QPCR और RNA-seq के बीच तुलना HLA अभिव्यक्ति भाग 1 को निर्धारित करने की चुनौतियों का खुलासा करती है

अमूर्त

मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (HLA) वर्ग I और II लोकी जन्मजात और अधिग्रहित प्रतिरक्षा के आवश्यक तत्व हैं। उनके कार्यों में टी कोशिकाओं को प्रतिजन प्रस्तुति शामिल है जो सेलुलर और हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और एनके कोशिकाओं के मॉड्यूलेशन के लिए अग्रणी हैं। रोग के परिणामों पर उनके असाधारण प्रभाव को अब जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययनों द्वारा स्पष्ट किया गया है। पेप्टाइड-बाइंडिंग ग्रूव को एन्कोडिंग करने वाले एक्सॉन रोग की संवेदनशीलता/रोगजनन पर एचएलए प्रभावों को निर्धारित करने के लिए मुख्य फोकस रहे हैं। हालांकि, एचएलए अभिव्यक्ति के स्तर को रोग के परिणामों में भी फंसाया गया है, एचएलए की चरम विविधता में एक और आयाम जोड़ दिया गया है जो व्यक्तियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में परिवर्तनशीलता को प्रभावित करता है।

ल्यूकोसाइट एंटीजन और प्रतिरक्षा के बीच घनिष्ठ संबंध है। ल्यूकोसाइट एंटीजन मानव श्वेत रक्त कोशिकाओं की सतह पर अणु को संदर्भित करता है, जो विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और रोगजनकों की पहचान और अंतर कर सकता है। यह मानव प्रतिरक्षा प्रणाली का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण नियामक है।

ल्यूकोसाइट एंटीजन में अंतर के परिणामस्वरूप अलग-अलग प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं और रोग की संवेदनशीलता हो सकती है। उदाहरण के लिए, कुछ ल्यूकोसाइट एंटीजन ऑटोइम्यून बीमारियों, संक्रामक रोगों और ट्यूमर से जुड़े होते हैं। कुछ ल्यूकोसाइट एंटीजन की अभिव्यक्ति भी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कार्य और मात्रा से संबंधित है।

इसलिए, किसी व्यक्ति की ल्युकोसैट सतह की आणविक विशेषताओं को समझना व्यक्ति की प्रतिरक्षा स्थिति और रोग के जोखिम और पूर्वानुमान का आकलन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। साथ ही, यह व्यक्तिगत उपचार और निवारक उपायों के निर्माण के लिए भी अनुकूल है। इस दृष्टि से हमें रोग प्रतिरोधक क्षमता में सुधार करने की आवश्यकता है। प्रतिरक्षा में सुधार पर सिस्टैंच का महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। Cistanche विभिन्न एंटीऑक्सीडेंट पदार्थों, जैसे विटामिन सी, और कैरोटीनॉयड से भरपूर होता है। ये तत्व मुक्त कणों को नष्ट कर सकते हैं, ऑक्सीडेटिव तनाव को कम कर सकते हैं और प्रतिरक्षा प्रणाली के प्रतिरोध में सुधार कर सकते हैं।

