एक एमआरएनए टीका स्टिंग-निर्भर एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करता है

अमूर्त

रोग की रोकथाम और उपचार के लिए लिपिड-निर्मित आरएनए टीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, फिर भी उनकी क्रिया के तंत्र और ऐसे कार्यों में योगदान देने वाले व्यक्तिगत घटकों को चित्रित किया जाना बाकी है। यहां, हम दिखाते हैं कि प्रोटामाइन/एमआरएनए कोर और लिपिड शेल से बना एक चिकित्सीय कैंसर टीका साइटोटॉक्सिक सीडी8þ टी सेल प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने और ट्यूमर-विरोधी प्रतिरक्षा में मध्यस्थता करने में अत्यधिक शक्तिशाली है। यांत्रिक रूप से, डेंड्राइटिक कोशिकाओं में टाइप I इंटरफेरॉन और सूजन साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति को पूरी तरह से उत्तेजित करने के लिए एमआरएनए कोर और लिपिड शेल दोनों की आवश्यकता होती है। इंटरफेरॉन-बी अभिव्यक्ति की उत्तेजना विशेष रूप से स्टिंग पर निर्भर है, और दोषपूर्ण स्टिंग जीन वाले चूहों में एमआरएनए वैक्सीन से एंटीट्यूमर गतिविधि काफी हद तक प्रभावित होती है। इस प्रकार, एमआरएनए टीका स्टिंग-निर्भर एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्राप्त करता है।

पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

1 परिचय

SARS-CoV संक्रमण की रोकथाम के लिए mRNA टीकों के तेजी से विकास और विश्वव्यापी अनुप्रयोग ने स्वास्थ्य देखभाल में mRNA-आधारित दवाओं की शक्ति का प्रदर्शन किया है1,2। उनके बड़े आणविक भार और नकारात्मक चार्ज के कारण, स्तनधारी कोशिकाओं में प्रभावी ढंग से प्रवेश करने के लिए एमआरएनए अणुओं को डिलीवरी वाहनों में पैक करने की आवश्यकता होती है। नैनोमीटर आकार के डिलीवरी वाहनों में पैकेजिंग से एमआरएनए अणुओं को एंजाइमेटिक गिरावट से बचाने का भी लाभ मिलता है। उद्देश्य के अनुरूप कई डिलीवरी प्लेटफ़ॉर्म विकसित किए गए हैं, जैसे लिपिड नैनोपार्टिकल4, लिपो पॉलीप्लेक्स (एलपीपी)5, लिपोसोम-प्रोटामाइन-आरएनए (एलपीआर)6, आरएनए लिपोप्लेक्स (आरएनए-एलपीएक्स)7, और वायरस-लाइक वैक्सीन पार्टिकल (वीएलवीपी) )8. जबकि प्रत्येक प्लेटफ़ॉर्म की अपनी अनूठी संरचना और संरचना होती है, अधिकांश वाहनों में एक आयनिक लिपिड अणु होता है जो एमआरएनए पैकेजिंग और एंडोसोम से एमआरएनए अणुओं के भागने की सुविधा प्रदान करता है। रोगनिरोधी टीकों की सफलता के साथ, एक सामान्य धारणा है कि एमआरएनए चिकित्सा विज्ञान का उपयोग संभवत: सभी नहीं तो अधिकांश प्रकार के रोग 9ई12 के इलाज के लिए किया जा सकता है। दरअसल, एमआरएनए-आधारित चिकित्सीय कैंसर टीकों का कई वर्षों से अध्ययन किया जा रहा है। नैदानिक ​​​​परीक्षणों में हाल की प्रगति ने चयनित कैंसर रोगियों15e17 में उनकी अनुप्रयोग क्षमता का भी प्रदर्शन किया है। पेप्टाइड कैंसर टीकों के विपरीत, जो सहायक अणुओं18ई20 से तैयार किए जाते हैं, एमआरएनए वैक्सीन कण स्व-सहायक के रूप में भी काम कर सकते हैं।

उदाहरण के लिए, एक दो-घटक एमआरएनए-आधारित कैंसर वैक्सीन जिसमें मुक्त और प्रोटामाइन कॉम्प्लेक्स एमआरएनए होता है, टोल-लाइक रिसेप्टर 7 (टीएलआर 7) सिग्नलिंग 22 को भी सक्रिय कर सकता है। हालाँकि, नग्न एमआरएनए से तीव्र जन्मजात प्रतिरक्षा विषाक्तता पर बढ़ती चिंता के साथ, अधिकांश जांचकर्ता और कंपनियां टीएलआर 23 द्वारा जन्मजात पहचान से बचने के लिए संशोधित आरएनए का उपयोग कर रही हैं। नतीजतन, लिपिड घटक एमआरएनए वैक्सीन कण में सहायक गतिविधि को बढ़ाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहे हैं, अधिमानतः गैर-टीएलआर सिग्नलिंग को सक्रिय करके। लिपिड-निर्मित, नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए आरएनए-एलपीएक्स पर एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि 1, 2- डाइ-ऑक्टाडेसेनिल -3- ट्राइमिथाइलमोनियम (डीओटीएमए, एक धनायनित लिपिड) / डायोलियोल्फोस्फेटिडाइलथेनॉलमाइन (डीओपीई, एक सहायक लिपिड) लिपोसोम से बना है। प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के स्राव को विनियमित करने में इंटरल्यूकिन 1 (IL1)-इंटरल्यूकिन 1 रिसेप्टर प्रतिपक्षी (IL -1ra) अक्ष का सक्रियण, और मोनोसाइट्स24 में दो-चरणीय इन्फ्लेमसोम मार्ग को सक्रिय करने की आवश्यक भूमिका। दिलचस्प बात यह है कि एलएनपी-आधारित बीएनटी162बी2 पर एक और हालिया जांच एएलसी-0315 (एक आयनित लिपिड), 1,2-डिस्टीयरॉयल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलीन (डीएसपीसी, एक सहायक लिपिड) के साथ तैयार की गई है। , पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल -2000-एन, एन-डी टेट्राडेसिल एसिटामाइड (पीईजी2000-डीटीए), और कोलेस्ट्रॉल ने टाइप I इंटरफेरॉन-निर्भर एमडीए5 सिग्नलिंग को सक्रिय करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई, लेकिन टीएलआर या इन्फ्लेमसोम दोनों को उत्तेजित करने में नहीं। कोविड वैक्सीन की जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा25। ये अध्ययन इस संभावना की ओर इशारा करते हैं कि परिवर्तनीय लिपिड अणुओं से युक्त डिलीवरी प्लेटफ़ॉर्म वैक्सीन गतिविधि के लिए विभिन्न सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्गों पर निर्भर हो सकते हैं। इस प्रकार, एमआरएनए चिकित्सा विज्ञान को और बेहतर बनाने के लिए प्रमुख अणुओं और उनके संयोजनों के कार्य की पूरी तरह से जांच करना महत्वपूर्ण है।

वर्तमान अध्ययन में, हमने चिकित्सीय कैंसर वैक्सीन में व्यक्तिगत घटकों की कार्यात्मक भूमिका का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग स्थापित किए हैं। एमआरएनए वैक्सीन कण (एमवीपी) एक प्रोटामाइन/एमआरएनए कोर से बना होता है जो एक लिपिड शेल में समाहित होता है जिसमें एक धनायनित लिपिड, एक सहायक लिपिड, एक पेगीलेटेड लिपिड और कोलेस्ट्रॉल होता है (चित्र 1ए)। यह प्रदर्शित किया गया है कि चार्ज किए गए लिपिड को शामिल करने से लक्षित आरएनए डिलीवरी26 की सुविधा मिल सकती है, और डायोलेओलेथाइल फॉस्फेटिडिलकोलाइन (ईडीओपीसी) और डायोलेओइल -3- ट्राइमेथाइलमोनियम प्रोपेन (डीओटीएपी) दो धनायनित लिपिड हैं जिनका इस उद्देश्य के लिए परीक्षण किया गया है। हमने एमआरएनए कोर, एमआरएनए-मुक्त वाहन और संपूर्ण एमवीपी द्वारा इंटरफेरॉन-बी (आईएफएन-बी), आईएल -1बी, और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-ए (टीएनएफ-ए) की अभिव्यक्ति की उत्तेजना की जांच की, और ऐसी गतिविधियों को TLR7, माइटोकॉन्ड्रियल एंटीवायरल सिग्नलिंग (MAVS, जिसे IPS-1 के रूप में भी जाना जाता है), IFN जीन के उत्तेजक (STING), और IFN-b (TRIF) सिग्नलिंग को प्रेरित करने वाले TIR-डोमेन-युक्त एडॉप्टर से सहसंबद्ध किया गया है। इसके बाद, हमने आईएफएन-बी और टीएनएफ-ए अभिव्यक्ति को उत्तेजित करने में कोर में प्रोटामाइन और शेल में धनायनित लिपिड की भूमिका की जांच की। अंत में, हमने जंगली-प्रकार और जीन-नॉकआउट चूहों में एमवीपी से एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की तुलना की।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-एंटीट्यूमर के लाभ

