भ्रूण और प्रसवकालीन मानव एमनियोटिक द्रव स्टेम कोशिकाओं से गुप्त योगों की व्यापक रूपरेखा

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इसके अलावा, जैसा कि आंकड़े 5बी और 6बी में बार चार्ट से, स्रावी सेल हाइपोक्सिक पूर्व शर्त के अनुसार विशिष्ट प्रोटीन वितरण सराहनीय है। इस मामले में, पूरी जानकारी के लिए, डीएवे और डीसीआई सेट की सीमा से अधिक नहीं होने वाले प्रोटीन भी बताए गए थे। भ्रूण के हाइपोक्सिक फॉर्मूलेशन में 60 केडीए हीट शॉक प्रोटीन (एचएसपीडी 1, चित्रा 5 बी, बाएं पैनल) के साथ समृद्ध गुप्त परिणाम हैं, जबकि पेरी-नेटल समकक्ष अत्यधिक चिकनी पेशी सेल सिकुड़ा हुआ मायोसिन नियामक [52] लाइट पॉलीपेप्टाइड 9 (एमवाईएल 9, चित्रा) व्यक्त करता है। 5 बी, दायां पैनल)। गर्भावधि चरणों के बीच अंतर का एक महत्वपूर्ण हिस्सा एचएएफएस में हाइपोक्सिक पूर्व शर्त पर अधिक निर्भर करता है। ईवीएस; हाइपोक्सिक सेल प्राइमिंग से प्राप्त f-हैव-ईवी को पेर्लेकैन (HSPG2), एग्रीन (AGRN), लैमिनिन सबयूनिट -5, और -1 (LAMA5 और LAMB1), थ्रोम्बोस्पोंडिन {{17 सहित कारकों से समृद्ध पाया गया। }} (THBS1, चित्र 6B, बायां पैनल)। हाइपोक्सिक p-hAFS-EVs में फेरिटिन हेवी चेन (FTH1), फ्लोटिलिन -1 (FLOT1), Fascin (FSCN1), एनेक्सिन A6 (ANXA6), रब GDP डिसोसिएशन इनहिबिटर बीटा (GDI2) जैसे स्कैफोल्डिंग प्रोटीन शामिल हैं। -1 मेम्ब्रेन ग्लाइकोप्रोटीन (THY1), न्यूरोपिलिन-1(NRP1) और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीन 14 (MMP14, Fig6B, दायां पैनल)।

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एफ-एचएएफएस में प्रत्येक जांच की स्थिति में प्रोटीन कम से कम 2 की आवृत्ति के साथ पाए गए। EVs और p-hAFS-EVs की तुलना Vesciclepedia डेटाबेस [53] से की गई। जैसा कि अपेक्षित था, अधिकांश पहचाने गए प्रोटीन (96 प्रतिशत) को पहले ईवीएस और एक्सोसोम में संदर्भ डेटाबेस (चित्रा एस3ए) में वर्णित किया गया है।सिस्टैंच लाभइस संबंध में, जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) संवर्धन विश्लेषण फ़नरिच [54] के माध्यम से किया गया था। जैविक प्रक्रियाओं, आणविक कार्य और सेलुलर घटकों में उनकी भागीदारी के अनुसार, डेटा के सांख्यिकीय रूप से अधिक प्रतिनिधित्व वाले समूहों को खोजने के लिए डेटासेट में GO शब्दों की बहुतायत की तुलना संदर्भ डेटाबेस में उनकी प्राकृतिक मात्रा से की गई थी (इस अंतिम पहलू डेटा के लिए नहीं हैं दिखाया गया है, लेकिन अनुरोध पर उपलब्ध है)। पहचाने गए प्रोटीन से जुड़े आणविक कार्यों के विश्लेषण के संबंध में, एचएएफएस-सीएम अंशों ने बाह्य मैट्रिक्स और साइटोस्केलेटन, साइटोस्केलेटल प्रोटीन बाइंडिंग और संरचनात्मक अणु गतिविधि (चित्रा एस 2) के संरचनात्मक घटक में संवर्धन का संकेत दिया, जबकि एचएएफएस-ईवी एक संरचनात्मक के साथ समृद्ध थे। साइटोस्केलेटन और राइबोसोम, डीएनए और आरएनए बाइंडिंग और GTPase और चैपरोन बाइंडिंग फैक्टर (चित्रा S3C) के घटक।

एचएएफएस-सीएम और हैव-ईवीएस दोनों के लिए जैविक प्रक्रियाओं के संवर्धन विश्लेषण ने संकेत दिया कि भ्रूण-और प्रसवकालीन एचएएफएस स्रावी अंशों में संशोधित अधिकांश प्रोटीन कोशिका वृद्धि / रखरखाव और प्रोटीन चयापचय (आंकड़े 5C और 6C) से संबंधित हैं। एचएएफएस-ईवी के भीतर हमने देखा कि "बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स संरचनात्मक घटक" शब्द विशेष रूप से हाइपोक्सिक एफ-एचएएफ-ईवी से जुड़ा था; शब्द "कैल्शियम आयन बाइंडिंग" और "स्ट्रक्चरल आणविक गतिविधि" मुख्य रूप से हाइपोक्सिक f-hAFS और p-hAFS नमूनों (चित्र S3B) में समृद्ध थे।

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I और एक DCI (डिफरेंशियल एक्सप्रेशन का विश्वास) I5I से अधिक या उसके बराबर ने फ़िल्टर पास किए और उन्हें अलग-अलग व्यक्त माना गया; रिपोर्ट किए गए प्रोटीन की पूरी सूची और विस्तृत मापदंडों के लिए तालिका S3 देखें। (सी) हाइपोक्सिक प्रीकॉन्डिशनिंग के बाद f-hAFS-EVs (बाएं पैनल) और p-hAFS-EVs (दाएं पैनल) में कम से कम 2 की आवृत्ति के साथ पहचाने जाने वाले प्रोटीन की जैविक प्रक्रिया संवर्धन विश्लेषण। फ़नरिच टूल के आधार पर, जीन ऑन्कोलॉजी शब्द बार चार्ट में दिखाए जाते हैं जो प्रत्येक श्रेणी के लिए समृद्ध जीन के प्रतिशत की रिपोर्ट करते हैं (f-hAFS-EVsnormo के लिए गहरे पीले रंग के बार, f-hAFS-EVShypo के लिए लाल बार, p-hAFS के लिए हल्के हरे रंग के बार) -EVsnormo और p-hAFS-EVShypo के लिए गहरे हरे रंग की पट्टियाँ)। बोनफेरोनी के साथ केवल जीन ऑन्कोलॉजी की शर्तें सही * पी<0.05 are="">

