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-पीसीआर) ने फाइब्रोटिक माउस किडनी में प्रोटीन (चित्रा 1 बी) और ट्रांसक्रिप्ट (चित्रा 1 सी और पूरक चित्रा 1 बी) के अभिव्यक्ति स्तरों के TXNDC5 के महत्वपूर्ण अपग्रेडेशन को भी दिखाया। इन परिणामों के अनुरूप, CKD (GSE66494)(18) के रोगियों के गुर्दे की बायोप्सी नमूनों से प्राप्त माइक्रोएरे डेटा के पुनर्विश्लेषण से पता चला है कि TXNDC5 के अभिव्यक्ति स्तर (2.24 गुना, पी द्वारा)<0.001), as="" well="" as="" of="" markers="" for="">गुर्दा फाइब्रोसिसCOL3A1and FN जैसे स्वस्थ नियंत्रण वाले लोगों की तुलना में CKD के रोगियों के गुर्दे के नमूनों में भी काफी वृद्धि हुई थी (चित्र 1D और पूरक चित्र 1C)। एक साथ लिया गया, फाइब्रोटिक मानव / माउस किडनी में TXNDC5 / Txndc5 अभिव्यक्ति का मनाया गया अपग्रेडेशन और फाइब्रोजेनिक ईसीएम प्रोटीन जीन के साथ इसका सकारात्मक सहसंबंध रोगजनन में TXNDC5 की संभावित भूमिका का सुझाव देता हैगुर्दा फाइब्रोसिस.

चित्रा 2. TXNDC5 गुर्दे के फाइब्रोब्लास्ट में अत्यधिक अपग्रेड किया गया था, लेकिन फाइब्रोटिक किडनी के टीईसी, एंडोथेलियल कोशिकाओं या पॉडोसाइट्स में नहीं।

(ए और सी) यदि Col1a में UUO द्वारा प्रेरित फाइब्रोटिक किडनी के वर्गों पर TXNDC5 (लाल) का धुंधलापन 1- GFPTg चूहों ने दिखाया कि TXNDC5 मुख्य रूप से कोलेजन-स्रावित गुर्दे फाइब्रोब्लास्ट (हरा) में व्यक्त किया गया था, दोनों वृक्क प्रांतस्था और मज्जा में (एन=6)। सेल नाभिक DAPI (नीला) के साथ दागे गए थे। स्केल बार: 100 माइक्रोन।

(बी) यदि Cdh में UUO द्वारा प्रेरित फाइब्रोटिक किडनी के खंड पर TXNDC5 (हरा) का धुंधलापन 16-Cre, NPHS2-Cre, और Tie2-Cre/ERT2 tdTomato चूहों। सेल नाभिक DAPI (नीला) के साथ दागे गए थे। स्केल बार: 100 माइक्रोन।

(डी) यूयूओ-प्रेरित फाइब्रोटिक किडनी में विभिन्न प्रकार की किडनी कोशिकाओं में TXNDC5 प्लस कोशिकाओं के अनुपात को दर्शाने के लिए एक पाई चार्ट।

डेटा 3 या अधिक स्वतंत्र प्रयोगात्मक प्रतिकृति के प्रतिनिधि हैं। C में डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है।