2। सामग्री और विधि

2.1. सामग्री

1,2-डायोलॉयल-एसएन-ग्लिसरो-3-एथिलफॉस्फोकोलीन (ईडीओपीसी) (890704), 1,{7}}डायोलॉयल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फेटिडिल-इथेनॉलमाइन (डीओपीई) (850725) ), 1,2-डिस्टीयरॉयल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोएथेनॉलमाइन-एन- [एमिनो(पॉलीइथाइलीन ग्लाइकॉल)-2000 (डीएसपीई-पीईजी2के) (880128), 1,2- डायोलॉयल-3-ट्राइमेथाइलमोनियम-प्रोपेन (डीओटीएपी) (890890), 1,{30}} डायओलेयल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलीन (डीओपीसी) (850375) अवंती पोलर लिपिड्स, इंक. से खरीदे गए थे। बर्मिंघम, एएल, यूएसए)। कोलेस्ट्रॉल (C8667) सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से प्राप्त किया गया था। अभिकर्मकों को क्रमशः DSPE-PEG2k के लिए 2 mg/mL, कोलेस्ट्रॉल और DOPC के लिए 10 mg/mL और EDOPC, DOPE और DOTAP के लिए 20 mg/mL की सांद्रता पर इथेनॉल में भंग किया गया था। प्रोटामाइन सल्फेट (P4020) सिग्मा एल्ड्रिच से प्राप्त किया गया था। ओवलब्यूमिन (ओवीए-एमआरएनए) (एल-7210), ईजीएफपी (ईजीएफपी एमआरएनए) (एल-7201), और ल्यूसिफरेज (ल्यूक-एमआरएनए) (एल-7204) को एन्कोडिंग करने वाले एमआरएनए अणु यहां से खरीदे गए थे। ट्राइलिंक बायोटेक्नोलॉजीज (सैन डिएगो, सीए, यूएसए)। RNase-मुक्त पानी (W0805-010) GeneDEPOT (बेकर, TX, USA) से प्राप्त किया गया था। TLR7 एगोनिस्ट इमीकिमॉड (tlrimq) और स्टिंग एगोनिस्ट 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) इनविवोजेन (सैन डिएगो, सीए, यूएसए) के उत्पाद थे। लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 (11668019) और क्वांट-आईटी™ रिबोग्रीन™ आरएनए परख किट (आर11490) थर्मो फिशर साइंटिफिक (वॉलथम, एमए, यूएसए) से खरीदे गए थे। पुनः संयोजक माउस जीएम-सीएसएफ (554586) बीडी बायोसाइंसेज (सैन डिएगो, सीए, यूएसए) से खरीदा गया था। 500 प्रोटीन ट्रांसपोर्टर इनहिबिटर कॉकटेल (00-4980-93) इनविट्रोजन का एक उत्पाद था। साइटोफिक्स/साइटोपर्म किट (एबी_2869010) बीडी बायोसाइंसेज से खरीदी गई थी। EasySep™ माउस टी सेल आइसोलेशन किट (19851) STEMCELL Technologies, Inc. (वैंकूवर, BC, CAN) से प्राप्त किया गया था। निम्नलिखित एंटीबॉडीज बायोलेजेंड (सैन डिएगो, सीए, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे: एंटी-सीडी80-पीई-साइ7 (104734), एंटी-सीडी{70}}एफआईटीसी (105006), एंटी-सीडी11बी-एपीसी- Cy7 (101226), एंटी-सीडी8-BV510 (100752), एंटी-सीडी44-APC (103012), एंटी-CD{86}}APC (104514) और एंटी-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), एंटी-CD64- PE-Cy7 (139314), एंटी-B220-APC (103212), एंटी-MHCII-BV711 (107643), और एंटी-सीडी103-पीई (121406)। एंटी-सीडी40-एफआईटीसी (553723), एंटी-एलवाई6सी-एएफ700 (557979), और एंटी-आईएफएन-जी-पीई (554412) बीडी बायोसाइंसेज से थे। OVA257e264-MHCI डेक्सट्रामरPE (JD2163) को इम्मुडेक्स (फेयरफैक्स, VA, यूएसए) से खरीदा गया था। IL{122}}b (EM2IL1B) और TNF-a (BMS607-3) के लिए ELISA किट इनविट्रोजन से खरीदे गए थे, और CCL5 (DY478) और IFN-b (DY8234) के लिए ELISA किट R&D सिस्टम्स से प्राप्त किए गए थे। , इंक. (मिनियापोलिस, एमएन, यूएसए)। वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी जिनमें एंटी-एमएवीएस (4983), एंटी-स्टिंग (13647), एंटी-टीबीके1 (3504), एंटीफॉस्फो-टीबीके1 (5483), एंटी-बी-एक्टिन (4970), और एंटी-जीएपीडीएच (5174) शामिल हैं। सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, इंक. (डेनवर, एमए, यूएसए) से खरीदे गए थे।

चित्र 1 एमआरएनए कणों की तैयारी और लक्षण वर्णन। (ए) वैक्सीन कण तैयारी का योजनाबद्ध दृश्य। (बी) एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन से पता चलता है कि 1:1 से 1:2 के अनुपात में एमआरएनए/प्रोटामाइन के साथ तैयार किए गए नमूनों में एमआरएनए अणुओं को नमूना-लोडिंग कुएं में बनाए रखा गया था। (सीईएफ) एनकैप्सुलेशन, पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स, जीटा क्षमता और आकार के प्रतिशत के आधार पर एमआरएनए वैक्सीन कणों (एमवीपी) की विशेषता। (जी) एमवीपी2 कणों की प्रतिनिधि टीईएम छवियां, स्केल बार जेड 50 एनएम। (एच) डीसी 2.4 कोशिकाओं को 16 घंटे के लिए ईजीएफपी-एमवीपी के साथ इलाज के बाद ईजीएफपी अभिव्यक्ति का प्रतिशत। (I) ईजीएफपी-व्यक्त करने वाली DC2.4 कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट इमेजिंग, स्केल बार Z 400 मिमी। (जे) 16 घंटे के लिए ल्यूसिफरेज़-एन्कोडिंग एमआरएनए के साथ एनकैप्सुलेटेड एमवीपी के साथ इलाज किए गए बीएमडीसी में बायोलुमिनसेंस पर मात्रात्मक विश्लेषण। (के) पीबीएस, एमआरएनए-मुक्त वाहन, एमआरएनए/प्रोटामाइन कोर, या एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी2 के साथ इलाज किए गए बीएमडीसी की व्यवहार्यता में परिवर्तन। उपचार सांद्रता एमआरएनए-समतुल्य थी। डेटा को माध्य SEM (n Z 3) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *पी <0.05; **पी <0.01.

2.2. कोशिका रेखाएँ और कोशिका संस्कृति

DC2.4 म्यूरिन डेंड्राइटिक सेल लाइन एटीसीसी (मानसस, वीए, यूएसए) से प्राप्त की गई थी, और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त आरपीएमआई -1640 में संवर्धित किया गया था। म्यूरिन मेलेनोमा सेल लाइन बी 16-ओवीए को डॉ. केनेथ रॉक, डाना-फ़ार्बर कैंसर इंस्टीट्यूट (बोस्टन, एमए, यूएसए) से प्राप्त किया गया था। बी16-ओवीए कोशिकाओं को 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक डीएमईएम में संवर्धित किया गया। म्यूरिन कोलन एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन MC38 को ATCC से खरीदा गया था। कोशिकाओं को ओवीए अभिव्यक्ति के साथ इंजीनियर किया गया था और 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डीएमईएम में संवर्धित किया गया था। सेल कल्चर को 5% CO2 के साथ 37 C पर बनाए रखा गया।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

2.3. एमआरएनए वैक्सीन कण तैयार करना

सभी एमआरएनए वैक्सीन कण कार्बनिक चरण और जलीय चरण को मिलाकर प्रिसिजन नैनोसिस्टम्स, इंक., (वैंकूवर, बीसी, कैन) के नैनोएसेम्बलर बेंचटॉप माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण का उपयोग करके तैयार किए गए थे। कार्बनिक चरण तैयार करने के लिए, EDOPC (20 mg/mL), DOPE (20 mg/mL), कोलेस्ट्रॉल (10 mg/mL), और bis-DSPE-PEG2k (2 mg/mL) को इथेनॉल में घोलकर 34 पर मिलाया गया। :30:35:1 एम अनुपात 9 एमएल/मिनट की प्रवाह दर के साथ। जलीय चरण एमआरएनए कोर तैयार करने के लिए, एमआरएनए को 9 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण में 1:1 (डब्ल्यू/डब्ल्यू) पर प्रोटामाइन सल्फेट के साथ मिलाया गया था। 20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के ऊष्मायन के बाद, जलीय चरण एमआरएनए कोर को एमआरएनए वैक्सीन कण उत्पन्न करने के लिए कार्बनिक चरण के साथ मिलाया गया था। 20 मिनट के बाद, वैक्सीन कण निलंबन को एमिकॉन अल्ट्रा सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर (एमडब्ल्यूसीओ 30 केडीए) में स्थानांतरित किया गया था, और इथेनॉल एकाग्रता को 25% से 2.5% तक पतला करने के लिए 9- मात्रा आणविक ग्रेड पानी जोड़ा गया था। इसके बाद कण निलंबन को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 2000 ग्राम (मल्टीफ्यूज एक्स 4, थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित किया गया। आसमाटिक दबाव को समायोजित करने के लिए केंद्रित उत्पाद में 2 पीबीएस की एक समान मात्रा जोड़ी गई थी।