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

2.6. भ्रूण बनाम पेरिनाटल की साइटोकाइन और केमोकाइन प्रोफाइलिंग में-सीएम और हैव-ईवी ने विभिन्न वितरण पैटर्न का खुलासा किया है

हमने पहले पैरासरीन प्रभाव [34,35,49] के माध्यम से घायल हृदय कोशिकाओं पर f-hAFS-CMhypo की पुनर्योजी क्षमता को मान्य किया है। यहां हमने f-hAFS-CMHypo की साइटोकाइन और केमोकाइन सामग्री की तुलना संबंधित p-hAFS समकक्ष (चित्र 7A, चित्र S4A, और तालिका S4) से की और कुछ भेदभावपूर्ण कारक पाए।

ANGIOGENIN, एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज इंड्यूसर (EMMPRIN), इंटरल्यूकिन 8 (IL-8), और मोनोसाइट केमोअट्रेक्टेंट प्रोटीन-1 (MCP-1) विशेष रूप से समृद्ध inf-hAFS-CMNypo पाए गए और नहीं थे p-hAFS-CMhypo में पाया गया। इंसुलिन की तरह ग्रोथ फैक्टर बाइंडिंग प्रोटीन 2 (IGFBP2) और ओस्टियोपोन्ट (OPN) में f-hAFS-CMHypo में p-hAFS-CMHypo की तुलना में 3.5-और 3.8-गुना की वृद्धि हुई थी (" पी<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

जबकि भ्रूण-बनाम पेरिनाटल है-सीएम ने अपने साइटोकिन और केमोकाइन प्रोफाइल में अंतर अभिव्यक्ति दिखाई, संबंधित भ्रूण बनाम पेरिनाटल ईवी समकक्षों को अधिक सजातीय रूप से वितरित किया गया था, हालांकि कम अभिव्यक्ति प्रोफाइल (चित्रा 7 बी, चित्रा एस 4 बी, और टेबल एस 5) के साथ। फिर भी, कुछ अंतरों की सराहना की जा सकती है: DiPeptidyl-Peptidase IV (DPPIV), ग्रोथ/डिफरेंशियल फैक्टर 15 (GDF-15), और IL-8 केवल f-hAFS-EVSHypo द्वारा व्यक्त किए गए थे, हालांकि कम पर स्तर; ANGIOPOIETIN2, CD40 LIGAND और विटामिन D-बाइंडिंग प्रोटीन (VDBP) केवल p-hAFS-EVShypo में पाए गए, जबकि एक बार फिर कम मात्रा में पाए गए। अन्य साइटोकिन्स जैसे ब्रेन-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक फैक्टर (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, इंसुलिन जैसा ग्रोथ फैक्टर बाइंडिंग प्रोटीन 3 (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, स्ट्रोमल डिराइव्ड फैक्टर{ {23}} अल्फा (एसडीएफ-1ए), एफ-एचएएफएस-ईवीएसशिपो और पी-एचएएफएस-ईवीएसएचवीपीओ दोनों में पाए गए, जिसमें पीएआई-1 और ईएमएमपीआरआईएन अधिक व्यक्त किए गए (चित्र 7बी)

BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3, और SDF-lo को विशेष रूप से सभी हाइपोक्सिक हैव-ईवी में संगत hAFS-CM की तुलना में समृद्ध किया गया था, गर्भावधि चरण की परवाह किए बिना। इसके अलावा, जबकि EMMPRIN को p-hAFS-CMhypo के भीतर नहीं पाया गया था, यह EV संगत अंश में समृद्ध पाया गया था; इसके विपरीत, ओपीएन एफ-हैव-सीएमहाइपो में एफ-हैव-ईवीएसशिपो की तुलना में अधिक प्रचुर मात्रा में था, जबकि यह संबंधित पी-एचएएफएस गुप्त अंशों के बीच तुलनीय था। FGF -19, MIF, और PTX3 समान रूप से भ्रूण-और प्रसवकालीन है-CM और संबंधित hAFS-EVs दोनों में व्यक्त किए गए थे। पीएआई -1 हाइपोक्सिक स्रावी अंशों में अत्यधिक समृद्ध था।

चित्रा 7. भ्रूण के भीतर साइटोकाइन और केमोकाइन प्रोफाइलिंग- और प्रसवकालीन एचएएफएस गुप्त फॉर्मूलेशन। (ए) हाइपोक्सिक भ्रूण-बनाम पेरिनाटल हैव-सीएम (f-hAFS-CMHypo बनाम p-hAFS-CMHypo) के भीतर पाए गए साइटोकिन्स और केमोकाइन की अभिव्यक्ति मनमानी इकाई [AU] द्वारा पिक्सेल घनत्व में बताई गई है। मानों को स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± अर्ध के रूप में व्यक्त किया जाता है और तालिका S4 में रिपोर्ट किया जाता है; *p=0.0485;**p=0.006.(B) हाइपोक्सिक भ्रूण में पाए गए साइटोकाइन और केमोकाइन सामग्री- बनाम प्रसवकालीन hAFS-EVs (f-hAFS-EVSHypo बनाम p-hAFS-EVSHypo) और मनमानी इकाइयों [AU] में पिक्सेल घनत्व द्वारा व्यक्त किया गया।सिस्टैंच कोलेस्ट्रॉलमानों को n =3 स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± सेमी के रूप में व्यक्त किया जाता है और तालिका S5 में रिपोर्ट किया जाता है। CST3: सिस्टैटिन सी; EMMPRIN: एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनस इंड्यूसर; FCFF -19: फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर -19; IGFBP2: इंसुलिन जैसा ग्रोथ फैक्टर (IGF) बाइंडिंग प्रोटीन 2; IL -8: इंटरल्यूकिन -8;आईएल-17ए:इंटरल्यूकिन-17ए; MCP-1: मोनोसाइट केमोअट्रेक्टेंट प्रोटीन-1;MIF:मैक्रोफेज माइग्रेशन इनहिबिटरी फैक्टर; पीटीएक्स 3: पेंट्राक्सिन 3; पीएआई-1: प्लास्मिनोजेन एक्टीवेटर इनहिबिटर-1; बीडीएनएफ: ब्रेन-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक फैक्टर; DPPIV:डिपेप्टिडाइल पेप्टिडेज़ IV; जीडीएफ -15: ग्रोथ डिफरेंशियल फैक्टर -15; IGFBP3: इंसुलिन जैसा ग्रोथ फैक्टर (IGF) बाइंडिंग प्रोटीन 3; SDF-1a: स्ट्रोमल व्युत्पन्न फैक्टर-1 अल्फा; VDBP: विटामिन डी-बाइंडिंग प्रोटीन।

