पूर्वकाल थैलेमिक नाभिक: चूहों में गैर-स्थानिक युग्मित-सहयोगी स्मृति के लिए एक महत्वपूर्ण सब्सट्रेट भाग 2

2|सामग्री और तरीके

2.1|पशु और आवास की स्थिति

नर लॉन्ग-इवांस चूहों (12 महीने की उम्र; औसत 630 ग्राम) को तीन या चार के समूहों में मैक्रोलोन पिंजरों (48 28 22 सेमी) में उलटे {6}} घंटे प्रकाश-अंधेरे चक्र पर रखा गया था (रात 8 बजे रोशनी चालू होती है) ).

व्यवहार परीक्षण प्रकाश चक्र के अंधेरे चरण में हुआ, प्रति सप्ताह पांच सत्र; टिप्पणियों से पुष्टि हुई कि अंधेरे चरण के दौरान चूहे अपेक्षाकृत अधिक सक्रिय थे। चूहों को पानी के साथ शरीर के वजन का 85% मुफ्त भोजन दिया गया; ऑपरेशन के बाद रिकवरी के लिए सर्जरी से पहले और बाद में भोजन को बिना शर्त भोजन दिया गया।

सर्जरी बीमारी का इलाज करने और शारीरिक स्वास्थ्य में सुधार करने की प्रक्रिया है। सर्जरी के बाद पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है। शारीरिक सुधार के अलावा, अच्छा महसूस करने के लिए स्मृति पुनर्प्राप्ति पर भी ध्यान देने की आवश्यकता होती है। ऑपरेशन के बाद रिकवरी और याददाश्त के बीच गहरा संबंध है।

ऑपरेशन के दौरान, शरीर की प्रतिकूल प्रतिक्रिया और संवेदनाहारी दवाओं के प्रभाव जैसे कारक अक्सर मस्तिष्क के स्मृति कार्य को प्रभावित करते हैं। शरीर के ठीक होने के बाद अच्छा आहार, मध्यम व्यायाम और पर्याप्त नींद बनाए रखने पर ध्यान दें। अस्पताल के बाहर पुनर्प्राप्ति अवधि के दौरान, आपको अत्यधिक गतिविधियों से बचना चाहिए और शरीर की आरामदायक स्थिति बनाए रखनी चाहिए।

रहन-सहन की आदतों के अलावा, उचित मनोवैज्ञानिक समायोजन भी स्वास्थ्य और स्मृति को बहाल करने में सहायक होते हैं। अपने आप को आराम दें, शांतिपूर्ण दिमाग बनाए रखें, और स्मृति पुनर्प्राप्ति में समायोजित होने में स्वयं की सहायता करें। साथ ही, आपको अपने मस्तिष्क को सक्रिय रखने और अपनी संज्ञानात्मक और स्मृति क्षमताओं में सुधार करने के लिए मनोरंजक गतिविधियों में सक्रिय रूप से भाग लेना चाहिए और रिश्तेदारों और दोस्तों के साथ संवाद करना चाहिए। इस गतिविधि को धीरे-धीरे बढ़ाया जा सकता है और मूलतः सप्ताह में एक बार किया जा सकता है।

संक्षेप में, सर्जरी के बाद पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया पर हर तरह से ध्यान देने की आवश्यकता होती है। अच्छी जीवनशैली और मनोवैज्ञानिक समायोजन बनाए रखना शारीरिक सुधार और स्मृति सुधार को बढ़ावा देने में बहुत महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आइए हम इसका सकारात्मक, पूरे आत्मविश्वास और आशा के साथ सामना करें। हमें याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टैंच डेजर्टिकोला याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है, क्योंकि सिस्टैंच डेजर्टिकोला न्यूरोट्रांसमीटर के संतुलन को भी नियंत्रित कर सकता है, जैसे एसिटाइलकोलाइन और विकास कारकों के स्तर को बढ़ाना। ये पदार्थ याददाश्त और सीखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, मांस रक्त प्रवाह में भी सुधार कर सकता है और ऑक्सीजन वितरण को बढ़ावा दे सकता है, जो यह सुनिश्चित कर सकता है कि मस्तिष्क को पर्याप्त पोषक तत्व और ऊर्जा प्राप्त हो, जिससे मस्तिष्क की जीवन शक्ति और सहनशक्ति में सुधार हो।

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सभी प्रक्रियाएं कैंटरबरी विश्वविद्यालय की पशु आचार समिति के अनुमोदित दिशानिर्देशों का अनुपालन करती हैं। रेडियल आर्म भूलभुलैया (रैम) और रनवे में सर्जरी से पहले परिचित होने के बाद यादृच्छिक असाइनमेंट द्वारा चूहों के चार समूह स्थापित किए गए थे। युग्मित-सहयोगी कार्य और संबंधित दो शम-घाव समूहों में प्रशिक्षित होने पर चार समूह गंध और वस्तु उत्तेजनाओं के बीच द्विपक्षीय एटीएन घाव थे।