2.4. जेल मंदता परख

एमआरएनए/प्रोटामाइन कोर का सबसे पहले जेल मंदता द्वारा विश्लेषण किया गया था। संक्षेप में, एमआरएनए/प्रोटामाइन कोर जिसमें 0.5 मिलीग्राम एमआरएनए होता है, उसे 1 टीबीई समाधान में 1% एगरोज़ जेल के कुएं में लोड किया गया था और 30 मिनट के लिए 120 वी पर इलेक्ट्रोफोरेसिस किया गया था (पॉवरपैक ™, बायोरैड कंपनी, लिमिटेड, हरक्यूलिस, सीए)। आरएनए बैंड को जेलरेड (बायोटियम, हेवर्ड, सीए) से रंगा गया और जेलडॉक सिस्टम (जेल डॉक एक्सआरþ, बायोरैड कंपनी लिमिटेड) से पता लगाया गया।

2.5. एमआरएनए वैक्सीन कणों की विशेषता

आकार वितरण और ज़ेटा क्षमता को गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन ज़ेटासाइज़र (ज़ेटासाइज़र नैनो, मालवर्न पैनालिटिकल, इंक., वेस्टबोरो, एमए, यूएसए) के साथ मापा गया था। एनकैप्सुलेशन दर क्वांट-आईटी™ रिबोग्रीन™ आरएनए परख किट का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। संक्षेप में, एक वैक्सीन कण का नमूना जिसमें 0.5 मिलीग्राम एमआरएनए था, उसे ट्राइसेईडीटीए बफर (10 एमएमओएल/एल ट्राइसेएचसीएल, 1 एमएमओएल/एल ईडीटीए, पीएच 7.5) के साथ 2% ट्राइटन-एक्स100 के साथ या उसके बिना पतला किया गया था। {10}}अच्छी थाली। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के ऊष्मायन के बाद, रिबोग्रीन को प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया, और फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापा गया। इनकैप्सुलेशन दक्षता की गणना Eq में दिखाए अनुसार की गई थी। (1): वैक्सीन कणों की ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) पहले वर्णित प्रक्रिया 9 के बाद की गई थी।

2.6. जानवरों

सभी जानवरों के ऑपरेशन को ह्यूस्टन मेथोडिस्ट अस्पताल की पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल संख्या AUP06200042) द्वारा अनुमोदित किया गया था। चूहों को ऐसे वातावरण में रखा गया था जो नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ और अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ लेबोरेटरी एनिमल केयर मानकों के नियामक मानकों को पूरी तरह से पूरा करता था। जंगली प्रकार के C57BL/6J चूहों और Tlr7/, स्टिंग/, Mavs/, और ट्राइफ/चूहों सहित आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों को जैक्सन प्रयोगशाला से खरीदा गया था।

2.7. म्यूरिन अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं (बीएमडीसी) की उत्पत्ति

पूर्ण आरपीएमआई 1640 के साथ फीमर और टिबिया से अस्थि मज्जा कोशिकाओं को बाहर निकाला गया। लाल रक्त कोशिकाओं को एक एसीके लिसीस बफर के साथ जोड़ा गया था, और अपरिपक्व अस्थि मज्जा कोशिकाओं को आरपीएमआई 1640 में 10 के लिए 20 एनजी / एमएल पुनः संयोजक म्यूरिन जीएम-सीएसएफ के साथ संवर्धित किया गया था। 5% CO2 के साथ 37 C पर दिन। सेल कल्चर मीडियम को 3, 6 और 8वें दिन ताज़ा किया गया और 10वें दिन गैर-अनुयाई डेंड्राइटिक कोशिकाओं को एकत्र किया गया।

2.8. साइटोकिन्स और केमोकाइन का मापन

BMDCs को 24-सेल्स/वेल्स के घनत्व पर एक वेल प्लेट में डाला गया था। निपटान के 1 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 1 मिलीग्राम/एमएल इमीकिमॉड, 20 मिलीग्राम/एमएल 20 30 -सीजीएएमपी, (1 मिलीग्राम/एमएल एमआरएनए समतुल्य) वैक्सीन कणों या नियंत्रणों के साथ इलाज किया गया। सेल कल्चर मीडिया को 24 घंटे बाद एकत्र किया गया, और टीएनएफ-ए, सीसीएल5, आईएफएन-बी, और आईएल-1बी के स्तर को निर्माता द्वारा सुझाई गई प्रक्रियाओं का पालन करके एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) किट का उपयोग करके मापा गया।

सिस्टैंच पौधा-बढ़ाने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली

2.9. डीसी अभिकर्मक, डीसी परिपक्वता और उत्तेजना पर विश्लेषण करता है

इन विट्रो में डीसी अभिकर्मक दक्षता का विश्लेषण करने के लिए, DC2.4 कोशिकाओं को 2. 5 105 कोशिकाओं/वेल पर एक 24- वेल प्लेट में रखा गया था। कोशिकाओं को 1 मिलीग्राम एमआरएनए/एमएल की अंतिम सांद्रता पर ईजीएफपी- या ल्यूसिफेरेज-एन्कोडिंग एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड कणों के साथ इलाज किया गया था। कोशिकाओं को 24 घंटे बाद एकत्र किया गया, पीबीएस समाधान में 2% एफबीएस के साथ धोया गया, और फिर बीडी एलएसआर II प्रवाह साइटोमीटर (एलएसआर II, बीडी बायोसाइंसेज, सैन जोस, सीए) के साथ प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए लागू करने से पहले उसी समाधान में पुन: निलंबित कर दिया गया। . इन विट्रो में डीसी परिपक्वता और एंटीजन प्रस्तुति को मापने के लिए, बीएमडीसी को 2.{12}} कोशिकाओं/वेल में एक 24-वेल प्लेट में डाला गया और 24 घंटे के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल ओवीए-एमवीपी के साथ इलाज किया गया। BMDCs को 30 मिनट के लिए CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80, और DC परिपक्वता के लिए CD86 और एंटीजन प्रस्तुति के लिए एंटी-H{23}}Kb (SIINFEKL) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। विवो में उत्तेजक क्षमता निर्धारित करने के लिए, C57BL/6J चूहों को फूटपैड में प्रति माउस 10 मिलीग्राम OVA-MVP के साथ एक बार टीका लगाया गया था, और ड्रेनिंग पॉप्लिटियल एलएन को 24, 48 और निम्नलिखित सेल सतह मार्करों से काटा गया था: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86।