2.7.भ्रूण-और प्रसवकालीन है-ईवी अपने कार्गो में आरएनए जानकारी से समृद्ध हैं

चूंकि छोटे गैर-कोडिंग आरएनए को लक्ष्य कोशिकाओं [4,55] पर ईवी पैरासरीन प्रभाव का मास्टर नियामक माना जाता है, इसलिए हमने मुख्य रूप से f-hAFS-EVs और p-hAFS-EVs के भीतर microRNA (miRNA) सामग्री पर RNA अनुक्रमण विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया। छोटे आरएनए प्रोफाइलिंग ने कुल छोटे आरएनए राशि (चित्रा 8ए) की तुलना में भ्रूण और प्रसवकालीन एचएएफएस-ईवीएस (लगभग 35-36 प्रतिशत) दोनों में miRNA के संवर्धन को दिखाया। miRNA घटक वास्तव में दोनों EV योगों में दो सबसे अधिक प्रतिनिधित्व वाली RNA प्रजातियों में से एक था, साथ में rRNA(***p) p < 0.0001)।="" विश्लेषण="" किए="" गए="" ev="" नमूनों="" में="" निम्नलिखित="" mirnas="" सबसे="" अधिक="" समृद्ध="" थे:="" mir-31-5p;="" एमआईआर-196ए-5पी;="" एमआईआर-93-5पी;="" एमआईआर-100-5पी;="" एमआईआर-125ए-5पी;="" mir-27b-3p,let-7a-5p,let-7b-5p,let-7f{="" {27}}पी,लेट-7मैं-5पी,एमआईआर-16-5पी,एमआईआर-21-5पी,एमआईआर-29ए-3पी,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,mir-155-5p,mir-191-5p="" और="" mir-221-3p.="" ध्यान="" दें,="" भ्रूण-="" और="" प्रसवकालीन="" ईवी="" ने="" ऐसे="" अधिकांश="" mirnas="" (अर्थात्="" लेट="" -7="" ए="" -5="" पी,="" लेट="" -7="" बी="" -5="" पी,="" लेट="" {{47)="" को="" साझा="" किया="" है।="" }}f-5p,="" let-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" और="" mir-221-3p,="" चित्रा="" 7="" बी)।="" 15="" सबसे="" समृद्ध="" mirnas="" प्रजातियां="" प्रत्येक="" नमूने="" में="" कुल="" mirna="" सामग्री="" के="" 60="" प्रतिशत="" से="" अधिक="" को="" कवर="" करती="" हैं।="" दूसरी="" ओर,="" vesicular="" mirna="" सामग्री="" के="" शेष="" 30="" प्रतिशत="" में="" लगभग="" 100="" mirnas="" पाए="" गए="" (चित्र="">

एचएएफएस-ईवीएस के भीतर miRNA सामग्री को और अधिक चिह्नित करने के लिए, हमने जांच की कि क्या hAFS गर्भावधि चरण या इन विट्रो हाइपोक्सिक सेल प्रीकॉन्डिशनिंग विशिष्ट miRNAs के संवर्धन को प्रभावित कर सकता है। गर्भावधि चरणों के बीच सबसे मजबूत मॉडुलन पाया गया, जहां लगभग सभी संशोधित miRNAs को f-hAFS-EVs में प्रसवकालीन समकक्ष (चित्र 9A और तालिका 1) पर समृद्ध किया गया था। हाइपोक्सिक प्रीकॉन्डिशनिंग का miRNA कार्गो पर हल्का प्रभाव था, जबकि इस तुलना में मॉडुलन किसी भी दिशा में था, कुछ miRNA हाइपोक्सिक में समृद्ध था और अन्य नॉर्मोक्सिक नियंत्रण स्थितियों (चित्रा 9ए) में।

एक पूरक विश्लेषण के रूप में, हमने जांच किए गए गर्भकालीन चरणों से प्राप्त ईवीएस के लिए विभिन्न दाताओं और संस्कृति पूर्व शर्त में सबसे कम परिवर्तनशीलता के साथ जांच किए गए miRNAs की पहचान पर ध्यान केंद्रित किया। इस विश्लेषण के परिणामस्वरूप miRNAs उच्च से निम्न अभिव्यक्ति स्तरों (चित्र 9B) तक फैले हुए हैं। hAFS-EVs कार्गो के सबसे स्थिर miRNA कोर के भीतर, f-hAFS-EVs और p-hAFS-EVs के बीच कुछ साझा miRNA की पहचान की गई (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p उच्च स्तर पर; miR-221-3p,miR-221-5p और miR-22-3p मंद स्तर पर, तालिका 2)।