अंतिम नमूना आकार थे (1) शम-नो ट्रेस=7 (यानी एक शम-घाव समूह जिसमें युग्मित-सहयोगी कार्य में प्रयुक्त गंध और वस्तु उत्तेजनाओं के बीच कोई अंतराल नहीं है); (2) शैम-ट्रेस=7 (शेमलेसियन समूह को गंध की प्रस्तुति और वस्तु उत्तेजनाओं के बीच 10- का ट्रेस दिया गया है); (3) एटीएन-नो ट्रेस=8;और (4) एटीएन-ट्रेस=9। घाव के मानदंडों को पूरा नहीं करने के कारण एक अतिरिक्त एटीएन-घाव चूहे को बाहर रखा गया था (नीचे देखें)।

2.2|शल्य चिकित्सा

चूहों को आइसोफ्लुरेन (इंडक्शन 4%; रखरखाव 2.5%) के साथ एनेस्थेटाइज किया गया और एट्रूमैटिक ईयर बार्स (कोफ, तुजुंगा, सीए) के साथ एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण में रखा गया। फोर्निक्स क्षति को कम करने के लिए इंसीजर बार को इंटरऑरल लाइन से 7.5 मिमी नीचे सेट किया गया था।

प्रत्येक गोलार्ध में, दो जलसेक को एंटेरोवेंट्रल न्यूक्लियस (एवी; ऊपरी और निचले) में निर्देशित किया गया था, और एक जलसेक को एंटेरोमेडियल न्यूक्लियस (एएम) में निर्देशित किया गया था। प्रत्येक सर्जरी में प्रत्येक चूहे की ब्रेग्मा-लैम्ब्डा दूरी (मिमी में सभी मान) के सापेक्ष पांच पूर्वकाल-पश्च (एपी) निर्देशांक में से एक का उपयोग किया जाता है। एवी घावों के लिए, एपी निर्देशांक थे: बी-एल के लिए 2.20 6.9-7.2; बी-एल 7.3 से 7.6 के लिए 2.25; बी-एल के लिए 2.30, 7.7 से अधिक या उसके बराबर। एवी इन्फ्यूजन ड्यूरा के नीचे 5.68 और 5.73 पर और मध्य रेखा पर 1.52 पार्श्व पर बनाया गया था।

एएम इन्फ्यूजन को एवी कोऑर्डिनेट से 1 मिमी अधिक पूर्वकाल में, ड्यूरा के नीचे 5.76 पर और 1.16 पार्श्व पर बनाया गया था; पहला एएम घाव सभी एवीइंफ्यूजन को पूरा करने के बाद बनाया गया था और अंतिम एवी घाव स्थल के विपरीत शुरू हुआ था। 0.15 एम एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट (एनएमडीए; सिग्मा, कैसलहिल, एनएसडब्ल्यू) 0 में। 1 एम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.20) को प्रत्येक साइट में 0.04 यूएल प्रति मिनट पर एक के माध्यम से डाला गया था 2.5-उल हैमिल्टन सिरिंज (रेनो, एनवी, यूएसए) एक माइक्रो इन्फ्यूजन पंप (स्टोल्टिंग, वुड डेल, आईएल) का उपयोग करके।

एवी साइट्सपर गोलार्ध को क्रमशः पृष्ठीय और उदर साइटों के लिए {{0}}.12 और 0.10 यूएल प्राप्त हुआ; प्रत्येकAM साइट के लिए 0.06 ul का उपयोग किया गया था। जलसेक के बाद सिरिंज सुई 3 मिनट तक यथास्थान पर रही।
शम-घाव सर्जरी में इसी प्रक्रिया का उपयोग किया गया था, लेकिन सुई को ऊपरी एवी और एएम घाव स्थलों से 1 मिमी ऊपर नीचे किया गया था, जिसमें कोई जलसेक नहीं दिया गया था।

2.3|व्यवहार संबंधी कार्य

आठ हाथ की रैम ने सर्जरी के बाद एटीएन-घाव चूहों में स्थानिक स्मृति हानि की पुष्टि की। चूहों को सभी गैर-स्थानिक कार्यों, यानी सरल गंध और सरल वस्तु भेदभाव और गंध-वस्तु और गंध-निशान-वस्तु युग्मित-सहयोगी कार्यों पर प्रशिक्षित करने के लिए एक रनवे उपकरण का उपयोग किया गया था।

सर्जरी से पहले, भोजन-प्रतिबंधित चूहों को नीचे वर्णित आठ-हाथ वाली रैम की आदत थी, ताकि वे 0.1 ग्राम चॉकलेट के टुकड़े (फूडफर्स्ट लिमिटेड ऑकलैंड, एनजेड) प्राप्त कर सकें और हाथ के दरवाजे के खुलने और बंद होने के अनुकूल हो सकें। लाल पर्सपेक्स रनवे (चित्रा 1) में, चूहों को नाक के आकार में एक {5}} सेमी गोलाकार सफेद प्लास्टिक की टोपी भी दी गई थी, जो फर्श के स्तर से 10 सेमी ऊपर थी और एक स्पष्ट पर्सपेक्स इंसर्ट पर एक पतली स्पंज के केंद्र में थी जो इससे जुड़ी हुई थी। अंतिम दीवार.