TXNDC5 फाइब्रोटिक किडनी में कोलेजन-स्रावित वृक्क फाइब्रोब्लास्ट में अत्यधिक समृद्ध था। किडनी फाइब्रोजेनेसिस की प्रक्रिया में कई प्रकार की किडनी कोशिकाओं को फंसाया गया है। गुर्दे की चोटों के बाद, निवासी (19) और पेरिवास्कुलर (20) वृक्क फाइब्रोब्लास्ट को सक्रिय मायोफिब्रोब्लास्ट में अंतर करने के लिए दिखाया गया और परिणामस्वरूप ईसीएम का संचय हुआ। टीईसी और एंडोथेलियल कोशिकाओं को भी के विकास में योगदान करने के लिए सूचित किया गया थागुर्दा फाइब्रोसिसउपकला- और एंडोथेलियल-टू-मेसेनकाइमल संक्रमण के माध्यम से, क्रमशः (10,21)। सेल प्रकार निर्धारित करने के लिए जहां TXNDC5 गुर्दे की प्रक्रिया के दौरान व्यक्त किया गया थाफाइब्रोसिस, कई रिपोर्टर माउस लाइनें जो रीनल फ़ाइब्रोब्लास्ट्स (कोला 1- GFP ', GFP द्वारा संचालित Collal एन्हांसर/प्रमोटर, ref.22), TECs (Cdh16-Cre ROSA26-) की प्रतिदीप्ति लेबलिंग की अनुमति देती हैं। tdTomato), एंडोथेलियल कोशिकाएं (Tie2-Cre/ERT2 ROSA26-tdTomato), और पोडोसाइट्स (NPHS2-Cre ROSA26-tdTomato) UUO, uIRI, या प्रेरित करने के लिए एफए उपचारगुर्दा फाइब्रोसिस. इन जानवरों से गुर्दे के वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला होने से पता चला है कि TXNDC5 को यूयूओ (81 प्रतिशत) (चित्रा 2, ए और सी) से प्रेरित फाइब्रोटिक माउस किडनी में जीएफपी-पॉजिटिव, कोलेजन-स्रावित गुर्दे फाइब्रोब्लास्ट के साथ स्पष्ट रूप से अपग्रेड किया गया था और अत्यधिक कोलोकलाइज़ किया गया था। , यूआईआरआई (76.8 प्रतिशत), और एफए उपचार (73.4 प्रतिशत) (पूरक चित्रा 2, ए और बी)। यूयूओ-प्रेरित फाइब्रोटिक किडनी में, TXNDC5 को केवल टीईसी (5.94 प्रतिशत), पोडोसाइट्स (0.63) में छिटपुट रूप से व्यक्त किया गया था। प्रतिशत), और एंडोथेलियल कोशिकाएं (2.05 प्रतिशत) (चित्रा 2, बी और डी)। यूयूओ के अधीन माउस किडनी से पृथक फाइब्रोब्लास्ट्स के फ्लोसाइटोमेट्री विश्लेषण ने TXNDC5 * किडनी फाइब्रोब्लास्ट में एक उल्लेखनीय विस्तार के साथ-साथ इन कोशिकाओं में TXNDC5 के एक महत्वपूर्ण अपग्रेडेशन का खुलासा किया। contralateral नियंत्रण गुर्दे (पूरक चित्रा 2C) से उन लोगों के साथ तुलना में। फाइब्रोटिक में वृक्क फाइब्रोब्लास्ट में TXNDC5 के मजबूत संवर्धन से पता चलता है कि TXNDC5 योगदान कर सकता हैगुर्दा फाइब्रोसिसइन कोलेजन-स्रावित फाइब्रोजेनिक कोशिकाओं की गतिविधि / व्यवहार को विनियमित करके।

TXNDC5 गुर्दे के फाइब्रोब्लास्ट के सक्रियण, प्रसार और ईसीएम उत्पादन को प्रेरित करने के लिए आवश्यक और पर्याप्त दोनों था। इसके बाद, हमने किडनी फाइब्रोब्लास्ट में TXNDC5 की कार्यात्मक भूमिका निर्धारित की। प्राथमिक मानव गुर्दा फाइब्रोब्लास्ट (HKFs) TGF से प्रेरित - 1 (10 एनजी/एमएल) ने प्रोटीन (चित्रा 3ए) और प्रतिलेख (चित्रा 3बी) TXNDC5 के अभिव्यक्ति स्तरों के साथ-साथ फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण मार्कर पेरीओस्टिन में मजबूत अपग्रेडेशन दिखाया। और ईसीएम प्रोटीन (COL1Al, फाइब्रोनेक्टिन, और CCN2)। shRNA के साथ TXNDC5 के नॉकडाउन ने HKFs (चित्रा 3, ए और बी) में पेरीओस्टिन और कई ईसीएम प्रोटीन के टीजीएफ प्रेरित प्रोटीन/एमआरएनए अपग्रेडेशन को काफी हद तक क्षीण कर दिया। इसके अलावा, TGF1 उपचार ने HKFs की प्रसार गतिविधि को बढ़ाया, जिसे TXNDC5 नॉकडाउन (चित्र 3D) द्वारा पूरी तरह से निरस्त कर दिया गया था। ये परिणाम बताते हैं कि TXNDC5 TGF - 1- प्रेरित HKF सक्रियण, प्रसार और ECM उत्पादन के लिए आवश्यक है। दूसरी ओर, TXNDC5 के ओवरएक्प्रेशन के परिणामस्वरूप पेरीओस्टिन, COL1A1 और फ़ाइब्रोनेक्टिन (चित्र 3C) के चिह्नित अपग्रेडेशन के साथ-साथ HKF में प्रोलिफ़ेरेटिव गतिविधि (चित्र 3E) में वृद्धि हुई। सामूहिक रूप से, ये परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि TXNDC5, TGF - 1 के नीचे की ओर, गुर्दे के फ़ाइब्रोब्लास्ट के सक्रियण, प्रसार और ECM उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक और पर्याप्त दोनों है।