चित्रा 9. भ्रूण और प्रसवकालीन hAFS-EVs में miRNAs के विभेदक संवर्धन का विश्लेषण। (ए) गर्भावधि चरण (बाएं पैनल) और स्रावी कोशिकाओं (दाएं पैनल) के इन विट्रो हाइपोक्सिक पूर्व शर्त के अनुसार एचएएफएस-ईवी miRNA कार्गो के अंतर संवर्धन के लिए ज्वालामुखी भूखंड। miRNA विवरण के लिए, कृपया तालिका 1 देखें। (बी) उच्च (पीले डॉट्स) के अनुसार भ्रूण एचएएफएस-ईवीएस (बाएं पैनल) और प्रसवकालीन एचएएफएस-ईवीएस (दाएं पैनल) के भीतर स्थिर miRNAs की परिवर्तनशीलता (एक्स अक्ष) और संवर्धन स्तर (वाई अक्ष) के बीच सहसंबंध का स्कैटर प्लॉट, मंद (हरे रंग के बिंदु) और कम (गहरे बैंगनी रंग के बिंदु) संवर्धन। miRNA विवरण के लिए, कृपया तालिका 2.RPM देखें: प्रति मिलियन पढ़ता है।

3. चर्चा

मानव एमनियोटिक द्रव के बचे हुए नमूनों को पुनर्योजी चिकित्सा और ऊतक इंजीनियरिंग में आशाजनक क्षमता वाले स्ट्रोमल कोशिकाओं के मूल्यवान स्रोत के रूप में पहचाना गया है। उनके अलगाव से जुड़ी नैतिक चिंताएं न्यूनतम हैं, क्योंकि उन्हें गर्भावस्था के द्वितीय तिमाही (भ्रूण एचएएफएस) के दौरान नियमित प्रसवपूर्व स्क्रीनिंग एमनियोसेंटेसिस के बचे हुए नमूनों से प्राप्त किया जा सकता है, या तृतीय तिमाही अनुसूचित सी-सेक्शन में नैदानिक ​​​​अपशिष्ट के रूप में छोड़े गए एम्नियोटिक द्रव से प्राप्त किया जा सकता है। प्रक्रियाएं (प्रसवकालीन एचएएफएस)। हाल के वर्षों में, एचएएफएस को मानव ऊतक की मरम्मत और पुनर्जनन के लिए संभावित चिकित्सीय के रूप में प्रस्तावित किया गया है, जिसे प्रयोगात्मक रोग मॉडल से प्राप्त उत्साहजनक साक्ष्य दिया गया है। दिलचस्प बात यह है कि उन्हें भ्रूण-नवजात तंत्रिका संबंधी रोगों के गर्भाशय चिकित्सा में भी प्रस्तावित किया गया है; वास्तव में, प्रीक्लिनिकल अध्ययनों ने सुझाव दिया कि एचएएफएस ने इंट्रा-एमनियोटिक डिलीवरी के माध्यम से प्रसव पूर्व प्रशासित किया, मायलोमेनिंगोसेले [56-58] के चूहे के मॉडल में पैरासरीन गतिविधि के माध्यम से गर्भ के दौरान रीढ़ की हड्डी की रक्षा की, और प्रयोगात्मक कृंतक गैस्ट्रोस्किसिस में उजागर आंत्र की क्षति को कम किया। ]. एक अनुवादकीय दृष्टिकोण से, एचएएफएस के गर्भाशय प्रत्यारोपण में उनके स्रावी (एचएएफएस-सीएम ओ एचएएफएस-ईवीएस) की सबसे उपयुक्त तैयारी के प्रशासन द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।सिस्टैंच डेजर्टिकोला साइड इफेक्टयह रणनीति ऑफ-द-शेल्फ और रेडी-टू-यूज़ फ़ार्मास्यूटिकल फॉर्मूलेशन प्रदान करते हुए कैनोनिकल सेल थेरेपी (यानी, इन विट्रो सेल विस्तार में समय लेने वाली) की सीमाओं पर काबू पाने के द्वारा गर्भधारण के दौरान त्वरित और समय पर हस्तक्षेप की अनुमति देगी।

कम आक्रामक प्रसवपूर्व निदान तकनीकों के हालिया विकास के परिणामस्वरूप निकट भविष्य में एमनियोसेंटेसिस प्रक्रियाओं में कमी आ सकती है, इस प्रकार प्रसवकालीन एचएएफएस को अधिक सुलभ विकल्प के रूप में अपनाने की वकालत की जा सकती है। फिर भी, चूंकि भ्रूण एचएएफएस अधिक विकासात्मक रूप से अपरिपक्व होते हैं, इसलिए वे अधिक प्रभावी पैरासरीन क्षमता को परेशान कर सकते हैं। इस परिदृश्य के भीतर, यहाँ हमने भ्रूण- और प्रसवकालीन c-KITt hAFS की तुलना की और हमने उनके गुप्त अंशों की रूपरेखा पर ध्यान केंद्रित किया। हमने उनकी पैरासरीन क्षमता के संभावित नैदानिक ​​​​अनुवाद के लिए ध्यान में रखे जाने वाले प्रासंगिक भेदों पर प्रकाश डाला।

पिछले स्वतंत्र अध्ययनों के साथ समझौते में, हम दिखाते हैं कि गर्भकालीन चरण विषम hAFS आकारिकी और उनके मेसेनकाइमल प्रतिजन प्रोफ़ाइल [25,26] को प्रभावित नहीं करता है। हमने तब मापदंडों का मूल्यांकन किया, जो कि कैनोनिकल स्ट्रोमल इम्यूनोफेनोटाइप से परे सेल सेक्रेटरी और पैरासरीन गतिविधि को प्रभावित करने की अधिक संभावना है। विशेष रूप से अस्थि-मज्जा मेसेनकाइमल पूर्वजों के भीतर एक सीडी 146- सकारात्मक, सीडी107ए-उच्च उप-जनसंख्या की उपस्थिति को हाल ही में उल्लेखनीय नियामक और चिकित्सीय पैरासरीन गतिविधि [47] के साथ सहसंबंधित दिखाया गया है। यहां हमने खुलासा किया कि भ्रूण और प्रसवकालीन एचएएफएस दोनों को इस आणविक हस्ताक्षर द्वारा प्रासंगिक अनुवाद संबंधी निहितार्थों के साथ उनकी स्रावी शक्ति का समर्थन करने की दृढ़ता से विशेषता है। इसके अलावा, भ्रूण एचएएफएस को अक्षम एरोबिक चयापचय की विशेषता थी, जबकि अधिक परिपक्व प्रसवकालीन लोगों ने उच्च ऑक्सीजन खपत दर और एटीपी संश्लेषण दिखाया। यह II ट्राइमेस्टर hAFS की अधिक अपरिपक्व चयापचय प्रोफ़ाइल का सुझाव दे सकता है जो प्रीटरम नवजात शिशुओं की गर्भनाल स्ट्रोमल कोशिकाओं से मिलता जुलता है, जिन्होंने समान प्रवृत्ति दिखाई है [60]।