इन्हें इसके आधार के पीछे टिकी किसी वस्तु को भोजन कुएं के शीर्ष पर धकेलने (नाक या पंजे का उपयोग करके) के लिए भी आकार दिया गया था, जो कि 5 8.5 3 सेमी लकड़ी के ब्लॉक के केंद्र में छिपा हुआ था। भोजन में चॉकलेट के टुकड़े थे (और अवकाश के नीचे अप्राप्य भोजन रखा हुआ था)। पूर्व-प्रशिक्षण के लिए उपयोग की गई वस्तु का दोबारा उपयोग नहीं किया गया। सर्जरी के बाद, रिकवरी चूहों को रैम और रनवे दोनों से दोबारा परिचित कराया गया।

2.4|रैम में स्थानिक कार्यशील मेमोरी

सर्जरी के बाद, स्थानिक कार्यशील मेमोरी का परीक्षण एक खिड़की रहित कमरे (3 3 मीटर) के केंद्र में स्थित रैम का उपयोग करके किया गया था। भूलभुलैया में भूरे रंग से रंगा हुआ लकड़ी का 35 सेमी चौड़ा केंद्रीय केंद्र था, जिसमें आठ एल्यूमीनियम भुजाएँ (65 सेमी लंबी 8.6 सेमी चौड़ी, 4.5 सेमी ऊँची सीमाएँ थीं), जो कमरे के फर्श से 67.5 सेमी ऊपर उठी हुई थीं। चूहों को भुजाओं के बीच कूदने से रोकने के लिए क्लियर पर्सपेक्स दीवारें (19 सेमी लंबी और 25 सेमी ऊंची) हब से प्रत्येक भुजा के एक तरफ फैली हुई हैं।

प्रत्येक भुजा के अंत में एक काले लकड़ी का भोजन कूप (5 8.5 3 सेमी) रखा गया था, जिसके नीचे दुर्गम भोजन था। परीक्षण के दौरान, प्रत्येक भोजन कूप की शुरुआत में 2 0.1 ग्राम चॉकलेट के टुकड़े प्रत्येक भोजन कूप में मौजूद थे। परीक्षण। साफ़ पर्सपेक्स गिलोटिन दरवाजे, जिन्हें एक चरखी प्रणाली द्वारा हब के नीचे से उठाया जा सकता था, हब और हथियारों तक पहुंच को नियंत्रित करता था।

रैम में लगातार दस दिनों के औपचारिक प्रशिक्षण का उपयोग स्थानिक कार्यशील स्मृति का परीक्षण करने के लिए किया गया। चूहे को केंद्रीय केंद्र में रखा गया था, और 10 सेकंड बाद, सभी आठ भुजाएँ खोल दी गईं, और चूहे को एक भुजा की दहलीज के ऊपर दोनों पिछले पैरों के रूप में परिभाषित विकल्प चुनने की अनुमति दी गई। एक बार जब चूहा एक बांह में घुस गया, तो सभी दरवाजे बंद हो गए, और चाहे उसने सही विकल्प चुना हो, वह 15 सेकंड तक बांह तक ही सीमित रहा।

फिर चूहे को केंद्रीय केंद्र में वापस जाने दिया गया और 10 सेकंड के लिए वहां रखा गया, इससे पहले कि सभी दरवाजे एक और हाथ चुनने की अनुमति देने के लिए फिर से खोले गए। परीक्षण तब समाप्त हुआ जब रथ ने सभी आठ भुजाओं का दौरा किया, 20 भुजाओं का चयन किया जा चुका था या 10 मिनट बीत चुके थे।

2.5|गैर-स्थानिक कार्य: सरल भेदभाव और युग्मित-सहयोगी शिक्षण

सरल भेदभाव और युग्मित-सहयोगी कार्यों दोनों में एक ही लाल पर्सपेक्स रनवे (93 26 26 सेमी) का उपयोग किया गया, जिसे 75- सेमी-ऊंची मेज पर रखा गया (चित्र 1)। रनवे को तीन लंबवत हटाने योग्य दरवाजों (रेडपर्सपेक्स, 26 26 सेमी) द्वारा विभाजित किया जा सकता है जिन्हें विशिष्ट व्यवहार कार्य के आधार पर चुना गया था। जहां तक ​​परिचय की बात है, केंद्र में टोपी के साथ 6.5 6 8 मिमी पतले स्पंज में चॉकलेट खाने का इनाम होता है (चित्र 1)।

स्पंज को रनवे में एक हटाने योग्य दरवाजे (युग्मित-सहयोगी कार्यों के लिए) या रनवे की अंतिम दीवार (सरल भेदभाव कार्य के लिए) से जोड़ा गया था। प्रत्येक गंध के लिए एक अलग डोरप्लस स्पंज का उपयोग किया गया था, जिसे 5 मिलीलीटर सूरजमुखी तेल के साथ न्यूजीलैंड के 20 उल आवश्यक तेलों के मिश्रण के साथ पात्र के बगल में डाला गया था।

