सिस्टान्चे हर्बा का सिस्टानोसाइड ऑक्सीडेटिव तनाव के दमन के माध्यम से हाइपोक्सिया-प्रेरित पुरुष प्रजनन क्षति को कम करता है-Ⅰ

परिचय

वर्तमान में, दुनिया भर में प्रजनन आयु के लगभग 48.5 मिलियन (15%) जोड़े बांझपन से प्रभावित हैं, जिनमें से 40-50% मामलों को पुरुष बांझपन के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, एक ऐसी स्थिति जो पर्यावरण और जीवनशैली कारकों से दृढ़ता से जुड़ी हुई है। साक्ष्य बताते हैं कि स्तनधारी वृषण की कम ऑक्सीजन दबाव के प्रति संवेदनशीलता पुरुष बांझपन के कुछ रूपों में एक कारण कारक है। जैसा कि पिछले अध्ययनों में दिखाया गया है, हाइपोबैरिक हाइपोक्सिया के संपर्क में आने पर शुक्राणुजनन बाधित और कम हो जाता है।

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अंतर्निहित तंत्र का पता लगाने के लिए, अध्ययनों से पता चला है कि हाइपोबैरिक हाइपोक्सिया के संपर्क में आने से रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजाति (आरओएस) का उत्पादन बढ़ जाता है। आरओएस पुरुष प्रजनन प्रणाली में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। कम स्तर पर, वे शुक्राणु क्षमता, एक्रोसोम प्रतिक्रिया और शुक्राणुजोआ-अंडाणु संलयन के लिए आवश्यक हैं [10]। हालांकि, अत्यधिक आरओएस शुक्राणु परमाणु/माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए क्षति और प्लाज्मा झिल्ली पेरोक्सीडेटिव क्षति को प्रेरित कर सकता है, जो बदले में प्रमुख एटियलॉजिकल कारक हैं।पुरुष बांझपन का खतरा बढ़ गयाइस प्रकार, हाइपोक्सिया-प्रेरित आरओएस का संचय पुरुष बांझपन का एक कारण हो सकता है।

सिस्टेन्चेस हर्बा, एक बारहमासी परजीवी औषधीय पौधा, शुष्क क्षेत्रों में व्यापक रूप से वितरित किया जाता है और इसकी औषधीय गतिविधियों के कारण व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।सिस्टेन्चेस हर्बा, PhGs को मुख्य सक्रिय घटक माना गया है। आज तक, 34 PhGs को अलग किया जा चुका हैसिस्टेन्चेस पौधे. सिस्टेनोसाइड(सिस), एक सक्रिय पीएचजी जो पृथक किया गया हैसिस्टेन्चेस हर्बा, अपने एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव के कारण ध्यान आकर्षित कर रहा है।

सिस के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव और हाइपोक्सिया-प्रेरित पुरुष बांझपन में आरओएस की भूमिका को ध्यान में रखते हुए, सिस को निम्नलिखित के उपचार के लिए एक संभावित दवा उम्मीदवार माना जाता है:हाइपोक्सिया-प्रेरित पुरुष बांझपन. हालाँकि, कुछ रिपोर्टों ने हाइपोक्सिया-प्रेरित पुरुष बांझपन या इसमें शामिल सिग्नलिंग मार्गों के उपचार में सिस्टान्चेस हर्बा से निकाले गए सिस के एंटीऑक्सीडेंट प्रभावों को संबोधित किया है। इस अध्ययन में, इन विट्रो और इन विवो हाइपोक्सिया प्रायोगिक मॉडल का निर्माण किया गया और विभिन्न सिस के प्रभाव घटकों का मूल्यांकन किया गया।

सामग्री और तरीके

कोशिका संवर्धन और अभिकर्मक

माउस स्पर्मेटोगोनिया सेल लाइन GC-1spg (GC-1) को अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC) से खरीदा गया और DMEM (इंविट्रोजन, यूएसए) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% L-ग्लूटामाइन (100 mM), पेनिसिलिन (100 U/mL), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 ug/mL) के साथ 5% CO2 के साथ एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री पर संवर्धित किया गया। सिस (सिस-ए, बी, सी, एच) को चेंगदू गेलिपु बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड (चीन) से खरीदा गया था।