पैरासरीन क्षमता को ट्रिगर करने के लिए, एचएएफएस को 24 एच सीरम-मुक्त हाइपोक्सिक प्राइमिंग से अवगत कराया गया था, एक रणनीति जिसे हमने पहले सफलतापूर्वक विकसित किया है [34,35,37] भ्रूण कोशिकाओं के लिए और यहां हमने पहली बार उनके प्रसवकालीन समकक्ष पर जांच की। हाइपोक्सिया के तहत प्रीकॉन्डिशनिंग भ्रूण- और प्रसवकालीन एचएएफएस उनके स्रावी एकाग्रता में वृद्धि और जारी किए गए ईवीएस की मात्रा में एक सकारात्मक प्रवृत्ति के परिणामस्वरूप हुआ, जबकि गर्भकालीन चरण ने सेल स्रावी यील्क पर और न ही ईवी आकारिकी और आकार वितरण पर कोई प्रभाव नहीं डाला।

विशेष रूप से, एचएएफएस पैरासरीन कार्गो के लक्षण वर्णन में हमारे द्वारा मूल्यांकन की गई विभिन्न स्थितियों के अनुसार कुछ विशिष्ट अंतर सामने आए। भ्रूण के एचएएफएस स्रावी के प्रोटिओमिक प्रोफाइलिंग ने गर्भावधि चरण और सेल हाइपोक्सिक पूर्व शर्त के आधार पर स्पष्ट कारक वितरण का खुलासा किया। यह इंगित करता है कि एचएएफएस पैरासरीन क्षमता परिपक्वता के दौरान से गर्भावधि तिमाही के दौरान एक अलग पहचान प्राप्त कर सकती है जिसे बदले में इन विट्रो में स्रावी कोशिकाओं को उत्तेजित करके संशोधित किया जा सकता है। एचएएफएस-सीएम और एचएएफएस-ईवी के जैविक प्रक्रियाओं के संवर्धन विश्लेषण ने सुझाव दिया कि अधिकांश संशोधित प्रोटीन कोशिका वृद्धि / रखरखाव और प्रोटीन चयापचय के लिए अनुकूल हो सकते हैं, इस प्रकार अब तक बताए गए सेल लाभकारी पैरासरीन प्रभावों का समर्थन करते हैं। विशेष रूप से, हाइपोक्सिक भ्रूण hAFS कुल स्रावी को हीट शॉक प्रोटीन HSPD1 (HSP60) से समृद्ध पाया गया, जिसे डायबिटिक माउस त्वचा की चोट के मॉडल में घाव भरने का समर्थन करने और M2 फेनोटाइप [61] में मैक्रोफेज प्रो-रिज़ॉल्यूशन स्क्यूइंग को बढ़ावा देने के लिए प्रदर्शित किया गया था। . इसी तरह, हाइपोक्सिक भ्रूण hAFS-EVs को न्यूरोजेनेसिस (HSPG2 [62], सेल सेल्फ-रिन्यूअल, और मस्तिष्क और हृदय विकास (LAMA5 [63] और LAMB1 [64] और माइग्रेशन (THBS1 [2])) को बढ़ावा देने वाले कारकों के लिए समृद्ध किया गया था। भ्रूण एचएएफएस के हाइपोक्सिक प्राइमिंग के बाद ईवीएस में एजीआरएन भी पाया गया।सिस्टैंच खुराक redditहमारे निष्कर्ष भड़काऊ और हाइपोक्सिक शिक्षाप्रद उत्तेजनाओं के तहत मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं के प्रोटिओम में एजीआरएन के अपग्रेड होने के पिछले साक्ष्य के अनुरूप हैं। AGRN को प्रतिरक्षा सिनैप्स सिग्नलिंग [66] और नवजात माउस हृदय पुनर्जनन [67] के साथ शामिल होने के लिए भी दिखाया गया है, इस प्रकार पुनर्योजी पैरासरीन प्रभावों की ओर विकासात्मक रूप से युवा भ्रूण hAFS की एक स्पष्ट प्रवृत्ति का समर्थन करता है। इसके अलावा, भ्रूण के एचएएफएस को हाइपोक्सिक पूर्व शर्त के प्रति अधिक प्रतिक्रियाशील होने की पुष्टि की गई थी, जैसा कि एंजियोजेनिन, ईएमएमपीआरआईएम, आईएल -8, और एमसीपी -1 साइटोकाइन [68] जैसे संवहनी पुनर्योजी प्रभावकारिता के भविष्यवक्ताओं के संवर्धन द्वारा दिखाया गया था। उनके वातानुकूलित माध्यम। यह मायोकार्डियल रोधगलन, हिंद-अंग इस्किमिया, और इस्केमिक फासिओक्यूटेनियस फ्लैप [34,69-71] के प्रीक्लिनिकल कृंतक मॉडल में अंतर्जात नव-धमनीजनन को बढ़ावा देने में भ्रूण एचएएफएस-सीएम की पैरासरीन क्षमता के पिछले साक्ष्य का समर्थन करता है। इसके अलावा, भ्रूण एचएएफएस प्रसवकालीन एक की तुलना में कुल स्रावी को IGFBP2and OPN के साथ काफी अधिक समृद्ध पाया गया, इस प्रकार एक अधिक स्पष्ट समर्थक-समाधान और एंटी-एजिंग मॉड्यूलेटरी प्रोफ़ाइल [72-75] का सुझाव दिया गया। प्रसवकालीन हैव-सीएम, जबकि पैरासरीन कारकों में कम वृद्धि हुई थी, इसी तरह सीएसटी 3 [76,77] और एमआईएफ [78] जैसे न्यूरोट्रॉफिक और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कारकों के साथ पूरक था।