जोड़ी-सहयोगी कार्यों के लिए गंध नींबू और लौंग थे, और सरल भेदभाव कार्यों के लिए दालचीनी और नींबू, या असंतुलित समूहों में विपरीत। प्रकाश और दृष्टि से अलग वस्तुओं (चित्र 1) को भोजन के कुएं के शीर्ष पर उसके आधार के पीछे एक काज द्वारा जोड़ा गया था ताकि चूहा आसानी से भोजन के इनाम के लिए कुएं को खोजने के लिए वस्तु को पीछे (या तो नाक या पंजे) धकेल सके।

परीक्षण के दौरान स्थानिक संकेतों को कम करने के लिए एक लकड़ी का फ्रेम (फर्श से 1.8 मीटर ऊंचा और 1.3 मीटर चौड़ा), काले पर्दों में लिपटा हुआ, परीक्षण क्षेत्र के सभी किनारों को घेरता है।

सरल भेदभाव (केवल गंध; केवल वस्तु) और युग्मित-सहयोगी कार्यों में 'गो/नो-गो' प्रक्रिया का उपयोग किया गया।

प्रत्येक सत्र के लिए पहला परीक्षण चूहे को विस्मय के प्रति फिर से अभ्यस्त करने के लिए 120 सेकंड के लिए प्रारंभ क्षेत्र में रोककर शुरू किया गया; बाद के परीक्षणों में इस प्रारंभ क्षेत्र में 20 एस का उपयोग किया गया। ऑलराट्स को प्रति दैनिक सत्र में 12 सामूहिक परीक्षण प्राप्त हुए, जिसमें छद्म-यादृच्छिक क्रम में छहगो (पुरस्कृत) और छह नो-गोस (गैर-पुरस्कृत) परीक्षण शामिल थे। एक सत्र में लगातार तीन से अधिक गो या तीन नो-गो परीक्षण नहीं चलाए गए।

गंध-वस्तु उत्तेजनाओं के चार अलग-अलग युग्मों में से किसी को भी लगातार परीक्षणों पर दोहराया नहीं गया। सरल भेदभाव कार्यों में सही आइटम और युग्मित-सहयोगी कार्यों में सही उत्तेजना जोड़े चूहों के बीच प्रतिसंतुलित थे।

साधारण गंध भेदभाव के लिए, एक प्रतिक्रिया को गंधयुक्त स्पंज के केंद्र में टोपी में नाक से छेद करने के रूप में परिभाषित किया गया था; केवल स्पंज को सूँघने को बिना सोचे-समझे प्रतिक्रिया माना जाता था। गंध-वस्तु-युग्मित-सहयोगी कार्यों के लिए भोजन हमेशा स्पंज के केंद्र में टोपी में मौजूद होता था; यहां गो/नो-गो पहलू से तात्पर्य यह है कि रनवे के अंत में वस्तु को यह दिखाने के लिए धक्का दिया गया था कि उसके नीचे कोई खाद्य इनाम था या नहीं।

ऑब्जेक्ट के लिए, प्रतिक्रिया को नाक या पंजे के साथ किसी भी धक्का के रूप में परिभाषित किया गया था जो वस्तु को पीछे की ओर झुका देता था। उस समय से विलंबता जब आखिरी दरवाजा उठाया गया था और जब चूहा गंध के साथ बातचीत करता था (सरल गंध भेदभाव के लिए टोपी में नाक पोक करता है) या वस्तु के साथ (सरल वस्तु भेदभाव और युग्मित-सहयोगी कार्यों के लिए काज पर वापस धकेल दिया जाता है) था एक शांत स्टॉपवॉच (डिक स्मिथ, न्यूजीलैंड) का उपयोग करके मापा गया।

दरवाज़ों को संचालित करने और व्यवहार को रिकॉर्ड करने के लिए पर्यवेक्षक को पर्दों के भीतर और रनवे के निकट बैठाया गया था। एक परीक्षण को 'सही' के रूप में नामित किया गया था यदि चूहे ने परीक्षण के दौरान 8 सेकंड से कम समय में प्रतिक्रिया दी या बिना परीक्षण के 8 सेकंड से पहले प्रतिक्रिया नहीं दी।

2.6|सरल भेदभाव

आधे चूहों ने सरल गंध भेदभाव कार्य में प्रशिक्षण प्राप्त किया, उसके बाद सरल वस्तु भेदभाव और अन्य आधे के लिए इसके विपरीत प्रशिक्षण प्राप्त किया। डोर एक्स (चित्रा 1 ए) के बीच विलंबता और रनवे के अंत में गंध या वस्तु के साथ बातचीत दर्ज की गई थी। चूहों को सरल गंध और सरल वस्तु भेदभाव कार्य पर तब तक प्रशिक्षित किया गया जब तक कि वे मानदंड तक नहीं पहुंच गए (लगातार 2 दिनों में 80% सही)।