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एचएलए अभिव्यक्ति का अनुमान लगाने के लिए, इम्यूनोजेनेटिक अध्ययन पारंपरिक रूप से मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) पर निर्भर करते हैं। HLA जीन में चरम बहुरूपता के कारण RNA-seq जैसी वैकल्पिक उच्च-थ्रूपुट तकनीकों को अपनाने में तकनीकी समस्याओं से बाधा उत्पन्न हुई है। हाल ही में, हालांकि, RNA-seq डेटा से HLA अभिव्यक्ति का सटीक अनुमान लगाने के लिए कई जैव सूचनात्मक तरीके विकसित किए गए हैं। यह बड़े डेटासेट में HLA अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने का एक रोमांचक अवसर खोलता है, लेकिन यह भी सवाल उठाता है कि क्या RNA-seq परिणाम qPCR द्वारा तुलनीय हैं। इस अध्ययन में, हम व्यक्तियों के मिलान वाले सेट के लिए HLA वर्ग I जीन के अभिव्यक्ति डेटा के तीन वर्गों का विश्लेषण करते हैं: (a) RNA-seq, (b) qPCR, और (c) कोशिका की सतह HLA-C अभिव्यक्ति। हमने HLA-A, -B, और -C ({{10}}) के लिए qPCR और RNA-seq से अभिव्यक्ति अनुमानों के बीच एक मध्यम सहसंबंध देखा। 2 से कम या rho के बराबर 0.53 से कम या उसके बराबर ). हम तकनीकी और जैविक कारकों पर चर्चा करते हैं, जिन्हें विभिन्न आणविक फेनोटाइप के लिए मात्राओं की तुलना करते समय या विभिन्न तकनीकों का उपयोग करते समय ध्यान में रखना आवश्यक है।

कीवर्ड

एचएलए · अभिव्यक्ति · पीसीआर · आरएनए-सीक।

परिचय

जीन अभिव्यक्ति एक आणविक फेनोटाइप प्रदान करती है जो आनुवंशिक भिन्नता और जटिल फेनोटाइप, जैसे रोग की स्थिति के बीच एक मध्यवर्ती स्थिति में होती है। जीन अभिव्यक्ति के आनुवंशिक आधार को समझना आनुवंशिक भिन्नता और जटिल फेनोटाइप्स (GTEx कंसोर्टियम 2013; लैपलैनेन एट अल। 2013) के बीच संबंध बनाने के लिए रणनीतिक हो सकता है, जिसमें ऑटोइम्यून और संक्रामक रोगों की संवेदनशीलता शामिल है। यद्यपि मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (HLA) लोकी में आनुवंशिक भिन्नता का अध्ययन, और सामान्य रूप से प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (MHC) क्षेत्र के भीतर, कई जटिल रोगों (ट्रोस्डेल और नाइट 2013; डेंड्रौ एट अल) के आनुवंशिक आधार को विच्छेदित करने के लिए उपयोग किया गया है। 2018), आणविक फेनोटाइप्स का समावेश, विशेष रूप से जो जीन अभिव्यक्ति से जुड़े हैं, तुलनात्मक रूप से हाल ही में हैं (ऐप्स एट अल। 2015; विंस एट अल। 2016; रामसुरन एट अल। 2018; जोहानसन एट अल। 2022)।

गुणसूत्र 6p21 पर मानव MHC क्षेत्र एक उच्च जीन घनत्व प्रदर्शित करता है, जिसमें लिंकेज असमानता (LD) और चरम बहुरूपता (डी बकर एट अल। 2006; राडवान एट अल। 2020) के अद्वितीय पैटर्न हैं। MHC क्षेत्र में HLA वर्ग I और II लोकी शामिल हैं जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर और संशोधित करने में शामिल अणुओं को कूटबद्ध करते हैं। HLA वर्ग I के अणु अधिकांश न्यूक्लेटेड कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए जाते हैं और आमतौर पर CD8 प्लस T कोशिकाओं के लिए इंट्रासेल्युलर पेप्टाइड्स पेश करते हैं। इसके विपरीत, HLA वर्ग II के अणु मुख्य रूप से पेशेवर एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए जाते हैं, और CD4 प्लस T कोशिकाओं के बहिर्जात एंटीजन में मौजूद होते हैं जिन्हें एंडोसाइटोसिस द्वारा आंतरिक किया गया था। कक्षा I के अणुओं को प्राकृतिक किलर (एनके) कोशिकाओं, किलर-सेल इम्युनोग्लोबुलिन-जैसे रिसेप्टर्स (केआईआर) पर रिसेप्टर्स द्वारा भी पहचाना जाता है, जो एनके कोशिकाओं (कोलोना और समरिडिस 1995; गुडसन-ग्रेग एट अल) की शिक्षा और सक्रियण दोनों को प्रभावित करता है। 2020)। विभिन्न HLA वर्ग I एलोटाइप और विशिष्ट KIR अणुओं की जोड़ी NK सेल (और CD8 प्लस T सेल का एक सबसेट) गतिविधि को प्रभावित करती है, जिसके परिणामस्वरूप कैंसर, संक्रामक रोग और ऑटोइम्यूनिटी (कुलकर्णी एट अल। 2008 में समीक्षा) के लिए अलग-अलग जोखिम होते हैं।