कुल hAFS-CM की तुलना में, संबंधित हाइपोक्सिक भ्रूण- और प्रसवकालीन- EV समकक्षों ने संवहनी रीमॉडेलिंग मध्यस्थ EMMPRIN [79] के अपवाद के साथ साइटोकिन्स और केमोकाइन की कम अभिव्यक्ति दिखाई, जो ज्यादातर पुटिका डिब्बे में समृद्ध थी। भ्रूण के एचएएफएस-ईवी [34,37] के पहले रिपोर्ट किए गए कार्डियो-सक्रिय और प्रो-रीजेनरेटिव प्रोफाइल की पुष्टि कार्डियोप्रोटेक्टिव आईएल-8 [80] और जीडीएफ-15 की उनकी विशेष अभिव्यक्ति के प्रमाण से हुई है। अंतर्जात वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस को ट्रिगर करने वाला एक प्रमुख पैरासरीन कारक [81,82], साथ ही एन्थ्रासाइक्लिन-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी [78] का प्रतिकार करता है। भ्रूण और प्रसवकालीन एचएएफएस-ईवी दोनों ने पूर्वज/स्टेम सेल तस्करी नियामक एसडीएफ -1 [83-85] के लिए समान अभिव्यक्ति दिखाई। प्रोटिओमिक विश्लेषण ने हाइपोक्सिक प्रसवकालीन hAFS-EVs में NRP1 [86] और MP14[87] जैसे एंजियोजेनेसिस से संबंधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि की सूचना दी; इस तरह के उत्तेजक प्रोफाइल कंकाल की मांसपेशी इस्केमिक चोट [25] के प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल में ट्राइमेस्टर एचएएफएस के एंडोथेलियल पुनर्योजी गुणों पर पिछले परिणामों की व्याख्या कर सकते हैं, उनके एचएएफएस-सीएम के संबंधित भ्रूण की तुलना में कम प्रो-एंजियोजेनिक होने के प्रमाण के बावजूद। विशेष रूप से, तंत्रिका विकास कारक बीडीएनएफ भ्रूण और प्रसवकालीन ईवी कार्गो दोनों में पाया गया था, हालांकि कम मात्रा में, इस प्रकार न्यूरोनल उत्तरजीविता और न्यूरोडेवलपमेंटल प्रक्रियाओं में एचएएफएस-ईवी के लिए एक पुटीय न्यूरोट्रॉफिक गतिविधि का सुझाव देता है, जैसा कि मानव हड्डी द्वारा स्रावित बाह्य पुटिकाओं के लिए भी देखा गया है। मज्जा और गर्भनाल रक्त-एमएससी [8889]। हाइपोक्सिक उत्तेजना के दौर से गुजर रहे भ्रूण और प्रसवकालीन एचएएफएस से दोनों स्रावी योगों को पीएआई -1 से समृद्ध दिखाया गया है, जो एंडोथेलियल सक्रियण का एक सूत्रधार है [90] जो हृदय में एम 2 मैक्रोफेज के ध्रुवीकरण में भी शामिल है और कार्डियोप्रोटेक्टिव के साथ संपन्न है। और एंटी-फाइब्रोटिक क्षमता [91]।

MicroRNAs (miRNAs) को मोटे तौर पर स्टेम सेल- और मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल-ईवी पैरासरीन गतिविधि [92,93] के महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में संबोधित किया गया है। यहां हमने पाया कि एचएएफएस-ईवी के भीतर 15 सबसे समृद्ध miRNA प्रजातियां प्रत्येक नमूने में कुल miRNA सामग्री के 60 प्रतिशत से अधिक को कवर करती हैं। इन miRNAs को मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल-ईवीएस (लेट -7 ए -5 पी [4,95]) के आणविक कार्गो को चिह्नित करने के लिए सूचित किया गया है, संवहनी पुनर्जनन को प्रभावित करके और फाइब्रोसिस को रोककर मायोकार्डियल इस्किमिया से बचाते हैं। -7b-5p, let-7f-5p, miR-21-5p और miR-155-5p [96,97]), को बढ़ावा दें केराटिनोसाइट फंक्शन (miR-16-5p [98]) को रेगुलेट करके घाव भरना और फोरब्रेन इस्किमिया (miR-29a-3p [99,100]) के बाद न्यूरोनल डेथ का मुकाबला करना। दूसरी ओर, शेष 30 प्रतिशत vesicular miRNA सामग्री में लगभग 1000 miRNAs पाए गए। इस तरह का असंतुलित वितरण पिछले अध्ययनों के अनुरूप है [4] और ज्यादातर समृद्ध miRNAs को hAFS-EVs की मुख्य जैविक गतिविधि के लिए जिम्मेदार जवाबदेह के रूप में उजागर करता है। दिलचस्प बात यह है कि भ्रूण- और प्रसवकालीन hAFS-EVs ने अधिकांश 15 miRNAs को साझा किया। ध्यान दें, हमने यह भी देखा कि भ्रूण के एचएएफएस-ईवी और प्रसवकालीन दोनों में विभिन्न संवर्धन स्तरों पर बहुत स्थिर miRNAs का एक सेट होता है। इस तरह के साक्ष्य hAFS-EVs पर qPCR प्रयोगों में आंतरिक संदर्भ नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले "हाउसकीपिंग" उम्मीदवारों की एक विस्तृत श्रृंखला का सुझाव दे सकते हैं। इसके अलावा, ऐसे स्थिर miRNAs (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ का एक सुसंगत उपसमुच्चय {40}} y miR-221-5p) दो गर्भकालीन चरणों के बीच साझा किया जाता है और 15 ज्यादातर समृद्ध लोगों के साथ ओवरलैप होता है, और भी अधिक निरंतर व्यवहार और एक विश्वसनीय पूर्व-समाधान आणविक हस्ताक्षर ([96, {{45] का सुझाव देता है। }}])। ध्यान दें, इस तरह के विशिष्ट कोर के भीतर कुछ उम्मीदवारों को हाल ही में II ट्राइमेस्टर एमनियोटिक द्रव-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (miR -29 a -3 p और miR से प्राप्त न्यूरोप्रोटेक्टिव EVs के संदर्भ में miRNAs के रूप में रिपोर्ट किया गया है। 49}}पी[95])। फिर भी, हमने यह भी देखा कि गर्भकालीन आयु हाइपोक्सिक पूर्व शर्त से अधिक miRNA कार्गो को संशोधित कर सकती है। III ट्राइमेस्टर भ्रूण hAFS से प्राप्त विकासात्मक रूप से अधिक किशोर EVs को miRNAs से समृद्ध किया गया था जो पहले भ्रूण स्टेम सेल (miR -302-3 p [101]), सेल प्रसार, और अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाओं (miR) के ओस्टोजेनिक भेदभाव की व्यवहार्यता का समर्थन करने के लिए दिखाया गया था। -217 [102]), जबकि ट्यूमर को दबाने की क्षमता (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106])।