2.10. फ्लो साइटोमेट्री टी सेल सक्रियण और प्रसार पर विश्लेषण करती है

विवो में टी सेल सक्रियण को मापने के लिए, चूहों को एक बार 10 मिलीग्राम ओवीए-एमवीपी का टीका लगाया गया था, और पॉप्लिटियल एलएन को 24 या 48 घंटे पर अलग किया गया था। टी कोशिकाओं को निम्नलिखित एंटीबॉडी से रंगा गया था: सीडी45, सीडी3, सीडी4, सीडी8, और सीडी69। एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, दूसरे टीकाकरण के 5 दिन बाद ट्यूमर, प्लीहा और पॉप्लिटियल लिम्फ नोड्स की कटाई की गई। एकल-कोशिका निलंबन उत्पन्न करने के लिए ऊतकों को संसाधित किया गया था, और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए कोशिकाओं को टी सेल-विशिष्ट एंटीबॉडी और OVA257e264-MHCI डेक्सट्रामर से रंग दिया गया था। इंट्रासेल्युलर आईएफएन-जी स्तर को मापने के लिए, स्प्लेनोसाइट्स या पॉप्लिटियल एलएन और ट्यूमर से पृथक कोशिकाओं को 10 मिलीग्राम/एमएल ओवीए257ई264 पेप्टाइड के साथ पूर्ण आरपीएमआई 1640 माध्यम में 55 एमएमओएल/एल बी-मर्कैप्टोएथेनॉल और 1 प्रोटीन ट्रांसपोर्टर अवरोधक के साथ उत्तेजित किया गया था। 18 घंटे के लिए कॉकटेल। कोशिकाओं को काटा गया और टी सेल-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया। साइटोफिक्स/साइटोपर्म किट के साथ निर्धारण और पारगम्यीकरण के बाद, कोशिकाओं को एंटी-आईएफएन-जी एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया और बीडी एलएसआर II प्रवाह साइटोमीटर (बीडी बायोसाइंसेज) पर विश्लेषण के लिए लागू किया गया। टी सेल प्रसार को मापने के लिए, टी कोशिकाओं को एक माउस टी सेल आइसोलेशन किट का उपयोग करके ओटी-आई ट्रांसजेनिक चूहों के तिल्ली से अलग किया गया था। उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए आरपीएमआई 1640 में 1 मिमीओल/एल सीएफएसई युक्त 200 मिलीग्राम/एमएल बीएसए से रंगा गया था। सीएफएसई लेबल वाली टी कोशिकाओं को 5 मात्रा में ठंडे पूर्ण आरपीएमआई 1640 के साथ दो बार धोया गया था। इस बीच, परिपक्व बीएमडीसी का इलाज किया गया था टी सेल अलगाव से पहले 24 घंटे के लिए 2 मिलीग्राम/एमएल ओवीए एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी। एक बार जब टी कोशिकाएं तैयार हो गईं, तो बीएमडीसी और टी कोशिकाओं को 72 घंटे के लिए 1:5 (डीसी: टी) के अनुपात में सह-संवर्धित किया गया। कोशिकाओं को एकत्र किया गया और टी कोशिकाओं के लिए सतह एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया, प्रसार का परीक्षण बीडी एलएसआर II प्रवाह साइटोमीटर (बीडी बायोसाइंसेज) का उपयोग करके किया गया और विश्लेषण किया गया। सभी फ्लो साइटोमेट्री परिणामों का फ्लोजो वी10 सॉफ्टवेयर (एशलैंड, ओएच, यूएसए) के साथ विश्लेषण किया गया।

2.11. जीवित चूहों में प्रोटीन अभिव्यक्ति पर नज़र रखना

BALB/c चूहों का इलाज 10 मिलीग्राम ल्यूक एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी के साथ इंट्रा-फुटपैड इंजेक्शन द्वारा किया गया। उन्हें 6, 12, 24, या 48 घंटे बाद प्रति माउस 30 मिलीग्राम रेडिजेक्ट डी-ल्यूसिफ़ेरिन के साथ इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया, और बायोल्यूमिनसेंस को ज़ेनोजेन आईवीआईएस -200 इमेजिंग सिस्टम (कैलिपर लाइफ साइंसेज, इंक, हॉपकिंटन,) के साथ मापा गया। एमए, यूएसए)।

2.12. एलिसपॉट परख

आईपी ​​​​फ़िल्टर प्लेटों को 35% इथेनॉल के 5 0 एमएल से पहले धोया गया था और इथेनॉल के वाष्पित होने से पहले पीबीएस के साथ 3 बार अच्छी तरह से धोया गया था। बाद में प्लेटों को रात भर 4 C पर एंटी-आईएफएन-जी कैप्चर एंटीबॉडी के साथ लेपित किया गया। प्लेटों को 37 सी पर 2 घंटे के लिए 55 एमएमओएल/एल बी-मर्कैप्टोएथेनॉल युक्त आरपीएमआई 1640 पूर्ण माध्यम से अवरुद्ध किया गया था। कोशिकाओं (1  105 स्प्लेनोसाइट्स, पॉप्लिटियल एलएन से 1  105 कोशिकाएं) को प्रत्येक कुएं में डाला गया था, और 10 मिलीग्राम/एमएल OVA257e264 पेप्टाइड के साथ 36 घंटे के लिए उत्तेजित किया गया। मीडिया को त्याग दिया गया, और कोशिकाओं को पीबीएसटी (पीबीएस जिसमें 0.05% ट्वेन 20 था) के साथ 4 बार और पीबीएस के साथ दो बार धोया गया। अंतिम धुलाई के बाद, एक एंटी-आईएफएन-जी डिटेक्शन एंटीबॉडी जोड़ा गया और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। प्लेटों को पीबीएसटी के साथ 4 बार और पीबीएस के साथ दो बार धोया गया, और एविडिन-एचआरपी जोड़ा गया और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। अंत में, जैसा कि ऊपर वर्णित है, प्लेटों को फिर से पीबीएसटी और पीबीएस से धोया गया, और 50 एमएल एईसी सब्सट्रेट लगाया गया और स्पॉट प्रतिक्रिया के लिए देखा गया। जब धब्बे दिखाई देने लगे, तो एईसी सब्सट्रेट को हटाकर और इसे 5 बार डबल आसुत जल से धोकर प्रतिक्रिया रोक दी गई। रात भर हवा में सुखाने के बाद, प्लेटों को CTL इम्यूनोस्पॉट सीरीजS5 वर्सा ELISpot एनालाइजर (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., क्लीवलैंड, OH, यूएसए) का उपयोग करके स्कैन और विश्लेषण किया गया।

2.13. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

जंगली प्रकार, माव्स केओ या स्टिंग केओ चूहों से प्राप्त बीएमडीसी एकत्र किए गए थे, और कोशिकाओं को प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों के साथ पूरक आरआईपीए सेल लिसीस बफर में लाइस किया गया था। सेल लाइसेट में प्रोटीन सांद्रता को बीसीए प्रोटीन परख किट से मापा गया था। प्रोटीन के नमूनों को सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) से अलग किया गया और एक पॉलीविनाइलिडीन डिफ्लुओराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में स्थानांतरित किया गया। MAVS और STING अभिव्यक्ति का पता तब चला जब झिल्ली को 1:2000 कमजोर पड़ने पर एक एंटी-MAVS या एंटी-स्टिंग एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया और उसके बाद सुपरसिग्नल वेस्ट पिको और फेम्टो केमिलुमिनसेंट सबस्ट्रेट के साथ इम्यूनोडिटेक्शन किया गया। स्टिंग पाथवे की सक्रियता को मापने के लिए, जंगली प्रकार के चूहों से प्राप्त बीएमडीसी को 2 घंटे के लिए संकेतित एकाग्रता पर वाहन या ओवीए एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी के साथ इलाज किया गया था। कोशिकाओं को लाइज़ किया गया और 1:2000 कमजोर पड़ने पर एंटी-टीबीके1 और एंटीफॉस्फो-टीबीके1 एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण के लिए आगे बढ़ाया गया।

2.14. एंटीट्यूमर परख

म्यूरिन ट्यूमर मॉडल प्रति माउस 2  105 कोशिकाओं बी {{1} ओवीए मेलेनोमा कोशिकाओं या 5  105 एमसी 38- ओवीए कोशिकाओं को 6 से {{5} के बाएं पार्श्व में टीका लगाकर उत्पन्न किए गए थे। }सप्ताह की मादा C57BL/6J चूहे। चूहों को बेतरतीब ढंग से उपचार समूहों में आवंटित किया गया और 10 मिलीग्राम ओवीए एमवीपी या फ़ुटपैड में नियंत्रण के साथ 7 दिनों के अंतराल पर दो बार अलग किया गया। हर 2 दिन में ट्यूमर के विकास की निगरानी की गई। ट्यूमर की मात्रा की गणना Eq के अनुसार की गई थी। (2):

दूसरे टीकाकरण के 5 दिन बाद चूहों को इच्छामृत्यु दी गई और ट्यूमर के ऊतकों का वजन दर्ज किया गया।

2.15. सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी परिणाम माध्य SEM के रूप में प्रस्तुत किए गए हैं। बहु-समूह तुलना के लिए तुकी के सुधार और दो-समूह तुलना के लिए एक अयुग्मित दो-पूंछ वाले टी-परीक्षण का उपयोग करके एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण के साथ सांख्यिकी का मूल्यांकन किया गया था। डेटा का विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म v8.0.2 सॉफ़्टवेयर के साथ किया गया। P < 0.{{10}}5 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0.005; ****पी <0.001).