पेप्टाइड-बाइंडिंग ग्रूव में व्यापक बहुरूपता के कारण एचएलए रोग संघों को मुख्य रूप से एंटीजन प्रस्तुति में एलील-विशिष्ट अंतर के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है। हालाँकि, HLA अभिव्यक्ति स्तर HLA बहुरूपताओं और रोग परिणामों के बीच देखे गए कुछ संघों में योगदान करते हैं। एचएलए अभिव्यक्ति स्तर ऑटोइम्यूनिटी का एक महत्वपूर्ण संशोधक है और कैंसर और संक्रमण के लिए एचएलए-मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की ताकत के लिए (रेने एट अल। 2016 में समीक्षा की गई)।

एचएलए अभिव्यक्ति स्तरों और वायरल संक्रमण परिणामों के बीच जुड़ाव के कई उदाहरण हैं। यह अच्छी तरह से प्रलेखित है, उदाहरण के लिए, उच्च एचएलए-सी अभिव्यक्ति स्तर, एमआरएनए स्तर और कोशिका की सतह पर प्रोटीन दोनों पर, एचआईवी -1 (थॉमस एट अल। 2009; कुलकर्णी एट अल। 2009) के बेहतर नियंत्रण से जुड़े हैं। अल. 2011; ऐप्स और अन्य. 2013; पारोलिनी और अन्य. 2018; बैचटेल और अन्य. 2018), जबकि ऊंचा एचएलए-ए एक्सप्रेशन बिगड़ा हुआ एचआईवी नियंत्रण (रामसुरन एट अल. 2018) के साथ जुड़ा हुआ है। SARS-CoV -2 संक्रमण HLA-C जीन एक्सप्रेशन (Loi et al. 2022) और HLA क्लास I एक्सप्रेशन को सेल की सतह पर (झांग एट अल. 2021; अरशद एट अल. 2023), साथ ही HLA क्लास को डाउनग्रेड करता है II जीन एक्सप्रेशन, जिसमें HLA-DPA1, -DPB1, -DRA, और -DRB1 (विल्क एट अल. 2020) शामिल हैं।

इसके अतिरिक्त, HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) और HLA-DPB1 (Thomas et al. 2012; Ou et al. 2021) के बीच HBV निकासी के साथ अभिव्यक्ति स्तर हैं; एचएलए-डीआरए एक्सप्रेशन विथ ससेप्टेबिलिटी विद इन्फेक्शन बाय बैट इन्फ्लुएंजा ए वायरस इन ह्यूमन सेल लाइन्स (कराकस एट अल. 2019); और HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1, और -DRB5 सहित कई प्रचलित वायरस (कचुरी एट अल। 2020) के खिलाफ एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के साथ HLA वर्ग II जीन में विनियामक वेरिएंट और अभिव्यक्ति स्तरों के बीच व्यापक जुड़ाव।