सरल गंध भेदभाव कार्य के लिए, प्रत्येक परीक्षण पर एक ही गंध प्रस्तुत की गई थी। रथ को यह विभेद करना था कि कम्पार्टमेंट बी के अंत में स्पंज में प्रस्तुत भोजन पुरस्कार के साथ दो गंधों में से किसको जोड़ा गया था (चित्रा 1 ए)।

सरल वस्तु भेदभाव कार्य में, कम्पार्टमेंट बी के अंत में प्रत्येक परीक्षण पर एक एकल वस्तु प्रस्तुत की गई थी (चित्र 1 में नहीं दिखाया गया है)। थेराट को यह सीखना था कि दो वस्तुओं में से किस वस्तु को वस्तु के तहत दिए जाने वाले खाद्य पुरस्कार के साथ जोड़ा गया था।

2.7|युग्मित-सहयोगी कार्य (ट्रेस और नो-ट्रेस) इन कार्यों में लंबवत हटाने योग्य दरवाजों के एक नए लेआउट का उपयोग किया गया (चित्र 1)। चूहों ने सीखा कि दो गंध-वस्तु युग्मों में से किसको पुरस्कृत किया जाएगा (उदाहरण के लिए गंध 1 + ऑब्जेक्ट ए और गंध 2 + ऑब्जेक्ट बी) और कौन से जोड़ों को पुरस्कृत नहीं किया जाएगा (यानी गंध 1 + ऑब्जेक्ट बी और गंध 2 + वस्तु ए).

जोड़ी के बावजूद, रनवे के दूसरे डिब्बे में जाने पर चूहों को गंध की प्रस्तुति के लिए हमेशा इनाम मिलता था। यह 'नो-ट्रेस' स्थिति के लिए कम्पार्टमेंट सी था जिसमें कम्पार्टमेंट ए का उपयोग नहीं किया गया था और कम्पार्टमेंट बी शुरुआती कम्पार्टमेंट था। गंध 'ट्रेस' स्थिति के लिए कम्पार्टमेंट बी के अंत में थी, जिसके लिए कम्पार्टमेंट ए को स्टार्ट बॉक्स के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

ट्रेस स्थिति में चूहों को कम्पार्टमेंट सी में रखकर गंध और वस्तु उत्तेजनाओं की प्रस्तुति के बीच 10- सेकंड की देरी के अधीन किया गया था, जबकि ट्रेस स्थिति में चूहों को गंध के साथ उनकी बातचीत के तुरंत बाद वस्तु के संपर्क में लाया गया था (बाद में) इनाम खा रहा है)। ट्रेस और नो-ट्रेस दोनों स्थितियों में, हमने कम्पार्टमेंट डी को पार करने में विलंबता दर्ज की, जब तक कि डोरज़ेड को उठाया नहीं गया जब तक कि चूहे ने वस्तु के साथ बातचीत नहीं की या 8 सेकंड के लिए इसके साथ बातचीत करने से परहेज किया।

चूहों के दो समूहों (शैम-घाव और एटीएन-घाव) को थियोडोर-ऑब्जेक्ट युग्मित-सहयोगी कार्यों (नो ट्रेस समूह) पर प्रशिक्षित किया गया था, और दो संबंधित समूहों को थियोडोर-ट्रेस-ऑब्जेक्ट युग्मित-सहयोगी कार्य (ट्रेस समूह) पर प्रशिक्षित किया गया था जब तक कि वे मानदंड पर पहुंच गया (3 दिनों में 80% सही परीक्षण) या अधिकतम 50 दिन।

2.8|अधिग्रहण के बाद प्रतिधारण परीक्षण

किसी भी चूहे के लिए युग्मित-सहयोगी कार्य का प्रतिधारण मानदंड तक पहुंचने के 5 दिन बाद या 50 दिनों के प्रशिक्षण के बाद आयोजित किया गया था। इस सत्र में एक ही दिन में 12 सामूहिक पुरस्कृत/गैर-पुरस्कार परीक्षणों का उपयोग उसी तरीके से किया गया जैसा पहले उस चूहे के लिए किया गया था।

2.9|प्रोटोकॉल

2.9.1|छिड़काव और ऊतक संग्रह

प्रतिधारण परीक्षण से 3 दिन पहले, एकल चूहों को एक अंधेरे शांत कमरे में 90 मिनट के लिए एक खाली साफ पिंजरे से परिचित कराया गया था। अंतिम परीक्षण के तुरंत बाद, चूहे को छिड़काव से 90 मिनट पहले परिचित अंधेरे शांत कमरे में उसके पिंजरे में रखा गया था।