3। परिणाम

3.1. एमवीपी डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी) में मजबूत एमआरएनए अभिव्यक्ति की मध्यस्थता करता है

हमने दो-चरणीय सूक्ष्म-तरल दृष्टिकोण (छवि 1 ए) में कोर-शेल वैक्सीन कण तैयार किए, और उच्च स्थिरता, उच्च सेलुलर ग्रहण और डीसी में उच्च अभिव्यक्ति क्षमता के साथ एक वैक्सीन कण को ​​इकट्ठा करने के लिए नैनोकण में व्यक्तिगत घटकों का व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन किया। जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस से पता चला कि एक बार एमआरएनए-टू-प्रोटामाइन अनुपात 1 या उससे कम होने पर एक स्थिर एमआरएनए कोर बनाया जा सकता है (चित्र 1बी)। सरोगेट मार्कर के रूप में ईजीएफपी-एन्कोडिंग एमआरएनए का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि 34% ईडीओपीसी/30% डीओपीई/35% कोलेस्ट्रॉल/1% डीएसपीईपीईजी2के के दाढ़ अनुपात पर एक लिपिड संरचना एक आदर्श एनकैप्सुलेशन दर और सर्वोत्तम अभिव्यक्ति दक्षता प्रदान करती है (तालिका 1, सहायक सूचना चित्र. S1AeS1D). चार्ज अनुपात में बदलाव से इनकैप्सुलेशन दर, पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स, या कणों के सतह चार्ज में महत्वपूर्ण बदलाव नहीं हुआ (तालिका 2, चित्र 1CeE); हालाँकि, परिणामी कणों का आकार 70 और 80 एनएम व्यास के बीच था जब अनुपात 12 और 16 के बीच था, जबकि अनुपात 120e130 एनएम के व्यास की तुलना में अनुपात सीमा से बाहर हो गया (चित्र 1एफ और जी)। सबसे अच्छी अभिव्यक्ति एमवीपी2 से उपचारित DC2.4 कोशिकाओं में पाई गई, जिसका चार्ज अनुपात 12 था (चित्र 1H और I)। एक समान पैटर्न तब देखा गया जब कणों को एमआरएनए एन्कोडिंग ल्यूसिफेरेज के साथ तैयार किया गया था, और खुराक पर निर्भर अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था (छवि 1 जे)। एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड कणों ने वांछनीय स्थिरता का प्रदर्शन किया क्योंकि उन्होंने लियोफिलाइज़ेशन या फ्रीज-पिघलना (छवि एस 1 ई और एस 1 एफ) के बाद गतिविधि नहीं खोई। इसके अलावा, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं (बीएमडीसी) को अकेले एमआरएनए कोर, एमआरएनए अणुओं के बिना तैयार एक वाहन कण, या एमआरएनए युक्त एमवीपी 2 (छवि 1K) के साथ इलाज करने के बाद कोई साइटोटॉक्सिसिटी नहीं थी। इस प्रकार, एमवीपी2 ने सर्वोत्तम अभिव्यक्ति क्षमता प्रदर्शित की। इसका उपयोग अध्ययन में आगे के सभी प्रयोगों के लिए किया गया था, और शेष पाठ में इसे एमवीपी के रूप में लेबल किया गया था। एमवीपी कण विवो में एमआरएनए अणुओं को प्रभावी ढंग से वितरित कर सकते हैं, और शरीर के वजन में बदलाव के आधार पर एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी से कोई पता लगाने योग्य विषाक्तता नहीं थी (चित्र। S1GeS1I)।

3.2. एमवीपी इन विट्रो और विवो में एंटीजन प्रस्तुति और टी सेल सक्रियण को प्रभावी ढंग से प्रेरित करता है

हमने एमआरएनए कोर, एमआरएनए-मुक्त वाहन और ओवीए एमआरएनए इनकैप्सुलेटेड एमवीपी तैयार किया, और उन्हें डीसी परिपक्वता और एंटीजन प्रस्तुति (छवि 2 ए) का परीक्षण करने के लिए लागू किया। एमवीपी से उपचारित बीएमडीसी ने सीडी40, सीडी80, और सीडी86 (चित्र 2बीईडी) सहित डीसी परिपक्वता मार्करों की खुराक पर निर्भर ओवरएक्प्रेशन प्रदर्शित किया। एमआरएनए-मुक्त वाहन या एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी के साथ उपचार ने एमएचसी I ओवरएक्सप्रेशन (छवि 2ई) को ट्रिगर किया, यह दर्शाता है कि प्रभाव एमआरएनए कॉम्प्लेक्स के बजाय वाहन से जुड़ा था। इसके अलावा, एमवीपी उपचार के परिणामस्वरूप OVA257e264 एंटीजन एपिटोप-एमएचसी I कॉम्प्लेक्स (SIINFEKL-MHC I) का कोशिका सतह प्रदर्शन हुआ, जिसे एंटी-SIINFEKL-MHCI एंटीबॉडी (छवि 2F) के साथ पाया गया, जो BMDCs द्वारा प्रभावी एंटीजन प्रसंस्करण और प्रस्तुति का प्रदर्शन करता है। . इसके अलावा, B3Z के साथ MVP-उपचारित BMDCs का सह-ऊष्मायन, एक CD8þ T सेल लाइन जो विशेष रूप से OVA257e264 एपिटोप को पहचानती है, या OT-I माउस के प्लीहा से अलग की गई T कोशिकाएं जो OVA257e264-विशिष्ट T सेल व्यक्त करती हैं रिसेप्टर, ट्रिगर आईएल -2 स्राव, एक परिणाम अकेले वाहन या अकेले एमआरएनए/प्रोटामाइन कोर के साथ इलाज किए गए डीसी के साथ जुड़े टी कोशिकाओं में नहीं देखा गया (छवि 2 जी)। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण ने एमवीपी (छवि 2H और I) के साथ सह-ऊष्मायन के बाद 32.5% प्रोलिफ़ेरेटिव CD8þ T कोशिकाओं का पता लगाया। इंट्राडर्मल इंजेक्शन द्वारा चूहों के इलाज के लिए ओवीए एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी कण भी लगाए गए थे। ड्रेनिंग लिम्फ नोड्स में कोशिकाओं की जांच से पहले 48 घंटों के दौरान दोनों शास्त्रीय डीसी (सीडी8þ डीसी, सीडी11बीþ डीसी, सीडी103þ डीसी) और प्लास्मेसीटॉइड डीसी (पीडीसी) के बीच सीडी 86 अभिव्यक्ति में लगातार वृद्धि देखी गई, जो डीसी की उत्तेजना का संकेत देती है। परिपक्वता (चित्र 2जे)। उपचार ने लिम्फ नोड्स में CD8þ T कोशिकाओं के संवर्धन को भी बढ़ावा दिया, CD69þ CD8þ T कोशिकाओं (चित्र 2K और L) की आबादी में उल्लेखनीय वृद्धि हुई, जो उपचार द्वारा T कोशिका सक्रियण का संकेत देता है। टी सेल सक्रियण का निर्धारण करने के लिए, हमने एमवीपी उपचार के 3, 5, या 7 दिनों के बाद ड्रेनिंग लिम्फ नोड्स में कोशिकाओं को एकत्र किया, और कोशिकाओं को ओवीए257ई264 एंटीजन पेप्टाइड (सहायक सूचना चित्र एस2) के साथ चुनौती दिए जाने के बाद एलीस्पॉट विश्लेषण किया। एमवीपी उपचार ने उस समय के दौरान आईएफएन-जी-स्रावित कोशिकाओं में एक बड़ा उछाल ला दिया, जिसकी गतिविधि 5वें दिन चरम पर थी (चित्र 2एम)। इन परिणामों ने एमवीपी के साथ उपचार के बाद मजबूत डीसी उत्तेजना, एंटीजन प्रस्तुति और टी-सेल सक्रियण का प्रदर्शन किया।

तालिका 1 ईजीएफपी-एन्कोडिंग एमआरएनए के साथ संपुटित नैनोकणों की संरचना।

तालिका 2एमवीपी की लिपिड संरचना और चार्ज अनुपातकण.

3.3. एमवीपी कोलोरेक्टल ट्यूमर और मेलेनोमा के म्यूरिन मॉडल में शक्तिशाली एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्राप्त करता है

एमवीपी को एमसी38 कोलन कैंसर और बी16 मेलेनोमा वाले चूहों के इलाज के लिए लागू किया गया था। दोनों मॉडलों में, ओवीए एमआरएनए एनकैप्सुलेटेड एमवीपी के साथ उपचार ने ट्यूमर के विकास को दो बार पूरी तरह से अवरुद्ध कर दिया; इसकी तुलना में, अकेले ईजीएफपी एमआरएनए एनकैप्सुलेटेड एमवीपी या वाहन के साथ उपचार से ट्यूमर के विकास पर कोई पता लगाने योग्य निरोधात्मक प्रभाव नहीं पड़ा (चित्र 3एईडी, सहायक सूचना चित्र एस3)। लिम्फ नोड्स (छवि 2) में सीडी 4 से सीडी 8 शिफ्ट के पैटर्न के अनुरूप, हमने ओवीए एमआरएनए इनकैप्सुलेटेड एमवीपी (छवि 3 ई) के साथ इलाज किए गए चूहों से ट्यूमर में सीडी 8þ / सीडी 4þ टी सेल अनुपात में वृद्धि देखी। इसके अलावा, हमने ओवीए एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी के साथ इलाज किए गए चूहों में तिल्ली, लिम्फ नोड्स और ट्यूमर में आईएफएन-जीþसीडी8þ टी कोशिकाओं में ऊंचे स्तर का पता लगाया, लेकिन अकेले वाहन या जीएफपी एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी (छवि 3FeH, सहायक सूचना) के साथ नहीं चित्र S4). इसके अलावा, OVA mRNA-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी उपचार समूह के ट्यूमर में OVA257e264-MHCI डेक्सट्रामर-पॉजिटिव CD8þ T कोशिकाओं में उल्लेखनीय वृद्धि हुई, जो एंटीजन-विशिष्ट CD8þ T कोशिकाओं के प्रसार का संकेत देती है (चित्र 3I)। प्लीहा और लिम्फ नोड्स से पृथक कोशिकाओं के साथ एलीस्पॉट परख ने टी सेल सक्रियण पर और अधिक सहायता प्रदान की (चित्र 3JeM)।