एचएलए लोकी के अभिव्यक्ति स्तर भी ऑटोइम्यूनिटी से जुड़े हैं (समीक्षा के लिए जोहानसन एट अल। 2022 देखें)। कोशिका की सतह पर HLA-C अभिव्यक्ति स्तर (Apps et al. 2013; Kulkarni et al. 2013), साथ ही कोशिका की सतह पर और प्लाज्मा में HLA-G स्तर (da Costa Ferreira et al. 2021), जुड़े हुए हैं सूजन आंत्र रोग के जोखिम के साथ। कोशिका की सतह पर बढ़ी हुई HLA-B27 अभिव्यक्ति एंकिलॉज़िंग स्पॉन्डिलाइटिस रोगियों (Cauli et al. 2002) के बीच देखी गई, जैसा कि ग्रेव्स रोग रोगियों (Weider et al. 2021) के बीच समग्र HLA वर्ग I अभिव्यक्ति थी। HLA वर्ग II अभिव्यक्ति स्तर भी ऑटोइम्यून स्थितियों के जोखिम को प्रभावित करता है।

HLA-DQA1 और -DRB1 जीन अभिव्यक्ति और कोशिका की सतह पर DQ और DR अणुओं की अभिव्यक्ति विटिलिगो रोगियों के परिधीय रक्त मोनोसाइट्स में बढ़ जाती है (कैवली एट अल। 2016); उच्च HLA-DQA1, -DQB1, और -DRB1 जीन अभिव्यक्ति और कोशिका की सतह पर DQ और DR अभिव्यक्ति से जुड़े विनियामक वेरिएंट सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेमेटोसस (राज एट अल। 2016) के जोखिम से जुड़े हैं; HLA-DRB5 जीन एक्सप्रेशन इंटरस्टीशियल लंग डिजीज (Odani et al. 2012) के साथ स्क्लेरोडर्मा रोगियों में अधिक है; विशिष्ट HLA-DRB1 एलील रुमेटीइड गठिया रोगियों (हाउटमैन एट अल। 2021) में अत्यधिक अभिव्यक्त होते हैं; और DRB1*15 की उच्च अभिव्यक्ति: 01 मल्टीपल स्केलेरोसिस (Alcina et al. 2012) के जोखिम के साथ संबद्ध है। इसलिए, व्यक्तियों के बीच HLA अभिव्यक्ति की भिन्नता को समझना और HLA अभिव्यक्ति स्तरों को विनियमित करने वाले तंत्र रोग फेनोटाइप के आनुवंशिक आधार को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण होंगे।

परंपरागत रूप से, एचएलए अभिव्यक्ति का अनुमान कोशिका की सतह पर अभिव्यक्ति स्तरों के लिए एंटीबॉडी-आधारित तकनीकों द्वारा लगाया गया है (थॉमस एट अल। 2012; एप्स एट अल। 2013) या एमआरएनए ट्रांसक्रिप्शन स्तरों के लिए मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर या आरटी-पीसीआर) द्वारा (बेटेंस एट। अन्य 2014, रामसूरन और अन्य 2015, 2017)। अध्ययन के परिणामों की तुलना करना या एक ही अध्ययन के भीतर अलग-अलग एचएलए लोकी की तुलना करना भी चुनौतीपूर्ण है क्योंकि प्रत्येक विश्लेषण के लिए और प्रत्येक एचएलए लोकस के लिए विभिन्न प्रायोगिक प्रक्रियाओं का उपयोग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप क्यूपीसीआर में विभिन्न प्रवर्धन क्षमताएं या प्रवाह साइटोमेट्री में एंटीबॉडी समानताएं हो सकती हैं।