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कोशिका व्यवहार्यता परख

सेल व्यवहार्यता का परीक्षण सेल काउंटिंग किट{{0}} परख (CCK-8) द्वारा किया गया। संक्षेप में, GC-1 कोशिकाओं को 1.5×103 प्रति वेल पर 96-वेल प्लेट में डाला गया और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री पर संवर्धित किया गया। फिर, कोशिकाओं को आवश्यक समय के लिए ऑक्सीजन की विभिन्न सांद्रता (20%, 15%, 10%, 5%) या सिस (सिस-ए, सिस-बी, सिस-सी, सिस-एच) की विभिन्न सांद्रता (2 μM, 0.2 μM, 0.02 μM) के साथ उपचारित किया गया। फिर, सतह पर तैरनेवाला त्याग दिया गया, और CCK-8 किट (डोजिंडो जापान) का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता का पता लगाया गया। प्रत्येक वेल का अवशोषण एक माइक्रोप्लेट रीडर (बायोराड यूएसए) का उपयोग करके 450 एनएम पर मापा गया था। अंत में, कोशिका व्यवहार्यता की गणना निम्नलिखित सूत्र के अनुसार की गई: कोशिका व्यवहार्यता=(OD प्रयोगात्मक समूह - OD खाली समूह) / (OD नियंत्रण समूह - OD खाली समूह) × 100%।

वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

प्रोटीन निकालने के लिए RIPA बफर में एकत्रित कोशिकाओं या ऊतकों को समरूप बनाया गया (RIPA बेयोटाइम चीन; कॉकटेल रोश स्विट्जरलैंड)। सुपरनैटेंट्स एकत्र किए गए, और प्रोटीन की सांद्रता BCA विधि (बेयोटाइम) द्वारा जाँची गई। प्रत्येक नमूने से निकाले गए प्रोटीन के लगभग 40 ug को SDS-PAGE द्वारा अलग किया गया और एक नाइट्रोसेल्यूलोज (NC) फ़िल्टर झिल्ली (बेयोटाइम चीन) पर इलेक्ट्रोट्रांसफर किया गया। NC फ़िल्टर झिल्ली को 1.5 घंटे के लिए 5% नॉनफैट दूध से ब्लॉक किया गया और विशिष्ट एंटीबॉडी (एंटी-PARP 1:1000, एंटीकैस्पेज़-3 1:1000, एंटी-Bcl-2 1:1000, एंटी-बैक्स 1:1000, एंटी-GAPDH 1:1000; सभी एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, USA से खरीदे गए थे) के साथ रात भर 4 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया। इसके बाद, सभी एनसी झिल्लियों को संबंधित हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए संवर्धित किया गया और इमेजिंग सिस्टम (टैनन, चीन) के साथ छवि ली गई।

कोशिका चक्र का पता लगाना

कोशिका चक्र का विश्लेषण करने के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक परख (FCM) किया गया। कोशिकाओं को 72 घंटे तक अलग-अलग परिस्थितियों में उपचारित किया गया और काटा गया। फिर कोशिकाओं को PBS से धोया गया, 75% इथेनॉल में स्थिर किया गया और प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) से रंगा गया। प्रत्येक नमूने के लिए, 1×104 कोशिकाओं को एकत्र किया गया और फ्लो साइटोमेट्री (FACS Calibur, BD Biosciences) द्वारा उनका विश्लेषण किया गया। फिर, G1/S/G2 चरण कोशिकाओं का अनुपात और प्रसार सूचकांक [चरण (S+G2)/चरण (G1+S+G2) × 100%] की गणना की गई।

Ki-67 धुंधलापन

कोशिकाओं को एक कॉन्फोकल डिश में संवर्धित किया गया और 72 घंटे तक हाइपोक्सिया या सीआईएस के विभिन्न उपप्रकारों के साथ उपचारित किया गया। सभी कोशिकाओं को 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ फिक्स करने के बाद, उन्हें एंटी-कि-67 एंटीबॉडी (1:200, सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी) के साथ इनक्यूबेट किया गया। फिर, सभी कोशिकाओं को एक संगत CY-3-संयुग्मित एंटी-रैबिट IgG एंटीबॉडी (1:200, बोस्टर, चीन) और DAPI समाधान (1.0 ug/mL, बेयोटाइम) के साथ इनक्यूबेट किया गया। फ्लूओव्यू FV1000 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (ओलंपस, जापान) के साथ प्रतिदीप्ति देखी गई।

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आरओएस का पता लगाना

डीसीएफएच-डीए का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों को मापने के लिए एफसीएम की शुरुआत की गई थी। निलंबित कोशिकाओं को 6-वेल प्लेटों में बोया गया और विभिन्न उपचारों के अधीन किया गया। 72 घंटे के उपचार के बाद, कोशिकाओं को 10 μM DCFH-DA (बेयोटाइम) के साथ सीरम-मुक्त DMEM में निलंबित कर दिया गया। फिर ROS सामग्री को 488 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 525 एनएम की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ बेकमैन कूल्टर फ्लो साइटोमेट्री सिस्टम पर फ्लोरोसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा निर्धारित किया गया [18]।