3.4. एमवीपी स्टिंग-निर्भर सिग्नलिंग को सक्रिय करके जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उत्तेजित करता है

हमने प्रकार I IFN और सूजन संबंधी साइटोकिन अभिव्यक्ति की उत्तेजना के लिए जिम्मेदार प्रमुख कारकों और मार्गों की पहचान करने के लिए बीएमडीसी के इलाज के लिए एमआरएनए कोर, एमआरएनए मुक्त वाहन और एमआरएनए एनकैप्सुलेटेड एमवीपी लागू किया। दिलचस्प बात यह है कि एमवीपी, आईएफएन-बी स्राव को ट्रिगर करने में टीएलआर7 एगोनिस्ट इमीकिमॉड जितना ही शक्तिशाली था, और अकेले वाहन ने भी आईएफएन-बी स्राव को बढ़ावा देने में गतिविधि दिखाई, हालांकि इसकी क्षमता एमवीपी जितनी अधिक नहीं थी; हालाँकि, अकेले mRNA कोर IFN-b स्राव को उत्तेजित करने में अप्रभावी था (चित्र 4A)। परिणाम में निहित है कि वाहन में एमआरएनए और घटकों दोनों को आईएफएन-बी अभिव्यक्ति को अधिकतम करने की आवश्यकता थी। इस बीच, इमीकिमॉड और वाहन ने टीएनएफ-ए और आईएल -1बी अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने में समान गतिविधि दिखाई, जबकि एमवीपी उनमें से किसी एक की तुलना में बहुत अधिक शक्तिशाली था (छवि 4 बी और सी)। CCL5 की अभिव्यक्ति, एक साइटोकिन जो आमतौर पर NF-kB और IFN नियामक कारकों से जुड़ा होता है, इमीकिमॉड, केवल वाहन, या MVP (चित्र 4D) से उपचारित कोशिकाओं में समान रूप से उत्तेजित किया गया था। टीएलआर7, एमएवीएस, स्टिंग और टीआरआईएफ प्रमुख सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्गों में प्रमुख कारक हैं जो वायरल आरएनए और क्षतिग्रस्त डीएनए28ई30 के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं में मध्यस्थता करते हैं। हमने टीएलआर7, माव्स, स्टिंग या ट्राइफ जीन नॉकआउट (केओ) वाले चूहों से बीएमडीसी उत्पन्न किया, और आईएफएन-बी और टीएनएफ-ए अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए एमआरएनए कोर, एमआरएनए-मुक्त वाहन, या एमआरएनए एनकैप्सुलेटेड एमवीपी के साथ कोशिकाओं का इलाज किया।

चित्र 2 एमवीपी द्वारा प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का उत्तेजना। (ए) एमआरएनए/प्रोटामाइन कोर, एमआरएनए-मुक्त वाहन और पूर्ण एमवीपी का योजनाबद्ध दृश्य। (बीईडी) 24 घंटे तक ओवीए-एमवीपी से उपचारित करने के बाद बीएमडीसी की परिपक्वता। (ई और एफ) एमएचसी I अभिव्यक्ति और 24 घंटे के लिए ओवीए-एमवीपी के साथ इलाज के बाद बीएमडीसी में ओवीए257ई264 एंटीजन एपिटोप-एमएचसी I कॉम्प्लेक्स। (जी) बी3जेड या ओटी-आई टी कोशिकाओं के साथ सह-इन्क्यूबेट किए गए उपचारित बीएमडीसी से आईएल का स्तर -2। (एच और आई) प्रोलिफेरेटिव टी कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। टी कोशिकाओं के प्रतिनिधि क्रोमैटोग्राम दिखाए गए हैं। (जे) विवो में एमवीपी उपचार के बाद डीसी परिपक्वता। C57BL/6J चूहों का इलाज OVA-MVP से किया गया, और पॉप्लिटियल लिम्फ नोड्स में DC का विश्लेषण किया गया। (के और एल) टी सेल जनसंख्या विश्लेषण। C57BL/6J चूहों का इलाज वाहन या OVA-MVP से किया गया, और पॉप्लिटियल लिम्फ नोड्स में टी कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री के साथ विश्लेषण किया गया। (एम) एलीस्पॉट परख। C57BL/6J चूहों का इलाज OVA-MVP से किया गया, और संकेतित समय बिंदुओं पर लिम्फ नोड्स एकत्र किए गए। IFN-g-व्यक्त कोशिकाओं की माप के लिए पृथक कोशिकाओं को लागू किया गया था। डेटा को माध्य SEM (n Z 3) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *पी < 0.05; **पी < 0.01; ***पी <0.005; ****पी <0.001; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं.

चित्र 3 एमवीपी से ट्यूमर-विरोधी गतिविधि। (ए) एमसी38-ओवीए ट्यूमर के विकास को रोकना। मादा C57BL/6J चूहों को दिन में 0 पर चमड़े के नीचे {{5} MC {{6}OVA ट्यूमर कोशिकाओं/माउस का टीका लगाया गया और पीबीएस नियंत्रण, वाहन नियंत्रण, GFP-MVP, या OVA-MVP के साथ इलाज किया गया। दिन 3 और 10. (बी) बी 16-ओवीए ट्यूमर के विकास को रोकना। मादा C57BL/6J चूहों को दिन में 2  105 बी 16- ओवीए ट्यूमर कोशिकाओं/माउस का टीका लगाया गया, और पीबीएस नियंत्रण, वाहन नियंत्रण, जीएफपी-एमवीपी, या ओवीए-एमवीपी के साथ इलाज किया गया। दिन 3 और 1 को 0। (सी और डी) 17वें दिन बी16-ओवीए ट्यूमर की छवि और वजन। (ई) उपचार के बाद चूहों के ट्यूमर में टी सेल की आबादी। (FeH) प्लीहा, लिम्फ नोड्स (एलएन) और उपचार के बाद चूहों के ट्यूमर में IFN-gþCD8þ T कोशिकाएं। (I) उपचार के बाद चूहों के ट्यूमर में ओवीए-विशिष्ट सीडी8þ टी कोशिकाएं। (जेईएम) उपचार के बाद चूहों से स्प्लेनिक और एलएन कोशिकाओं की एलीस्पॉट परख की छवियां और मात्रात्मक विश्लेषण। डेटा को माध्य SEM (n Z 5) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *पी < 0.05; **पी <0.01; ***पी <0.005; ****पी <0.001.

BMDCs में Mavs और स्टिंग की KO स्थिति की पुष्टि वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण (सहायक सूचना चित्र S5A) से की गई। आश्चर्यजनक रूप से, स्टिंग केओ ने अकेले वाहन और एमवीपी (छवि 4ई) दोनों से आईएफएन-बी स्राव पर उत्तेजक गतिविधि को मिटा दिया, यह दर्शाता है कि एमवीपी ने स्टिंग के माध्यम से टाइप I आईएफएन अभिव्यक्ति को सक्रिय किया है। धारणा का समर्थन करने के लिए, हमने टैंक-बाइंडिंग काइनेज 1 (टीबीके1) (छवि एस5बी) के फॉस्फोराइलेशन का पता लगाया, एक काइनेज जो आमतौर पर स्टिंग गतिविधि31 से जुड़ा होता है। इसके अलावा, यह मार्ग टीएलआर7 सिग्नलिंग से स्वतंत्र था, क्योंकि इमीकिमॉड से उपचारित कोशिकाओं में आईएफएन-बी अभिव्यक्ति से समझौता नहीं किया गया था (चित्र 4ई)। इसकी तुलना में, एमवीपी द्वारा प्रचारित आईएफएन-बी अभिव्यक्ति पर ट्रिफ़ या माव्स केओ का न्यूनतम प्रभाव था। जैसा कि अपेक्षित था, इमीकिमॉड टीएलआर7 केओ से प्राप्त बीएमडीसी में आईएफएन-बी स्राव को उत्तेजित करने में अप्रभावी था; हालाँकि, Tlr7 KO का MVP के उत्तेजक प्रभाव पर नकारात्मक प्रभाव पड़ा (चित्र 4E)। दिलचस्प बात यह है कि टीएनएफ पर एक अलग प्रोफ़ाइल देखी गई - एक ही उपचार से एक स्राव। स्टिंग, ट्राइफ या टीएलआर7 के नॉकआउट का एमवीपी उत्तेजित साइटोकिन अभिव्यक्ति पर कोई न्यूनतम प्रभाव नहीं पड़ा। दूसरी ओर, माव्स के नॉकआउट ने अकेले वाहन या एमवीपी (छवि 4F) के साथ इलाज किए गए कोशिकाओं में टीएनएफ-ए स्तर को नाटकीय रूप से कम कर दिया। परिणाम इंगित करता है कि एमएवीएस एमवीपी उपचार पर डीसी में टीएनएफ-एक अभिव्यक्ति का एक प्रमुख नियामक है।