RNA-seq जैसी उच्च-थ्रूपुट प्रौद्योगिकियां HLA जीन सहित जीनोम में सभी जीनों के लिए अभिव्यक्ति अनुमान प्रदान करती हैं, इस प्रकार जीनोम-व्यापी संदर्भ में HLA अभिव्यक्ति के मूल्यांकन की अनुमति देती हैं। हालांकि, एचएलए जीन के अभिव्यक्ति स्तर का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किए जाने पर ये प्रौद्योगिकियां कई चुनौतियां लाती हैं। RNA-seq परख (जैसे, बैच प्रभाव, पुस्तकालय की तैयारी, GC सामग्री ('t Hoen et al। 2013) से जुड़े अच्छी तरह से प्रलेखित पक्षपात के अलावा, HLA जीन के लिए अभिव्यक्ति के स्तर का अनुमान लगाने में कठिनाई इस तथ्य से उत्पन्न होती है कि परिमाणीकरण एक संदर्भ जीनोम के लिए लघु रीड्स का संरेखण शामिल है, जो एचएलए एलील विविधता का पूर्ण प्रतिनिधित्व प्रदान नहीं करता है।

इसलिए, संदर्भ जीनोम (ब्रांट एट अल। 2015) से संबंधित बड़ी संख्या में मतभेदों के कारण कुछ रीड्स संरेखित करने में विफल हो सकते हैं। इसके अलावा, एचएलए जीन एक जीन परिवार का हिस्सा होते हैं जो दोहराव के क्रमिक दौर के बाद बनते हैं और अक्सर ऐसे खंड होते हैं जो पैरालॉग्स के बीच बहुत समान होते हैं, इस प्रकार जीनों के बीच क्रॉस-संरेखण और अभिव्यक्ति स्तरों के पक्षपाती मात्रा का ठहराव होता है। इन कठिनाइयों ने कम्प्यूटेशनल पाइपलाइनों के विकास को प्रेरित किया (एक समीक्षा के लिए जोहानसन एट अल। 2022 देखें) जो संरेखण चरण में एचएलए विविधता के लिए जाना जाता है और एचएलए जीन (बोएगल एट अल। 2012; ली एट) के लिए सटीक अभिव्यक्ति स्तर प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। अल. 2018; अगुइयार और अन्य. 2019; गुतिरेज़-आर्सेलस और अन्य. 2020; डार्बी और अन्य. 2020).

जबकि आरएनए-सीक्यू और क्यूपीसीआर दोनों दृष्टिकोण प्रतिलेखों की प्रचुरता को निर्धारित करके एचएलए अभिव्यक्ति का अनुमान लगाते हैं, विधियों में विभिन्न प्रयोगात्मक और जैव सूचनात्मक प्रसंस्करण प्रक्रियाएं शामिल हैं। हमारे ज्ञान के लिए, HLA जीन के लिए qPCR से प्राप्त RNA-seq से परिणामों की मात्रात्मक तुलना नहीं की गई है। इस अध्ययन में, हमने यह ध्यान में रखते हुए कि किसी भी तकनीक को स्वर्ण मानक नहीं माना जा सकता है, एचएलए वर्ग I अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव के लिए विभिन्न तकनीकों और आणविक फेनोटाइप की तुलना करने की मांग की। विभिन्न अध्ययनों की तुलना में तकनीकी और जैविक भिन्नता के प्रभाव को कम करने के लिए, हमने 96 व्यक्तियों के एक सेट पर RNA-seq परख का प्रदर्शन किया, जिसके लिए qPCR अभिव्यक्ति अनुमान उपलब्ध थे (HLA-A, -B, -C के लिए), और जिसके एक सबसेट के लिए HLA-C एंटीबॉडी-आधारित सेल सरफेस एक्सप्रेशन भी उपलब्ध था। RNA-seq मात्रा का ठहराव एक HLA-अनुरूप पाइपलाइन के साथ किया गया था जो सटीक अभिव्यक्ति आकलन की अनुमति देता है, एकल संदर्भ जीनोम पर निर्भर मानक दृष्टिकोणों के पूर्वाग्रह को कम करता है।