मस्तिष्क को ठीक करने के लिए चूहों को सोडियम पेंटोबार्बिटल (125 मिलीग्राम/किग्रा) से गहराई से निश्चेतक किया गया और सेलाइन के साथ ट्रांसकार्डियल रूप से छिड़का गया, इसके बाद पैराफॉर्मल्डिहाइड [4% पीएफए ​​0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी)] में डाला गया। मस्तिष्क को 4% पीएफए ​​में पोस्ट-फिक्स्ड किया गया था, जिसके बाद न्यूनतम 48 घंटे के दीर्घकालिक समाधान (2 0% ग्लिसरॉल में 0.1 एम पीबी) में रखा गया था। कोरोनल 40-μm अनुभागों को एक फ्रीजिंग माइक्रोटोम (थर्मो फिशर, यूके) का उपयोग करके एकत्र किया गया था और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए संसाधित होने तक 20 डिग्री सेल्सियस पर क्रायो-प्रोटेक्टेंट समाधान (30% ग्लिसरॉल, 0.1 एम पीबी में 30% एथिलीन ग्लाइकॉल) में संग्रहीत किया गया था।

राज्याभिषेक अनुभागों को दो अलग-अलग श्रृंखलाओं में एकत्र किया गया था। पहली श्रृंखला ने इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (यानी पांच में से एक) के लिए पांच क्रायोवियल्स में लगातार अनुभागों को कैप्चर किया। इस श्रृंखला में प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स से लेकर सेप्टल क्षेत्र (लगभग {0}}.ब्रेग्मा से 7 से 0.6 मिमी) और मेडियोडोर्सल थैलेमस (ब्रेग्मा से लगभग 3.5 मिमी) से लेकर पुच्छ तक का एक पिछला ब्लॉक शामिल है। रेट्रोस्प्लेनियल कॉर्टेक्स.

दूसरी श्रृंखला में घाव के सत्यापन के लिए लगातार अनुभागों को कैप्चर किया गया। इन खंडों को एटीएन के ठीक पूर्वकाल से लेकर पश्च मध्यस्थ थैलेमस (लगभग {{0%).ब्रेग्मा से 6 से 3.5 मिमी) तक चार क्रायोवियल में एकत्र किया गया था।

2.9.2|न्यू-एन धुंधलापन और एटीएन-घाव सत्यापन

पूरे एटीएन क्षेत्र में फ्री-फ्लोटिंग अनुभागों को 30 के लिए अंतर्जात पेरोक्सीडेज ब्लॉकिंग बफर में ऊष्मायन से पहले ट्राइटन-एक्स (0.2%; पीबीएसटीएक्स) के साथ 1 एम फॉस्फेट-बफर खारा के साथ धोया गया (3 1 0 मिनट)। न्यूनतम [1% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2), 2%PBSTx में 50% मेथनॉल (CH3OH)।

अनुभागों को 1% सामान्य बकरी सीरम (एनजीएस; लाइफ टेक्नोलॉजीज, एनजेड) के साथ पीबीएसटीएक्स में 4 सी इनएंटी-न्यूएन प्राथमिक एंटीबॉडी (1: 5000; मोनोक्लोनल-माउसकैट # MAB377; मिलिपोर, कैलिफ़ोर्निया यूएसए) पर रात भर में ऊष्मायन किया गया था।

अतिरिक्त एंटीबॉडी बफर को पीबीएसटीएक्स के साथ हटा दिया गया और उसके बाद बायोटिनाइलेटेड बकरी एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी (1:1000 कैट# बीपी-9200-50: वेक्टरलैबोरेटरीज, कैलिफोर्निया यूएसए) में रात भर पीबीएसटीएक्स और 1% एनजीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया। अनुभागों को कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए एक्स्ट्राएविडिन (पेरोक्सीडेज संयुग्मित; 1:1000; सिग्मा, एनएसडब्ल्यू ऑस्ट्रेलिया), पीबीएसटीएक्स और 1% एनजीएस में रखा गया था।

अतिरिक्त एक्स्ट्राएविडिन और ट्राइटन एक्स को हटाने के लिए, अनुभागों को पीबीएस, पीबी और फिर ट्रिस बफर (आसुत एच2 में पीएच 7.4) में धोया गया ताकि अनुभागों को ताजा तैयार डायमिनोबेंज़िडाइन के साथ विज़ुअलाइज़ेशन के लिए तैयार किया जा सके। डीएबी 0.05%; सिग्मा, ट्रिस बफर में 0.01% एच2ओ2 में)।

डीएबी प्रतिक्रिया (लगभग 5 मिनट) को ट्रिस बफर (1 10 मिनट की धुलाई) का उपयोग करके रोक दिया गया था, और अनुभागों को जिलेटिनाइज्ड स्लाइड्स पर लगाने से पहले रात भर 4 सी पर पीबी में रखा गया था और सूखने दिया गया था। इनक्सिलीन को साफ़ करने और DPX (06522; सिग्मा-एल्ड्रिच) और एक कवरस्लिप के साथ लगाने से पहले स्लाइडों को ग्रेडेड अल्कोहल (70% -100%) के माध्यम से निर्जलित किया गया था।

घाव की सीमा निर्धारित करने के लिए एटीएन में न्यूरो-एन-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या का उपयोग किया गया था। इसमें पूरे एटीएन में चार 40-μm अनुभागों में से प्रत्येक के लिए बाएं और दाएं दोनों गोलार्धों से अनुभागों का उपयोग किया गया और ImageJ (NIH, USA) का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई। LeicaDM6 B ईमानदार माइक्रोस्कोप और DFC7000T कैमरा (Leica माइक्रोसिस्टम्स, जर्मनी) पर 5 उद्देश्यों पर NeuN पॉजिटिव सेलस्टेनिंग की तस्वीर ली गई थी।