हमारे परिणामों के आधार पर, यहां हम पुष्टि करते हैं कि भ्रूण और प्रसवकालीन एचएएफएस पुनर्योजी चिकित्सा के लिए उपयोग किए जाने वाले आकर्षक पैरासरीन स्रोतों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। जबकि उनकी फीनो-प्रकार और स्रावी गतिविधि समान थी, हमने उनके गुप्त योगों में कुछ विशिष्ट पहलुओं को उनके भविष्य के चिकित्सीय अनुवाद के लिए उपयोगी अंतर्दृष्टि के रूप में उजागर किया है।

4. सामग्री और तरीके

4.1.मानव एमनियोटिक द्रव स्टेम सेल अलगाव और विट्रो संस्कृति में

मानव एमनियोटिक द्रव स्टेम सेल (एचएएफएस) को एमनियोटिक द्रव (एएफ) के बचे हुए नमूनों से अलग किया गया था, जो ट्राइमेस्टर एमनियोसेंटेसिस (भ्रूण एचएएफएस, एफ-एचएएफएस) के माध्यम से नियमित प्रसवपूर्व जांच द्वारा एकत्र किया गया था, या ट्राइमेस्टर के दौरान अनुसूचित सिजेरियन-सेक्शन डिलीवरी के दौरान नैदानिक ​​​​कचरे के रूप में। (पेरीनेटल एचएएफएस, पी-एचएएफएस) प्रीनेटल डायग्नोसिस एंड पेरिनाटल मेडिसिन यूनिट, आईआरसीसीएस सैन मार्टिनो हॉस्पिटल में, फेटल- एंड पेरिनाटल मेडिकल एंड सर्जरी यूनिट और आईआरसीसीएस इस्टिटूटो गैस्लिनी हॉस्पिटल (जेनोवा, इटली) में ह्यूमन जेनेटिक्स लेबोरेटरी में। स्थानीय नैतिक समिति प्राधिकरण (प्रोटोकॉल PR428REG2015) के अनुसार और हेलसिंकी घोषणा दिशानिर्देशों के अनुपालन में सभी दाताओं से सूचित लिखित सहमति प्राप्त की गई थी। दूसरी तिमाही के भ्रूण वायुसेना के नमूने महिला दाताओं से प्राप्त किए गए थे जिनकी औसत आयु लगभग 37.42 ± 0.32 वर्ष (n =15 36- से लेकर 41 वर्ष तक) की औसत आयु के साथ थी। 34.25 ± 1.31 वर्ष की औसत आयु वाली महिला दाता (एन =10 26- से लेकर 42 वर्ष तक)। भ्रूण- और प्रसवकालीन एचएएफएस को सामान्य कैरियोटाइप के लिए मान्य नमूनों से प्राप्त किया गया था और सी-केआईटी अभिव्यक्ति (सीडी 117 माइक्रोबीड किट, मिल्टनी बायोटेक्नोलॉजी, बोलोग्ना, इटली) के लिए इम्यूनोमैग्नेटिक सॉर्टिंग द्वारा अलग-अलग एएफ मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं [16] से प्राप्त किया गया था।सिस्टैंच का अर्क लाभc-KIT* hAFS को मिनिमल एसेंशियल मीडियम (MEM)-अल्फा में 15 प्रतिशत FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम, गिब्को-थर्मो फिशर साइंटिफिक, मोंज़ा, इटली), 18 प्रतिशत चांग बी और 2 प्रतिशत चांग सी मीडियम (इरविन साइंटिफिक) के साथ संवर्धित किया गया। , सांता एना, सीए, यूएसए) 1 प्रतिशत एल-ग्लूटामाइन और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (गिब्को-थर्मो फिशर साइंटिफिक, मोंज़ा, इटली) के साथ, 37 डिग्री पर 5 प्रतिशत CO2 और 20 प्रतिशत ओज़ वातावरण के साथ इनक्यूबेटर में और सुसंस्कृत उनके स्राव को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने से पहले इन विट्रो में 5 मार्ग।

4.2. एचएएफएस चयापचय का जैव रासायनिक मूल्यांकन

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) प्रत्येक प्रयोग के लिए कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। बेसल श्वसन का मूल्यांकन करने के लिए, एचएएफएस को 10 मिनट के लिए 0.03 मिलीग्राम/एमएल डिजिटोनिन के साथ पारगम्य किया गया और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में निलंबित कर दिया गया। पथ को उत्तेजित करने के लिए 10 मिमी पाइरूवेट प्लस 5 मिमी मैलेट या 20 मिमी उत्तराधिकारी जोड़ा गया। -वेज़ क्रमशः कॉम्प्लेक्स I, II, और IV या कॉम्प्लेक्स और IV द्वारा रचित [60]।