सामग्री और तरीके

नमूने

फ्रेडरिक नेशनल लेबोरेटरी फॉर कैंसर रिसर्च (FNLCR) में स्वैच्छिक दाता कार्यक्रम में नामांकित 96 स्वस्थ रक्त दाताओं से रक्त के नमूने प्राप्त किए गए। लिखित सूचित सहमति सभी विषयों से प्राप्त की गई थी और नमूनों को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान की आईआरबी-अनुमोदित प्रक्रियाओं द्वारा अज्ञात किया गया था। आरएनएसी यूनिवर्सल किट (क्यूजेन) का उपयोग करके आरएनए को ताजा पृथक परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (पीबीएमसी) से निकाला गया था। जीनोमिक डीएनए को हटाने के लिए RNA को RNAse मुक्त DNAse के साथ उपचारित किया गया। PBMCs से निकाले गए कुल RNA को HT RNA लैब चिप (कैलिपर, लाइफ साइंसेज) का उपयोग करके परिमाणित किया गया था। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में 8 से अधिक आरएनए गुणवत्ता स्कोर दिखाने वाले सभी नमूनों का उपयोग किया गया था।

एचएलए टाइपिंग

एचएलए एलील सेंगर अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किए गए थे। इसके अतिरिक्त, हमने HLApers (Aguiar et al. 2019) और Kourami (ली और किंग्सफोर्ड 2018) को RNAseq से सीधे HLA एलील्स का अनुमान लगाने के लिए चलाया और सेंगर सीक्वेंसिंग-आधारित कॉल के साथ समझौते की जाँच की। यदि हम HLApers और Kourami के बीच लगातार कॉल पर विचार करते हैं, तो हमने 288 तुलनाओं (3 लोकी × 96 व्यक्तियों) में सेंगर कॉल के साथ केवल 10 विसंगतियां देखीं। उनमें से अधिकांश (n=5) ने सेंगर अनुक्रमण द्वारा निर्धारित एलील के बहुत करीब एक एलील के लिए RNA-seq से समर्थन दिखाया, इस प्रकार हमने RNA-seq-आधारित कॉल को रखना चुना। 3 जीनोटाइप्स के लिए, हम RNA-seq संभावना से सजातीय कॉलों का निरीक्षण करते हैं क्योंकि एक एलील व्यक्त नहीं किया गया था, और हमने सेंगर अनुक्रमण से कॉलों को रखा। यह अभिव्यक्ति के अनुमान को प्रभावित नहीं करता है, क्योंकि RNA-seq के माध्यम से पता नहीं लगाए गए एलील के लिए कोई रीड संरेखित नहीं करता है। एक जीनोटाइप के लिए, हमने हेटेरोज़ीगस कॉल के लिए अच्छा समर्थन देखा जबकि सेंगर अनुक्रमण को होमोज़ीगोट कहा गया। उस स्थिति में, हमने RNA-seq- आधारित कॉल को रखा क्योंकि यह देखे गए पठन को बेहतर ढंग से समझाता है। एक एलील कॉल के लिए, हमने अपर्याप्त रीड कवरेज के कारण RNA-seq- आधारित कॉल की त्रुटि पर विचार किया।

मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर)

HLA-A, -B, और -C के लिए HLA mRNA प्रतिलेखन स्तर qPCR द्वारा एक परख में मापा गया था जो अन्य सभी लोकी के प्रवर्धन से बचते हुए प्रत्येक स्थान पर सामान्य एलील के निष्पक्ष प्रवर्धन को सुनिश्चित करता है। उपयोग किए गए प्राइमर थे: HLA-A (F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGCCTTCA); HLA-B (F, ACTGAGCTTGTG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C (F, CTGGCCTGACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC)। उच्च क्षमता वाले आरएनए-टू-सीडीएनए किट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया गया था। ABI 7900HT मशीन पर Power SYBR ग्रीन मास्टर मिक्स (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) का उपयोग करके HLA और हाउसकीपिंग जीन 2 माइक्रोग्लोब्युलिन (B2M) cDNA का प्रवर्धन किया गया। B2M के लिए प्राइमर सीक्वेंस कुलकर्णी एट अल की तालिका S4 में वर्णित हैं। (2013)। प्रत्येक HLA जीन का औसत अभिव्यक्ति स्तर B2M के लिए सामान्यीकृत किया गया था और इसकी गणना 2-∆∆Ct विधि (जहां Ct दहलीज चक्र है) का उपयोग करके की गई थी।