लिपिड पेरोक्सीडेशन (एलपीओ) का निर्धारण

एलपीओ का पता लगाने के लिए थायोबार्बिट्यूरिक एसिड रिएक्टिव पदार्थ (टीबीएआरएस) परख की गई। सभी ऑपरेटिंग चरण निर्देशों (सिग्मा यूएसए) के अनुसार किए गए। सांद्रता की गणना 1.56×105/(एम·सेमी) के मोलर विलुप्ति गुणांक का उपयोग करके की गई, जिसे मानक के रूप में मैलोनडायल्डिहाइड का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। परिणाम एमडीए समकक्षों के एनएमओएल/एमजी प्रोटीन के रूप में व्यक्त किए जाते हैं।

एंजाइम गतिविधियों का निर्धारण

एंजाइम गतिविधियों का परीक्षण ग्लूटाथियोन रिडक्टेस (जीआर), ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज (जीपीएक्स) और सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेस (एसओडी) सहित परख किट का उपयोग करके किया गया। सभी संचालन चरण दिए गए निर्देशों के अनुसार किए गए (नान जिंग जियान चेंग बायोइंजीनियरिंग इंस्टीट्यूट चीन)।

पशु और प्रायोगिक प्रोटोकॉल

परिपक्व नर विस्टार चूहे (180-220 ग्राम, 8 सप्ताह पुराने) चौथे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय, शीआन, चीन के पशु केंद्र से प्राप्त किए गए थे। जानवरों के उपयोग की अनुमति विश्वविद्यालय की आचार समिति (संदर्भ संख्या: 20190506) से प्राप्त की गई थी। प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए विश्वविद्यालय के दिशा-निर्देशों के अनुसार पशु प्रयोग किया गया था।

प्रयोग की शुरुआत से पहले सभी चूहों को लगभग 1 सप्ताह के लिए अनुकूलित होने दिया गया था। अनुकूलन के बाद, चूहों को यादृच्छिक रूप से 6 समूहों में वितरित किया गया था, प्रत्येक समूह में 5 जानवर थे। नियंत्रण समूह के चूहों को सामान्य दबाव (PO2: 20%; वायु दबाव: 101.3 kPa) में उठाया गया था, जबकि मॉडल और सीआईएस-उपचारित समूहों के चूहों को एक कम दबाव वाले ऑक्सीजन कक्ष (61.6 kPa का आंतरिक दबाव, समुद्र तल से 4000 मीटर की ऊंचाई के बराबर; PO2: 14.55%) में उच्च ऊंचाई वाले हाइपोक्सिक वातावरण का अनुकरण करने के लिए उठाया गया था। सभी चूहों को स्वचालित 12-h प्रकाश/अंधेरे चक्र के साथ 22 ± 2 डिग्री और आर्द्रता की स्थिति में प्लास्टिक के पिंजरों में भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच थी। हाइपोबैरिक से हाइपोबैरिक में संक्रमण की अवधि लगभग 2 घंटे थी। सभी उपचार समूहों को 8 सप्ताह के लिए मौखिक गैवेज के माध्यम से संबंधित सीआईएस (8 मिलीग्राम / किग्रा / दिन) के साथ इलाज किया गया था, जबकि नियंत्रण और मॉडल चूहों को पानी की समान मात्रा के साथ इलाज किया गया था।

8 सप्ताह के बाद, चूहों को एनेस्थीसिया के तहत बलि दी गई। वृषण, अधिवृषण और वीर्य पुटिकाओं को अलग करके उनका वजन किया गया और अंग सूचकांक की गणना निम्न सूत्र के अनुसार की गई: (अंग का वजन/पशु का वजन) × 100%। इसके बाद, अधिवृषण में शुक्राणु एकत्र किए गए और उनकी गतिशीलता और एक्रोसोम एंजाइम गतिविधि का परीक्षण किया गया। इसी तरह, हिस्टोपैथोलॉजिक अध्ययन और आरओएस, एलपीओ और एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम गतिविधि का पता लगाने के लिए वृषण ऊतक एकत्र किए गए।

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जीवित शुक्राणु दर का मूल्यांकन

एपिडीडिमिस को सर्जिकल कैंची से काटा गया और शुक्राणु निलंबन को सामान्य खारे पानी में तैयार किया गया। जीवित शुक्राणु दर का मूल्यांकन करने के लिए, शुक्राणु निलंबन के 5 μL को ईओसिन-वाई दाग की समान मात्रा के साथ सावधानी से मिलाया गया। फिर शुक्राणुओं की गिनती एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे की गई। जीवित शुक्राणु दरों का आकलन दागदार (मृत शुक्राणु) और बिना दाग वाले शुक्राणु (जीवित शुक्राणु) दोनों की गणना करके किया गया।