चित्रा 3. TXNDC5 के टीजीएफ क्षीणन - 1-प्रेरित एचकेएफ सक्रियण और ईसीएम उत्पादन; TXNDC5 का ओवरएक्प्रेशन एचकेएफ सक्रियण और ईसीएम उत्पादन को ट्रिगर करने के लिए पर्याप्त था।

(ए) प्रोटीन और (बी) फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण मार्कर (पेरीओस्टिन) और ईसीएम प्रोटीन (COL1A1, फाइब्रोनेक्टिन, और CCN2) के प्रतिलेख अभिव्यक्ति स्तर TGF - 1 (10 एनजी / एमएल) के बाद नियंत्रण (हाथापाई) एचकेएफ में बढ़ाए गए थे। इलाज। TXNDC5 के नॉकडाउन ने HKFs (n=5-10) में TGF - 1 से प्रेरित इन फाइब्रोजेनिक मार्करों के अपग्रेडेशन को देखा।

(सी) TXNDC5 का ओवरएक्प्रेशन एचकेएफ (एन=3 -10) में फाइब्रोब्लास्ट एक्टिवेशन मार्कर (पेरिओस्टिन) और ईसीएम प्रोटीन (COL1A1, फाइब्रोनेक्टिन) के अपग्रेडेशन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था।

(डी) टीजीएफ के उपचार - 1 (10 एनजी/एमएल) ने एचकेएफ की सेलुलर प्रसार गतिविधि में वृद्धि की, जिसे TXNDC5 नॉकडाउन द्वारा निरस्त कर दिया गया था।

(ई) TXNDC5 के ओवरएक्प्रेशन ने एचकेएफ की सेलुलर प्रसार गतिविधि में वृद्धि की। डी और ई में, एन=10। डेटा 3 या अधिक स्वतंत्र प्रयोगात्मक प्रतिकृति के प्रतिनिधि हैं।

सभी पैनलों के लिए, डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। 2 समूहों के लिए अंतर का सांख्यिकीय महत्व एक 2- पक्षीय टी-परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था और 3 या अधिक समूहों के बीच इसे 1-वे एनोवा का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, इसके बाद सिडक के पोस्ट हॉक परीक्षण किए गए थे। *पी < 0.05,="" **पी="">< 0.01,="" ***पी=""><>

Txndc5 का वैश्विक विलोपन गुर्दे से सुरक्षित b. के विकास में TXNDC5 की आवश्यकता का निर्धारण करने के लिएगुर्दा फाइब्रोसिसविवो में , WT और Tndc5-/चूहों को UUO, uIRI, और FA उपचार के अधीन किया गया। पिक्रोसिरियस रेड और मैसन के ट्राइक्रोम का गुर्दे के वर्गों पर धुंधलापन व्यापक दिखागुर्देफाइब्रोसिसयूयूओ(चित्रा 4ए),यूआईआरआई(चित्रा 5ए), और एफए(पूरक चित्रा 3ए) के प्रशासन के बाद डब्ल्यूटी चूहों में। Txndc5 के वैश्विक विलोपन ने इसकी सीमा को काफी कम कर दिया हैगुर्देफाइब्रोसिससभी 3 गुर्दे की चोट के मॉडल (चित्रा 4ए, चित्रा 5ए, और पूरक चित्रा 3ए) में।

चित्रा 4. UUO द्वारा प्रेरित Txndc5 क्षीण गुर्दे फाइब्रोसिस का विलोपन।

(ए) पिक्रोसिरियस लाल धुंधला (शीर्ष 2 पैनल) और मैसन के ट्राइक्रोम धुंधला (नीचे 2 पैनल) WT और Txndc से गुर्दे वर्गों के 5-7 UUO के 10 दिन बाद चूहों। पिक्रोसिरियस रेड और मैसन के ट्राइक्रोम धुंधला क्षेत्रों के मात्रात्मक परिणामों के बार ग्राफ दाईं ओर दिखाए गए हैं (एन =5-10)। स्केल बार∶ 100 माइक्रोन।