सामान्य एचएलए एलील्स के औसत एलील-विशिष्ट अभिव्यक्ति स्तर का अनुमान रामसुरन एट अल में वर्णित एक रेखीय मॉडल द्वारा लगाया गया था। (2015)। विशेष रूप से, हमने अभिव्यक्ति को प्रत्येक व्यक्ति द्वारा किए गए दो एलील्स के रैखिक कार्य के रूप में प्रतिरूपित किया और जीन अभिव्यक्ति पर प्रत्येक एलील के प्रभावों को निकाला। हमने इस चरण को R में प्रदर्शित किया (अनुभाग कोड उपलब्धता देखें)।

भूतल अभिव्यक्ति

HLA-C-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी DT9 (Apps et al. 2013) का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा HLA-C सेल सतह अभिव्यक्ति को ताज़ा पृथक PBMCs से CD3 प्लस कोशिकाओं पर मापा गया था। A * 03 और A * 11 ले जाने वाले व्यक्तियों के एक सबसेट में HLA-A विश्लेषण के लिए, हमने एंटीबॉडी 0554HA (वन लैम्ब्डा, इंक।) के साथ कोशिकाओं को दाग दिया।

आरएनए-सीक

आरएनए की तैयारी

RNA-seq को -80 डिग्री पर संग्रहीत RNA पर प्रदर्शित किया गया था। क्यूबिट आरएनए एचएस परख (थर्मो फिशर) का उपयोग करके कुल आरएनए की मात्रा निर्धारित की गई थी। एक 2100 बायोएनालाइज़र उपकरण और एक Agilent 6000 RNA पिको किट (Agilent Technologies) का उपयोग करके RNA गुणवत्ता का मूल्यांकन किया गया था। प्रत्येक नमूने के लिए, 500 एनजी कुल आरएनए का उपयोग पूरे ट्रांसक्रिप्टोम आरआरएनए-घटित पुस्तकालयों की तैयारी के लिए इनपुट के रूप में किया गया था। KAPA द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार Bioo वैज्ञानिक NEXTfex™ DNA बारकोडेड एडेप्टर (BioScientifc, Austin, TX, USA) का उपयोग करके KAPA HyperPrep Kit (KAPA Biosystems, Wilmington, MA) के साथ एक एडेप्टर-लिगेटेड लाइब्रेरी तैयार की गई थी।

RiboErase का उपयोग करके rRNA डिप्लेशन

राइबोसोमल आरएनए को आरआरएनए अनुक्रमों के पूरक जांच के साथ कुल आरएनए को इनक्यूबेट करके समाप्त कर दिया गया था। संकरण के बाद, RNase H का उपयोग एंजाइमेटिक रूप से rRNA को नीचा दिखाने के लिए किया गया था। कापा प्रोटोकॉल के अनुसार कपा प्योर बीड्स और DNase का उपयोग करके सफाई और DNase पाचन किया गया।

विखंडन, सीडीएनए संश्लेषण, और पुस्तकालय निर्माण

पहली और दूसरी स्ट्रैंड संश्लेषण और ए-टेलिंग प्रतिक्रियाओं से पहले मैग्नीशियम की उपस्थिति में 4.5 मिनट के लिए आरआरएनए-हटाए गए नमूने 85 डिग्री पर खंडित किए गए थे। NEXTfex DNA बारकोडेड एडेप्टर (1.5 uM) को प्रत्येक नमूने के लिए एक अद्वितीय बारकोड के साथ A-पूंछ वाले सीडीएनए से जोड़ा गया था। उत्पादों को कापा प्योर बीड्स से शुद्ध किया गया और लाइब्रेरी एम्प्लीफिकेशन के 8 चक्रों का प्रदर्शन किया गया। प्रवर्धन के बाद, एक अंतिम पुस्तकालय सफाई का प्रदर्शन किया गया था, और 2100 बायोएनालाइज़र उपकरण पर क्यूबिट डीएनए एचएस परख (थर्मो फिशर) और एगिलेंट डीएनए एचएस किट का उपयोग करके पुस्तकालय मात्रा का ठहराव और क्यूसी का मूल्यांकन किया गया था।