शुक्राणु एक्रोसोम एंजाइम गतिविधि का निर्धारण

शुक्राणु एक्रोसोम एंजाइम गतिविधि परख का उपयोग शुक्राणु एक्रोसोम एंजाइमों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था [19]। प्रत्येक समूह में परिणामों की गणना निम्न सूत्र का उपयोग करके की गई: एक्रोसोम एंजाइम गतिविधि (μIU)=(ODExperiment समूह - ODBlank समूह) / (247.5 × 10) × 106।

परिणाम

जी.सी.-1 कोशिकाओं पर हाइपोक्सिया का प्रभाव

जर्म कोशिकाओं पर हाइपोक्सिया के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए, हमने सबसे पहले 1, 3, 5, और 7 दिनों के लिए अलग-अलग ऑक्सीजन सांद्रता (20%, 15%, 10%, और 5%) के साथ हाइपोक्सिया उपचार के बाद सेल व्यवहार्यता में परिवर्तनों की जांच की। CCK-8 परख परिणामों से पता चला कि नियंत्रण समूह (20% ऑक्सीजन सांद्रता) की तुलना में, हाइपोक्सिया के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं ने व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण कमी (P < 0.01; चित्र 1A) प्रदर्शित की। इसके अलावा, उनकी जीवित रहने की दर ऑक्सीजन सांद्रता के विपरीत आनुपातिक थी और प्रेरण समय के साथ और कम हो गई। अत्यधिक साइटोटोक्सिक प्रभाव से बचने के लिए, 10% ऑक्सीजन सांद्रता और 3- दिन का प्रेरण समय बाद के इन विट्रो प्रयोगों के लिए हाइपोक्सिक मॉडल मानदंड के रूप में चुना गया था।

इसके बाद, हाइपोक्सिया उपचार के तहत GC{{0}} कोशिकाओं के प्रसार परिवर्तन का आगे मूल्यांकन करने के लिए FCM और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन किया गया। परिणामों से पता चला कि हाइपोक्सिया G1 चरण में GC-1 सेल गिरफ्तारी को प्रेरित कर सकता है, जिससे S चरण में सेल प्रवेश कम हो जाता है और DNA प्रतिकृति बाधित होती है। इस प्रकार, हाइपोक्सिया ने GC-1 कोशिकाओं के प्रसार सूचकांक को महत्वपूर्ण रूप से कम कर दिया (P < 0.01; चित्र 1B)। सकारात्मक Ki-67 धुंधलापन प्रसारशील कोशिकाओं का एक और विशिष्ट बायोमार्कर है। इसलिए, हमने हाइपोक्सिया उपचार के साथ या उसके बिना Ki-67-पॉजिटिव कोशिकाओं के अनुपात की भी जांच की। नियंत्रण समूह की तुलना में, हाइपोक्सिया उपचार ने Ki-67-पॉजिटिव कोशिकाओं को उल्लेखनीय रूप से कम कर दिया, जैसा कि चित्र 1C में दिखाया गया है।

इसके बाद, हमारा लक्ष्य हाइपोक्सिया से प्रेरित GC{{0}} सेल व्यवहार्यता अवरोध के तरीके की जांच करना था। जैसा कि साहित्य में बताया गया है, चूहों को हाइपोबैरिक हाइपोक्सिक वातावरण के संपर्क में आने से ROS का स्तर बढ़ गया [८, २०]। इसलिए, FCM परख का उपयोग करके GC-1 कोशिकाओं में अंतर्जात ROS के स्तर को मापा गया। परिणामों ने सामान्य ऑक्सीजन समूह की तुलना में हाइपोक्सिया के तहत उच्च ROS स्तर दिखाया (P < 0.01; चित्र 1D)। संचित ROS के कारण डीएनए में उल्लेखनीय हानि होती है, जो बदले में सेल एपोप्टोसिस मार्ग सक्रियण का कारण बनता है और पुरुष बांझपन के बढ़ते जोखिम का प्रमुख एटिऑलॉजिकल कारक हो सकता है [२१, २२]। इसके बाद, हमने TUNEL स्टेनिंग द्वारा GC-1 कोशिकाओं पर हाइपोक्सिया के एपोप्टोटिक सक्रियण प्रभाव का पता लगाया।

चूंकि ROS-प्रेरित कोशिका क्षति आमतौर पर OS के कारण होती है, इसलिए हमने GC-1 कोशिकाओं के OS का आगे परीक्षण किया। जैसा कि चित्र 1F में प्रस्तुत किया गया है, मॉडल समूह में GC-1 कोशिकाओं के LPO स्तर नियंत्रण समूह में GC-1 कोशिकाओं के LPO स्तरों की तुलना में उल्लेखनीय रूप से बढ़े हुए थे। इन निष्कर्षों ने सुझाव दिया कि हाइपोक्सिया-प्रेरित GC-1 कोशिका क्षति OS से संबंधित हो सकती है, जो ROS संचय द्वारा प्रेरित होती है।