3.5. एमवीपी आईएफएन-आई और सूजन संबंधी साइटोकिन्स के स्राव को बढ़ावा देने के लिए स्टिंग और एमएवीएस मार्गों को उत्तेजित करता है

स्टिंग और एमएवीएस सिग्नलिंग की उत्तेजना के लिए जिम्मेदार वाहन में घटकों की पहचान करने के लिए, हमने प्रमुख घटकों को प्रतिस्थापित या हटाकर वाहन और एमवीपी तैयार किए और उन्हें बीएमडीसी के उपचार के लिए लागू किया। स्टिंग एगोनिस्ट चक्रीय जीएमपी-एएमपी (सीजीएएमपी) आईएफएन-बी स्राव को उत्तेजित करने में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। वाहन में धनायनित लिपिड ईडीओपीसी को एक अन्य धनावेशित लिपिड, डीओटीएपी से बदलने से आईएफएन-बी स्राव पूरी तरह से नष्ट हो गया। इसकी तुलना में, वाहन और एमवीपी से उत्तेजक प्रभाव प्रोटामाइन के साथ या उसके बिना बरकरार रखा गया था, और ऐसी उत्तेजक गतिविधि एक अक्षुण्ण स्टिंग जीन (छवि 4 जी) पर निर्भर थी। दिलचस्प बात यह है कि ईडीओपीसी सहित लिपिड शेल के अलग-अलग घटकों के साथ इलाज किए गए बीएमडीसी ने मजबूत आईएफएन-बी स्राव (सहायक सूचना चित्र एस 6) को बढ़ावा नहीं दिया। इस प्रकार, ईडीओपीसी स्टिंग सक्रियण के लिए आवश्यक था, और इसकी गतिविधि लिपिड नैनोकण (यानी, वाहन या एमवीपी) के गठन पर निर्भर है। ईडीओपीसी या डीओटीएपी के साथ तैयार किए गए वाहन और एमवीपी को जंगली प्रकार और माव्स केओ चूहों से प्राप्त बीएमडीसीएस के इलाज के लिए भी लागू किया गया था, और सेल विकास मीडिया में टीएनएफ-स्तर निर्धारित किए गए थे। जैसा कि अपेक्षित था, ईडीओपीसी को डीओटीएपी या डीओपीसी से बदलने से वाहन और एमवीपी से उत्तेजक प्रयास समाप्त हो गया। इसके अलावा, जंगली प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में माव्स केओ कोशिकाओं में टीएनएफ-ए का स्तर काफी कम हो गया था, लेकिन कम नहीं हुआ (छवि 4H), यह दर्शाता है कि एमवीपी-उत्तेजित टीएनएफ-ए अभिव्यक्ति की मध्यस्थता में अतिरिक्त कारक शामिल हो सकते हैं।

3.6. एमवीपी-मध्यस्थता विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए स्टिंग मार्ग आवश्यक है

जंगली प्रकार और नॉकआउट चूहों दोनों का इलाज ओवीए एमआरएनए एनकैप्सुलेटेड एमवीपी के साथ किया गया, और डीसी परिपक्वता और टी सेल प्रसार की जांच की गई। स्टिंग KO ने CD80þ और CD{2}}þ DC कोशिकाओं और CD69þ T कोशिकाओं का प्रतिशत काफी कम कर दिया (चित्र 5AeD)। एलीस्पॉट परख से पता चला कि एमवीपी की समान खुराक के साथ इलाज किए जाने के बाद जंगली प्रकार के चूहों की तुलना में स्टिंग केओ चूहों की तिल्ली और लिम्फ नोड्स में आईएफएन-जी-उत्पादक कोशिकाएं काफी कम हो गईं (चित्र 5ईईएच)। Mavs KO का प्रभाव न्यूनतम था, क्योंकि CD44þCD8þ मेमोरी T कोशिकाओं, OVA257e264-MHCI डेक्सट्रामर-पॉजिटिव CD8þ T कोशिकाओं, या वाइल्ड- की तुलना में लिम्फ नोड्स में IFN-g-उत्पादक कोशिकाओं की संख्या पर कोई अंतर नहीं देखा गया था। प्रकार के चूहे (चित्र 5IeL)। परिणाम इस धारणा को पुष्ट करता है कि एमएवीएस के अलावा अतिरिक्त कारक एमवीपी उत्तेजित सूजन साइटोकिन अभिव्यक्ति में शामिल हो सकते हैं। जंगली-प्रकार और स्टिंग केओ चूहों दोनों को बी 16- ओवीए ट्यूमर का टीका लगाने के लिए लागू किया गया था, और चूहों का पीबीएस नियंत्रण या ओवीए एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी के साथ इलाज किया गया था। टीका लगाए गए चूहों से एकत्र किए गए लिम्फ नोड और ट्यूमर के नमूनों पर फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से पता चला कि स्टिंग केओ चूहों में आईएफएन-जी-उत्पादक सीडी8þ टी कोशिकाओं की संख्या में काफी कमी आई है (चित्र 6ए और बी)। परिणामस्वरूप, एमवीपी से उपचारित जंगली प्रकार के चूहों में ट्यूमर का विकास पूरी तरह से बाधित हो गया, जबकि स्टिंग केओ चूहों में केवल आंशिक अवरोध हुआ (चित्र 6C)।