अनुक्रमण

परिणामी बहुसंकेतन अनुक्रमण पुस्तकालयों का उपयोग एक इल्लुमिना cBOT (इलुमिना, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) पर क्लस्टर गठन में किया गया था और 2 × 126 बीपी युग्मित-अंत अनुक्रमण के लिए इलुमिना द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के बाद एक इलुमिना हाईसेक 2500 का उपयोग करके अनुक्रमण किया गया था। प्रत्येक प्रतिलेख को 40-50 मिलियन रीड्स की लक्ष्य गहराई तक अनुक्रमित किया गया था।

11 व्यक्तियों के ताज़ा नमूनों पर RNA-seq

आरएनए अनुक्रमण से पहले °80 डिग्री पर संग्रहीत सामग्री के नमूना क्षरण की संभावना की जांच करने के लिए, qPCR अनुमानों के साथ असहमति का एक संभावित स्रोत, हमने 11 दाताओं से रक्त वापस लिया और नए नमूनों पर RNA-seq का प्रदर्शन किया। प्रयोग पहले की तरह ही पुस्तकालय की तैयारी और विधियों के साथ किया गया था, लेकिन 2 × 150 pb रीड्स के साथ एक इलुमिना नेक्स्टसेक का उपयोग करके अनुक्रमित किया गया।

RNA-seq के लिए अभिव्यक्ति की मात्रा

संदर्भ प्रतिलेख

Gencode v37 डेटाबेस में एनोटेट किए गए सभी ट्रांस्क्रिप्ट के लिए अभिव्यक्ति के स्तर का अनुमान लगाने के लिए हमने Salmon (Patro et al. 2017) का उपयोग किया। हमने सामन (जीसी पूर्वाग्रह, स्थितीय पूर्वाग्रह और अनुक्रम-विशिष्ट पूर्वाग्रह) पर पूर्वाग्रह सुधार के लिए सभी विकल्पों का उपयोग किया।

निजीकृत

"रेफरी ट्रांसक्रिप्टोम" के समान, लेकिन प्रत्येक व्यक्ति द्वारा किए गए एचएलए-ए, -बी, और -सी जीनोटाइप के अनुसार वैयक्तिकृत एचएलए टेप के साथ। निर्देशांक प्राप्त करने के लिए जीनोम के संदर्भ जीनोम के एचएलए एलील के अनुक्रम को संरेखित करके निजीकरण किया गया था। फिर, अन्य सभी एलील्स के साथ संदर्भ जीनोम पर मौजूद एलील के बहु-अनुक्रम संरेखण का उपयोग करके (IPD-IMGT/HLA रिलीज़ 3.43 से उपलब्ध। 0 (रॉबिन्सन एट अल। 2020)), हमने जीनोमिक को जिम्मेदार ठहराया। सभी एचएलए एलील्स के लिए स्थिति। अंत में, हमने प्रतिलेख निर्देशांक और HLA एलील के अनुक्रम पर जानकारी के संयोजन के आधार पर एक व्यक्तिगत प्रतिलेख का निर्माण किया। यह प्रक्रिया आर (आर कोर टीम 2020) में बायोस्ट्रिंग्स पैकेज (पगेस एट अल। 2020) और टाइडिवर्स मेटा पैकेज (विकम एट अल। 2019) का उपयोग करके की गई थी।

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