(बी)यूयूओ के 10 दिन बाद डब्ल्यूटी और टीएक्सएनडीसी5-/चूहों से गुर्दे के वर्गों की एसएचजी छवियां। एसएचजी-पॉजिटिव क्षेत्रों के मात्रात्मक परिणामों ने डब्ल्यूटी में फाइब्रिलर कोलेजन (हरा) के संचय में वृद्धि दिखाई, लेकिन चोट के बाद Txndc5 चूहों के गुर्दे में नहीं।

SHG के लिए इमेज किए गए प्रत्येक किडनी सेक्शन के लिए, स्कैन किए गए ऊतक (नीचे के पैनल में लाल रंग) (n =3) की प्रोफ़ाइल दिखाने के लिए TPEF इमेजिंग प्राप्त की गई थी। स्केल बार: 50 um। (सी) इम्युनोब्लॉट्स ने यूयूओ (एन=3-6) के 10 दिन बाद डब्ल्यूटी और टीएक्सएनडीसी 5- / चूहों से पूरे गुर्दे के अर्क में फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण मार्कर (पेरिओस्टिन) और ईसीएम (COL1A1) के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर दिखाए। डेटा 3 या अधिक स्वतंत्र प्रयोगात्मक प्रतिकृति के प्रतिनिधि हैं।

सभी पैनलों के लिए, डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। 3 या अधिक समूहों के बीच अंतर का सांख्यिकीय महत्व 1-वे एनोवा का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, इसके बाद सिडक के पोस्ट हॉक परीक्षण।**P<><>

विशेष रूप से रोगजनक फाइब्रिलर कोलेजन (टाइप I और II) की मात्रा निर्धारित करने के लिए और पारंपरिक धुंधला तरीकों के साथ फाइब्रोटिक क्षेत्रों के overestimation से बचने के लिए, दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) माइक्रोस्कोपी, एक उपन्यास ऑप्टिकल ऊतक इमेजिंग सिस्टम जो फाइब्रिलर के दृश्य की अनुमति देता है, लेकिन गैर-फाइब्रिलर नहीं, तंतुमय अंगों (23,24) में कोलेजन, की सीमा का आकलन करने के लिए नियोजित किया गया थाफाइब्रोसिसचोट के बाद WT और Tndc5 प्लस माउस किडनी में। उपरोक्त परिणामों के अनुरूप, एसएचजी माइक्रोस्कोपी ने यूयूओ (चित्रा 4बी), यूआईआरआई (चित्रा 5बी), और एफए उपचार (पूरक चित्रा 3बी) के बाद डब्ल्यूटीकिडनी में फाइब्रिलर कोलेजन जमाव में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई, जिसकी सीमा टीएक्सएनडीसी में काफी कम हो गई थी {{ 4}}/चूहों (चित्र 4ख, चित्र 5ख, और पूरक चित्र 3ख)।

इमेजिंग अध्ययनों द्वारा देखे गए Txndc5mouse किडनी में क्षीण पोस्टिनज्यूरी फाइब्रोटिक प्रतिक्रिया के अनुरूप, Tendc5 को हटाने से चोट के बाद माउस किडनी में कॉलर, Eln, Fnl, और Ccn2 सहित ECM प्रोटीन जीन का अपचयन भी कम हो गया (पूरक चित्रा 3, CE)। पूरे गुर्दा ऊतक lysates के इम्युनोब्लॉट्स ने UUO और uIRI (चित्रा 4C और चित्रा 5C) ​​के बाद WT चूहों की तुलना में Txndc 5- / चूहों में ECM (COLIA1) और फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण मार्कर (पेरीओस्टिन) के प्रोटीन स्तर को कम दिखाया।

चित्रा 5. ulRI द्वारा प्रेरित Txndc5 ameliorated वृक्क फाइब्रोसिस का विलोपन।

(ए) पिक्रोसिरियस रेड स्टेनिंग (शीर्ष 2 पैनल) और मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग (नीचे 2 पैनल) डब्ल्यूटी और टीएक्सएनडीसी से किडनी वर्गों के 5-7 चूहों के 28 दिन बाद उलआरआई। पिक्रोसिरियस रेड और मैसन के ट्राइक्रोम के मात्रात्मक परिणामों के बार ग्राफ धुंधला क्षेत्रों को दाईं ओर दिखाया गया है (n=6)। स्केल बार 100 माइक्रोन।