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4। चर्चा

वर्तमान अध्ययन में, हमने एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की उत्तेजना पर एमवीपी में व्यक्तिगत घटकों की कार्यात्मक भूमिकाओं की व्यवस्थित रूप से जांच की है। हमारे सेल-आधारित अध्ययन ने स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया है कि एमवीपी में एमआरएनए अणु और आरएनए-मुक्त वाहन दोनों को आईएफएन-बी की अभिव्यक्ति और आईएल -1बी और टीएनएफ सहित कई सूजन साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने में इसकी पूर्ण गतिविधि के लिए आवश्यक है। -ए डेंड्राइटिक कोशिकाओं में। ऐसे साइटोकिन्स को डेंड्राइटिक सेल सक्रियण और वैक्सीन-मध्यस्थता विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा20 में आवश्यक भूमिका निभाते हुए दिखाया गया है। हमारे अध्ययन से यह भी पता चला है कि साइटोकिन उत्पादन की उत्तेजना जन्मजात प्रतिरक्षा संवेदन में शामिल कई प्रमुख सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्गों पर निर्भर है, जिनमें स्टिंग और एमएवीएस द्वारा मध्यस्थता भी शामिल है। जबकि IFN-b अभिव्यक्ति के लिए STING आवश्यक है, MAVS मुख्य रूप से TNF-a अभिव्यक्ति को विनियमित करने में शामिल है (चित्र 6D)। एमवीपी-मध्यस्थता वाले एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा पर स्टिंग सिग्नलिंग का महत्व टी सेल गतिविधि में कमी और परिणामस्वरूप स्टिंग केओ चूहों में ट्यूमर के विकास अवरोध से प्रदर्शित होता है। यह परिणाम अन्य रिपोर्टों के अनुरूप है कि स्टिंग सक्रियण साइटोटोक्सिक टी सेल मध्यस्थता एंटीट्यूमर इम्युनिटी32 निर्धारित करता है। वायरल संक्रमण के जवाब में आरआईजी-आई-रिसेप्टर (आरएलआर) सिग्नलिंग में एमएवीएस एक प्रमुख मध्यस्थ है। इस मार्ग के सक्रिय होने से सूजन संबंधी प्रतिक्रियाओं का सिलसिला शुरू हो जाता है33। यह दिलचस्प है कि माव्स केओ चूहों में टी सेल गतिविधि से समझौता नहीं किया गया है, यह देखते हुए कि एमएवीएस सिग्नलिंग स्पष्ट रूप से टीएनएफ-ए सहित सूजन साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति को विनियमित करने में एक बड़ी भूमिका निभा रही है। एक संभावित कारण यह है कि एमवीपी द्वारा ऐसे साइटोकिन्स की उत्तेजना को कई मार्गों द्वारा मध्यस्थ किया जाता है, और एमएवीएस मार्ग का विघटन साइटोकिन अभिव्यक्ति को महत्वपूर्ण प्रभाव पैदा करने के लिए पर्याप्त निम्न स्तर तक कम नहीं करता है। वैकल्पिक रूप से, MAVS सिग्नलिंग के नुकसान की भरपाई अन्य मार्गों से की जाती है। एमवीपी वैक्सीन की कार्रवाई के तंत्र को और समझने के लिए इन मार्गों की पहचान करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। हालाँकि TLR7 पारंपरिक रूप से mRNA थेराप्यूटिक्स21 के साथ जुड़ा हुआ है, लेकिन TLR7 सिग्नलिंग MVP गतिविधि की मध्यस्थता में प्रमुख भूमिका नहीं निभाता है। वर्तमान अध्ययन में पूरी तरह से मिथाइलेटेड एमआरएनए अणुओं के अनुप्रयोग ने टीएलआर7 सिग्नलिंग को कम प्रासंगिक बना दिया है। यह अच्छी तरह से प्रदर्शित किया गया है कि आरएनए मिथाइलेशन टीएलआर 23 द्वारा मान्यता को दबा देता है। TRIF TLR3/7/8 सिग्नलिंग28 के लिए एक प्रमुख एडाप्टर प्रोटीन है। ट्राइफ का नॉकआउट एमवीपी गतिविधि को प्रभावित नहीं करता है, इस धारणा को मजबूत करता है कि टीएलआर 7 सहित उपरोक्त टीएलआर एमवीपी के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की मध्यस्थता में प्रमुख भूमिका नहीं निभाते हैं। चक्रीय डाइन्यूक्लियोटाइड्स और छोटे और बड़े आणविक यौगिकों34e37 सहित कैंसर के टीके के विकास में मल्टीपल स्टिंग एगोनिस्ट का उपयोग किया गया है। ऐसे स्टिंग एगोनिस्ट को वैक्सीन की तैयारी के दौरान बाहरी सहायक के रूप में जोड़ने की आवश्यकता होती है जो वैक्सीन संरचना में जटिलता की एक और परत जोड़ता है। इसके अलावा, बाहरी रूप से जोड़ा गया स्टिंग एगोनिस्ट एमआरएनए कॉम्प्लेक्स से अलग होने पर अवांछनीय प्रतिकूल प्रभाव पैदा कर सकता है। इसकी तुलना में, हमारा एमवीपी एक स्व-सहायक के रूप में कार्य करता है और कैंसर वैक्सीन के संदर्भ में काम करता है, क्योंकि ईडीओपीसी सहित वैक्सीन का कोई भी व्यक्तिगत घटक साइटोकिन अभिव्यक्ति को बढ़ावा नहीं दे सकता है। दिलचस्प बात यह है कि धनायनित फॉस्फोलिपिड ईडीओपीसी को गैर-फॉस्फोलिपिड डीओटीएपी से प्रतिस्थापित नहीं किया जा सकता है, जो सकारात्मक रूप से चार्ज भी होता है। इन दो धनायनित लिपिडों के बीच अंतर के संभावित तंत्र का अनुमान लगाना दिलचस्प है। हालाँकि, यह प्रलेखित किया गया है कि लिपिड अणु घटक के अन्य गुण जैसे कि हाइड्रोफोबिसिटी नैनोकण के समग्र कार्य और न्यूक्लिक एसिड38 के लिए इसकी वितरण प्रभावकारिता पर गहरा प्रभाव डाल सकते हैं। इस प्रकार, पूरी तरह कार्यात्मक एमआरएनए वैक्सीन तैयार करने के लिए उचित अणुओं के चयन में सावधानी बरतनी चाहिए। संक्षेप में, हमने एक शक्तिशाली एमआरएनए-आधारित चिकित्सीय कैंसर वैक्सीन विकसित की है और वैक्सीन में अलग-अलग घटकों को उनकी कार्यक्षमता के साथ सौंपा है। इसकी क्रिया का तंत्र रोगनिरोधी और चिकित्सीय हस्तक्षेपों के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य एमआरएनए प्लेटफार्मों से काफी अलग है। वर्तमान अध्ययन से प्राप्त ज्ञान निश्चित रूप से अतिरिक्त एमआरएनए चिकित्सीय के भविष्य के विकास का मार्गदर्शन करेगा।

चित्र 4 एमवीपी द्वारा जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देना। (एईडी) बीएमडीसी को 24 घंटे के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल इमीकिमॉड, 1 मिलीग्राम/एमएल एमआरएनए-समतुल्य कोर, वाहन, या एमवीपी के साथ इलाज किया जाता है। IFN-b, TNF-a, IL-1b, और CCL5 स्तर एलिसा से मापे गए। (ई और एफ) आईएफएन-बी और टीएनएफ-जंगली-प्रकार और जीन नॉकआउट (केओ) चूहों से प्राप्त बीएमडीसी की अभिव्यक्ति। BMDCs को 24 घंटे के लिए संकेतित अभिकर्मकों के साथ उपचारित किया गया। IFN-b और TNF-a को एलिसा से मापा गया। (जी) जंगली प्रकार और स्टिंग नॉकआउट चूहों से प्राप्त बीएमडीसी में आईएफएन-बी। बीएमडीसी को 24 घंटे के लिए 2 0 मिलीग्राम/एमएल सीजीएएमपी, 1 मिलीग्राम/एमएल एमआरएनए-समतुल्य कोर, वाहन या एमवीपी के साथ इलाज किया गया था। वाहन (डीओटीएपी): ईडीओपीसी को डीओटीएपी से प्रतिस्थापित करके तैयार किया गया; वाहन (प्रोटामाइन के बिना): प्रोटामाइन को हटाकर तैयार किया गया। एनडी: पता लगाने योग्य नहीं. (एच) जंगली प्रकार और माव्स नॉकआउट चूहों से प्राप्त बीएमडीसी में टीएनएफ-ए। बीएमडीसी को 24 घंटे के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल एमआरएनए-समतुल्य कोर, वाहन या एमवीपी के साथ इलाज किया गया था। वाहन (डीओटीएपी): ईडीओपीसी को डीओटीएपी से प्रतिस्थापित करके तैयार किया गया; वाहन (डीओपीसी): ईडीओपीसी को डीओपीसी से प्रतिस्थापित करके तैयार किया गया। डेटा को माध्य SEM (n Z 3) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। ***पी < 0.005; ****पी <0.001; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं.

चित्र 5 स्टिंग और माव्स नॉकआउट चूहों में एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं। (एईडी) स्टिंग नॉकआउट चूहों में डीसी और टी सेल सक्रियण कम हो गया। जंगली-प्रकार और स्टिंग नॉकआउट चूहों दोनों का इलाज ओवीए एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी के साथ किया गया था, और डीसी और टी सेल माप के लिए 48 घंटे बाद लिम्फ नोड्स एकत्र किए गए थे। (ईईएच) स्टिंग नॉकआउट चूहों से प्लीहा और लिम्फ नोड्स में आईएफएन-जी-व्यक्त टी कोशिकाओं को कम किया गया। धब्बों की छवियां और मात्रात्मक विश्लेषण दोनों दिखाए गए हैं। (आईईएल) माव्स नॉकआउट चूहों में टी सेल गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं। जंगली-प्रकार और माव्स नॉकआउट चूहों दोनों को पीबीएस नियंत्रण या ओवीए एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी के साथ इलाज किया गया था, और सीडी44þसीडी8þ मेमोरी टी कोशिकाओं (आई), ओवीए257ई264-एमएचसीआई डेक्सट्रामर-पॉजिटिव सीडी8þ के माप के लिए 48 घंटे बाद लिम्फ नोड्स एकत्र किए गए थे। टी कोशिकाएं (जे), और आईएफएन-जी-उत्पादक कोशिकाओं की संख्या (के और एल)। डेटा को माध्य SEM (n Z 3 या 5) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *पी < 0.05; **पी < 0.01; ***पी <0.005; ****पी <0.001; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं.

चित्र 6 स्टिंग-निर्भर एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा। (ए और बी) लिम्फ नोड्स और ट्यूमर के ऊतकों में आईएफएन-जी-व्यक्त करने वाली टी कोशिकाओं का विश्लेषण, वाइल्डटाइप और स्टिंग नॉकआउट चूहों में बी 16-ओवीए ट्यूमर वाले चूहों का इलाज ओवीए एमआरएनए-एनकैप्सुलेटेड एमवीपी के साथ किया गया था। 3 और 1 दिन में चूहों का इलाज किया गया था, और 15वें दिन लिम्फ नोड्स और ट्यूमर एकत्र किए गए थे। एकल कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री के साथ विश्लेषण किया गया था। (सी) वाइल्डटाइप और स्टिंग नॉकआउट चूहों में ट्यूमर के विकास को रोकना। चूहों का इलाज तीसरे और 1 दिन पर पीबीएस नियंत्रण या एमवीपी से किया गया। डेटा को माध्य SEM (n Z 5) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *पी <0.05; ****पी <0.001; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं. (डी) डीसी में साइटोकिन उत्पादन के लिए अग्रणी सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्गों के एमवीपी उत्तेजना पर योजनाबद्ध दृश्य। जबकि IFN-b अभिव्यक्ति की उत्तेजना विशेष रूप से STING द्वारा मध्यस्थ होती है, MAVS सहित कई कारक हैं जो TNF-a और IL-1b अभिव्यक्ति में मध्यस्थता करते हैं।

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