कोशिकाओं की स्वचालित गणना ImageJ (छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, NIH, यूएसए) के माध्यम से प्राप्त की गई थी। एटीएन क्षेत्र में न्यूरॉन्स के आसपास के क्षेत्र को मैन्युअल रूप से चुना गया था और छवियों को बिटग्रेस्केल में परिवर्तित किया गया था, पृष्ठभूमि को घटाया गया था (रोलिंग=40), मास्क में परिवर्तित किया गया था और वाटरशेड फ़ंक्शन लागू किया गया था, और थ्रेशोल्ड ('मैक्सएंट्रॉपी' थ्रेशोल्ड, गोलाकारता 0.5-1.0) से ऊपर की सभी न्यूरोनल कोशिकाओं को गिना गया।

पता लगाने की सीमा सभी वर्गों के लिए समान थी। एटीएन में सेल की गिनती को व्यक्त करने के लिए कोशिकाओं के स्वचालित न्यूरॉन-दाग वाले नाभिकों को नौ नकली चूहों (शाम-ट्रेस समूह में पांच और शाम-नो ट्रेस समूह में चार) में गिना गया था।

सभी एटीएन-घाव चूहों में बची हुई कोशिकाओं के न्यूरॉन-सना हुआ नाभिक की स्वचालित गिनती की तुलना नकली चूहों में देखी गई न्यूरॉन कोशिकाओं की औसत गिनती के सापेक्ष की गई थी। स्वीकार्य घावों को एटीएन में कोशिकाओं के 50% नुकसान की कसौटी तक पहुंचने के रूप में परिभाषित किया गया था, प्रति गोलार्ध में न्यूनतम 25% के साथ। यह पिछले अध्ययनों में एटीएन-घाव मानदंड के अनुरूप है (मिशेल और डेलरिम्पल-अल्फोर्ड, 2005, 2006; पेरीएट अल।, 2018)।

2.9.3|Zif268 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

फ्री-फ़्लोटिंग अनुभागों को न्यूरॉन के समान तरीके से संसाधित किया गया था, लेकिन खरगोश पॉलीक्लोनल Zif268 प्राथमिक एंटीबॉडी (ईजीआर -1; 1: 1000 कैट # एससी -110; सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, यूएसए) में 72 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। 1%एनजीएस के साथ पीबीएसटीएक्स में 4 सी, इसके बाद पीबीएसटीएक्स और 1% एनजीएस में रात भर बायोटिनाइलेटेड बकरी एंटीरैबिट सेकेंडरी एंटीबॉडी (1:1000: वेक्टर लेबोरेटरीजबीए-1000) में ऊष्मायन किया जाता है।

डीएबी विज़ुअलाइज़ेशन (18 मिनट) के बाद, रुचि के प्रत्येक क्षेत्र में ज़िफ़ 268-सकारात्मक सेल स्टेनिंग को एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (लीका, जर्मनी) के साथ 1 0 उद्देश्य के साथ फोटो खींचा गया था। कोशिकाओं की स्वचालित गणना इमेजजे के माध्यम से प्राप्त की गई थी ( एनआईएच, यूएसए) न्यूरोपॉजिटिव कोशिकाओं के समान ही, गोलाकारता को छोड़कर 0.65-1.0 पर सेट किया गया था।

सभी क्षेत्रों के लिए Zif{0}}सकारात्मक कोशिकाओं की गिनती के लिए समान थ्रेशोल्ड एल्गोरिदम का उपयोग किया गया, प्रत्येक चूहे में रुचि के प्रति क्षेत्र में दो से छह वर्गों के बीच मात्रा निर्धारित की गई। रुचि के क्षेत्र के भीतर (दोनों गोलार्द्धों से) अनुभागों में प्रति मिमी2 औसत Zif{1}}सकारात्मक कोशिका गणना का उपयोग किया गया था।

2.10|डेटा विश्लेषण

चूहों के चार समूहों (शैम-नो ट्रेस, शेम-ट्रेस, एटीएन-नो ट्रेस और एटीएनट्रेस) में माध्य अंतर का परीक्षण करने के लिए स्टेटिस्टिका (v13; डेल इंक.) का उपयोग करते हुए एनोवा का संचालन किया गया। दिनों (रैम और सरल भेदभाव), परीक्षणों के ब्लॉक (युग्मित-सहयोगी कार्य), और संबंधित क्षेत्रों या रुचि के उप-क्षेत्रों में Zif268 गणनाओं के लिए बार-बार माप कारक जोड़े गए थे।