(बी) WT और Txndc से गुर्दे के वर्गों की SHG छवियां5-चूहों ulRI के 28 दिन बाद। एसएचजी-पॉजिटिव क्षेत्रों के मात्रात्मक परिणामों ने डब्ल्यूटी में फाइब्रिलर कोलेजन (हरा) के संचय में वृद्धि दिखाई, लेकिन चोट के बाद Txndc5 चूहों के गुर्दे में नहीं। SHG के लिए इमेज किए गए प्रत्येक किडनी सेक्शन के लिए, TPEF इमेजिंग को स्कैन किए गए ऊतक-लाल रंग के प्रोफाइल को नीचे के पैनल में दिखाने के लिए प्राप्त किया गया था। =3 ）। स्केल बार -50 माइक्रोन।

(सी) इम्युनोब्लॉट्स ने ulRI (n =5-9) के 28 दिनों के बाद WT और Txndc5/चूहों से पूरे गुर्दे के अर्क में फ़ाइब्रोब्लास्ट सक्रियण मार्कर (पेरिओस्टिन) और ECM (COL1A1) के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर दिखाए। डेटा 3 या अधिक स्वतंत्र प्रयोगात्मक प्रतिकृति के प्रतिनिधि हैं।

सभी पैनलों के लिए, डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। 3 या अधिक समूहों के बीच अंतर का सांख्यिकीय महत्व 1-वे एनोवा का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, इसके बाद सिडक के पोस्ट हॉक परीक्षण।*P<><><>

इस संभावना को बाहर करने के लिए कि TXNDC5 अन्य वृक्क कोशिका प्रकारों जैसे TECs, पोडोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं में व्यक्त किया गया है, अभी भी के विकास में योगदान कर सकता हैगुर्देफाइब्रोसिस, हमने TECs (Cdh16-cre*Txcndc5i, या Txndc5Epeko), पोडोसाइट्स (NPHS2-cre*Txndc5/n, या Tendc5Podxko), और एंडोथेलियल कोशिकाओं (टाई{{{{{}} के लिए विशिष्ट Txndc5 सशर्त नॉकआउट चूहों को उत्पन्न किया। 7}}cre/ERT2*Tendc5/, या Txndc5Endo.eko)। Txndc5Pieko और Txndc5 Poio-cko चूहों के प्रयोग में, Txndc5W चूहों का नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया; Txndc5EMio-eko चूहों पर प्रयोगों में, Txndc5 विलोपन को टेमोक्सीफेन का उपयोग करके प्रेरित किया गया था जैसा कि चित्र 9ए में वर्णित है, जहां टेमोक्सीफेन-उपचारित टाई 2- Cre/ERT2 चूहों को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था। टीईसी, पॉडोसाइट्स, या एंडोथेलियल कोशिकाओं में टीएक्सएनडीसी 5 का लक्षित विलोपन, हालांकि, की सीमा को प्रभावित नहीं करता हैगुर्दा फाइब्रोसिसUUO या FA द्वारा प्रेरित (पूरक चित्र 6, BE)। इन परिणामों से पता चलता है कि TXNDC5 टीईसी, पोडोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं में व्यक्त किया गया है, यदि कोई हो, तो रोगजनन में बहुत कम योगदान देता हैगुर्दाफाइब्रोसिस.

किडनी फ़ाइब्रोब्लास्ट में Txndc5 का विलोपन गुर्दे की चोट के जवाब में TEC एपोप्टोसिस से बचाता है। इस् प्रक्रिया मेंगुर्देफाइब्रोसिस, घायल टीईसी माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और एपिकोबैसल ध्रुवीयता खो देते हैं, इसके बाद एपोप्टोसिस और कोशिका मृत्यु (30) होती है। यह जांचने के लिए कि चोट के जवाब में टीएक्सएनडीसी 5 को हटाने से टीईसी के एपोप्टोसिस पर प्रभाव पड़ता है, हमने डब्ल्यूटी और टीएक्सएनडीसी 5- माउस किडनी पर ट्यूनेल धुंधला का संचालन किया। यूयूओ के 10 दिन बाद धाराएं। WT चूहों के UUO- प्रेरित फाइब्रोटिक किडनी में एपोप्टोटिक TEC की संख्या में काफी वृद्धि हुई, जबकि Txndc5 को हटाने से TECapoptosis की सीमा बढ़ गई। यह बताया गया है कि सक्रिय किडनी फ़ाइब्रोब्लास्ट पैरासरीन प्रभाव (31) के माध्यम से टीईसी एपोप्टोसिस को प्रेरित कर सकते हैं। क्योंकि Tendc5 को TECs में बमुश्किल व्यक्त किया जाता है, यह संभावना है कि UUO के बाद Txndc 5-7 चूहों में देखा गया कम TEC एपोप्टोसिस एक सेल-स्वायत्त प्रभाव नहीं था, बल्कि कम अंतरालीय के लिए माध्यमिक थाफाइब्रोसिसऔर इसलिए आसपास के किडनी फाइब्रोब्लास्ट से कुछ-एर प्रॉपोपोटिक संकेत। इस परिकल्पना के अनुरूप, Txndc5 (Tendc5kO) के फ़ाइब्रोब्लास्ट-विशिष्ट विलोपन ने TEC एपोप्टोसिस को एक हद तक UUO (पूरक) के बाद Txndc 5- / चूहों में 10 दिनों के समान देखा। TECapoptosis में देखी गई कमी के विपरीत, F4/80-पॉजिटिव मैक्रोफेज और सीडी31-पॉजिटिव एंडोथेलियल कोशिकाओं की संख्या WT और Txndc में तुलनीय थी5-माउस किडनी, UUO के साथ या उसके बिना, यह सुझाव देते हुए कि Txndc5 विलोपन मैक्रोफेज घुसपैठ को प्रभावित नहीं करता है या माउस किडनी में पेरिटुबुलर केशिका घनत्व। एक साथ लिया गया, ये आंकड़े बताते हैं कि Txndc5 विलोपन के रेनो-सुरक्षात्मक प्रभाव कम ट्यूबलर इंटरस्टीशियल के परिणामस्वरूप होते हैंफाइब्रोसिसऔर टीईसी एपोप्टोसिस, गुर्दे की केशिका घनत्व या मैक्रोफेज को प्रभावित किए बिना।

गुर्दे के फाइब्रोब्लास्ट में Tendc5 के प्रेरित विलोपन ने स्थापित की प्रगति को कम कर दियागुर्दा फाइब्रोसिस. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या गुर्दे में Txndc5 को लक्षित करना स्थापित में फायदेमंद हो सकता हैगुर्देफाइब्रोसिस, गुर्दे के फाइब्रोब्लास्ट में Txndc5 विलोपन को UUO के 10 दिन बाद Txndc5eko चूहों में प्रेरित किया गया था, एक समय बिंदु जब व्यापकगुर्देफाइब्रोसिसनिरीक्षण किया जा सकता है। इन प्रयोगों में, टेमोक्सीफेन-उपचारित कोला2-Cre चूहों को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था। जैसा कि दिखाया गया है, Colla2-Cre और Tcndc5eko चूहों की एक समान सीमा थीगुर्देफाइब्रोसिसटेमोक्सीफेन उपचार से पहले यूयूओ के 10 दिन बाद। टेमोक्सीफेन इंजेक्शन के ग्यारह दिन बाद, हालांकि, गुर्दे की फाइब्रोसिस की सीमा नियंत्रण चूहों में प्रगति जारी रही (फाइब्रोटिक क्षेत्र 5.1 प्रतिशत से बढ़कर 10.6 प्रतिशत हो गया), जबकि की प्रगतिगुर्दाफाइब्रोसिसTxndc5eko चूहों में लगभग रुका हुआ था (फाइब्रोटिक क्षेत्र 5.3 प्रतिशत से 6.9 प्रतिशत में बदल गया)। इम्युनोब्लॉटिंग ने UUO के बाद D10 और D21 के बीच नियंत्रण चूहों की तुलना में Txndc5eko चूहों में CCN2, पेरीओस्टिन और TGFBR1 के स्पष्ट रूप से क्षीणन को भी दिखाया। इन परिणामों से पता चलता है कि वृक्क फाइब्रोब्लास्ट में Txndc5 का पारंपरिक विलोपन, की प्रगति को काफी कम करता हैगुर्दा फाइब्रोसिस, यह सुझाव देते हुए कि TXNDC5 के विवो लक्ष्यीकरण में सुधार के लिए एक उपन्यास और शक्तिशाली चिकित्सीय दृष्टिकोण हो सकता हैगुर्दाफाइब्रोसिसऔर सीकेडी की प्रगति को धीमा करने के लिए।

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