रैम और सरल भेदभाव कार्यों दोनों के लिए एनोवा ने यह पुष्टि करने के लिए चार समूहों की तुलना की कि दो शाम-घाव और दो एटीएन-घाव समूह एक-दूसरे के अनुरूप थे, लेकिन ध्यान दें कि रैम या सरल भेदभाव कार्यों में कोई ट्रेस घटक नहीं था। रनवे में सरल भेदभाव और युग्मित-सहयोगी कार्यों दोनों के लिए, भिन्नता की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए व्यक्तिगत परीक्षणों में विलंबता डेटा के पारस्परिक परिवर्तन का उपयोग किया गया था।

किसी भी परीक्षण के दिन, रूपांतरित विलंबता ने छह गैर-पुरस्कृत परीक्षणों और छह पुरस्कृत परीक्षणों में से प्रत्येक के लिए औसत विलंबता उत्पन्न की। सरल भेदभाव कार्यों के लिए, हमने औसत विलंबता अंतर स्कोर (पुरस्कृत परीक्षणों का औसत शून्य से गैर-पुरस्कृत परीक्षणों का औसत) का विश्लेषण किया, लेकिन डेटा भंडारण विफलता के कारण पुरस्कृत और गैर-पुरस्कृत परीक्षणों का अलग-अलग विश्लेषण नहीं किया।

सभी तीन विलंबता उपाय युग्मित-सहयोगी स्मृति कार्यों (गैर-पुरस्कृत परीक्षण, पुरस्कृत परीक्षण और विलंबता अंतर) के लिए उपलब्ध थे। एकाधिक तुलनाओं को ध्यान में रखने के लिए और टाइप I और टाइप II त्रुटियों को संतुलित करने के लिए, हमने व्यवहार विश्लेषण के लिए p <{2}}.02 के महत्व स्तर का उपयोग किया क्योंकि युग्मित-सहयोगी कार्य में तीन संबंधित उपाय थे (गैर-पुरस्कृत परीक्षण, पुरस्कृत परीक्षण) और माध्य विलंबता अंतर)।

Zif268 अभिव्यक्ति के लिए रुचि के क्षेत्रों के लिए छह प्राथमिक विश्लेषण थे, इसलिए इन विश्लेषणों में महत्व p <{1}}.01 पर निर्धारित किया गया था। पोस्टहॉक न्यूमैन-केल्स (एनके) परीक्षणों ने जोड़ीवार समूह अंतर का आकलन किया। सरल मुख्य प्रभाव विश्लेषण का उपयोग तब किया गया जब बार-बार माप कारकों से जुड़ी महत्वपूर्ण बातचीत हुई।

3|परिणाम

3.1|घाव का सत्यापन

एटीएन घावों वाले 18 चूहों में से एक को छोड़कर सभी एटीएन को 50% द्विपक्षीय क्षति और प्रति गोलार्ध में न्यूनतम 25% की प्राथमिक कसौटी पर खरे उतरे। दोनों एटीएन-घाव समूहों में औसत द्विपक्षीय क्षति 76% थी (रेंज: एटीएन-नो ट्रेस, 61%-93%; एटीएन-ट्रेस, 63%-93%; चित्र 2)। बहिष्कृत चूहे के केवल एक गोलार्ध में संतोषजनक घाव था (कुल 48%, 75% बाएँ और 20% दाएँ)।

चित्र 2डी से पता चलता है कि एटीएन-घाव वाले चूहों (एम=3388, एसडी=2024) में एटीएन न्यूरॉन्स के लिए न्यूएन की गिनती शम-घाव वाले चूहों (एम=15) में पाए गए मूल्यों से काफी नीचे थी। 339, एसडी=1065; यह गिनती फ्रॉस्ट एट अल., 2020) द्वारा रिपोर्ट की गई संख्या के समान थी। 17 घाव वाले चूहों में से आठ (ट्रेस समूह में चार और नो-ट्रेस समूह में चार) को मेडियोडोर्सल थैलेमस (एमडी) या रीयूनियन/रॉमबॉइड (रे/आरएच) नाभिक को कोई नुकसान नहीं हुआ था, और अपेक्षाकृत कम नुकसान हुआ था। शेष नौ चूहों में घावों के साथ ये संरचनाएँ।

जब एमडी क्षति हुई, तो यह एटीएन से सटे पूर्ववर्ती पहलुओं में थी। इसलिए, एमडी क्षति का आकलन ब्रेग्मा से लगभग {{0}}.72 से +2.10 मिमी तक किया गया, जहां यह संपूर्ण कोशिकाओं में 0% से 41% तक कोशिकाओं की हानि के बीच थी। समूह (माध्यिका=21%). जब Re/Rh क्षति हुई, तो यह एटीएन क्षेत्र से भी सटा हुआ था, इसलिए इसका मूल्यांकन ब्रेग्मा से लगभग 1.08 से 2.04 मिमी तक किया गया, जहां यह 0% से 33% (माध्यिका {{13%)%) के बीच था। ध्यान दें कि ये प्रतिशत चोट मान संपूर्ण एमडी और रे/रेगियन का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, क्योंकि सभी एटीएन-घाव चूहों में दोनों नाभिकों के पीछे के क्षेत्र बरकरार थे।

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