ग्लूटामाइन, लंबी-श्रृंखला फैटी एसिड ऑक्सीकरण और ग्लूकोज के श्वसन में सापेक्ष योगदान का मूल्यांकन करने के लिए, डिजिटोनिन पारगम्यीकरण के बाद, कोशिकाओं को एक विकास माध्यम और 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxir, और 4 uM UK5 {{22} में निलंबित कर दिया गया था। } 99 को क्रमशः ग्लूटामिनेज़, कार्निटाइन पामिटॉयल-ट्रांसफ़रेज़ 1A (CPT1A), या माइटोकॉन्ड्रियल पाइरूवेट कैरियर (MPC) को बाधित करने के लिए जोड़ा गया था। Fi-F.ATP सिंथेज़ (एटीपी सिंथेज़) गतिविधि का पता अत्यधिक संवेदनशील लूसिफ़ेरिन/लूसिफ़ेरेज़ विधि द्वारा एटीपी उत्पादन को मापने के द्वारा लगाया गया था। परख 37 डिग्री पर 2 मिनट के लिए आयोजित की गई थी, और डेटा हर 3 0 सेकेंड में एकत्र किया गया था। प्रयोगों के पहले सेट में, 1 0 डिग्री कोशिकाओं को 1 0 मिनट के लिए 50 मिमी KCl, 1mMEGTA, 2mMEDTA, 5mMKH2PO4,2mMMgC12,0.6m Mouabain, 1mM P1P 5- वाले माध्यम में इनक्यूबेट किया गया था। (एडेनोसिन -5') पेंटा-फॉस्फेट, 0.040 मिलीग्राम/एमएल एम्पीसिलीन, और 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.4। बाद में, एटीपी संश्लेषण श्वसन सब्सट्रेट (10 मिमी पाइरूवेट प्लस 5 मिमी मैलेट या 20 मिमी उत्तराधिकारी) और 0.1 मिमी एडीपी के अतिरिक्त द्वारा प्रेरित किया गया था। प्रतिक्रिया को ल्यूमिनोमीटर (ग्लोमैक्स 20/20 ल्यूमिनोमीटर, क्रोमेगा, मिलान, इटली) एटीपी मानक समाधान (रोच, बेसल, स्विटजरलैंड) में ल्यूसिफरिन / ल्यूसिफरेज एटीपी बायोल्यूमिनेशन परख किट सीएलएसआईआई (रोच, बेसल, स्विटजरलैंड) का उपयोग करके मापा गया था। 42}}/एम का उपयोग अंशांकन के लिए किया गया था। प्रयोगों के दूसरे सेट में, एटीपी संश्लेषण का मूल्यांकन 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxir, या 4 uM UK5099 की उपस्थिति में किया गया था। इस मामले में, 10 कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए विकास माध्यम में अनुपस्थिति या उपस्थिति में ऊष्मायन किया गया था। चयापचय अवरोधक, और एटीपी संश्लेषण 0.1 मिमी एडीपी के साथ प्रेरित किया गया था। ऑक्सफोस (ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण) दक्षता (पी / ओ अनुपात) की गणना उत्पादित एटीपी की एकाग्रता और श्वसन सब्सट्रेट और एडीपी की उपस्थिति में खपत ऑक्सीजन की मात्रा के बीच अनुपात के रूप में की गई थी। जब ऑक्सीजन की खपत पूरी तरह से ऊर्जा उत्पादन के लिए समर्पित होती है, तो क्रमशः पाइरूवेट प्लस मैलेट या सक्सेनेट जोड़ के बाद पी / ओ अनुपात लगभग 2.5 और 1.5 होना चाहिए, [48] एचएएफएस चयापचय में अवायवीय ग्लाइकोलाइसिस के योगदान का मूल्यांकन करने के लिए, ग्लूकोज और लैक्टेट सांद्रता का मूल्यांकन किया गया था। विकास माध्यम में। ग्लूकोज की खपत का मूल्यांकन हेक्सोकाइनेज (HK) और ग्लूकोज -6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (G6PD) युग्मन प्रणाली द्वारा किया गया था, NADP की 340 एनएम की कमी के बाद। परख माध्यम में 100mM Tris-HCl, pH7.4,2mM ATP, 10mMNADP, 2mMMgC12,2IU हेक्सोकाइनेज और 2 IU ग्लूकोज -6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज शामिल थे। NAD प्लस at340 एनएम की कमी के बाद लैक्टेट रिलीज को स्वीकार किया गया। परख माध्यम में 100 मिमी ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8), 5 मिमी एनएडी प्लस, और 1 आईयू / एमएल लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज होता है। शुद्ध लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज के 4 कुरूप को जोड़ने से पहले और बाद में नमूनों का विश्लेषण किया गया था। दोनों ही मामलों में, डेटा को सेल नंबर के लिए सामान्यीकृत किया गया था और क्रमशः एमएम ग्लूकोज/10 डिग्री कोशिकाओं या एमएम लैक्टेट रिलीज/10 डिग्री कोशिकाओं के रूप में व्यक्त किया गया था [107]।

4.3. एचएएफएस का प्रवाह साइटोमेट्री विशेषता

एक लाख (105)भ्रूण-और p-hAFS कोशिकाओं को अलग किया गया और माउस मानव-विरोधी-CD107a-Alexa Fluor 647-और मानव-विरोधी सीडी146-FITC- से अलग किया गया। संयुग्मित एंटीबॉडी (eBioscience, थर्मो फिशर साइंटिफिक, मोंज़ा, इटली)। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक FITC एनेक्सिन वी एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, इटली) का उपयोग करके सेल एपोप्टोसिस का मूल्यांकन किया गया था। FACS दिवा सॉफ्टवेयर (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, मिलान, इटली) से लैस एक BD बायोसाइंस FACS Aria II सॉर्टर और एनालाइज़र पर ईवेंट प्राप्त किए गए थे। FlowJo V9.0 सॉफ़्टवेयर (BD Bioscience, Becton Dickinson, मिलान) का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। , इटली)। 4.4. बुढ़ापा धुंधला हो जाना

इन विट्रो स्थितियों में मानक 5 तक संवर्धित एचएएफएस के सेनेसेंस फेनोटाइप का मूल्यांकन सेनेसेंस -गैलेक्टोसिडेज स्टेनिंग किट (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए, यूएसए) के साथ किया गया था: एफ-हैंड पी-एचएएफएस को 70 प्रतिशत पर 1x फिक्सेटिव सॉल्यूशन के साथ तय किया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, संगम और एसए- -गैल के लिए रात भर 37 डिग्री पर दाग। लीका डीमिल माइक्रोस्कोप (लीका एक्वायर सॉफ्टवेयर V3.4.4, लीका माइक्रोसिस्टम्स, मिलान, इटली से लैस) पर सेन्सेंट घटनाओं का अधिग्रहण किया गया था और प्रति क्षेत्र कुल कोशिकाओं पर एसए - - गैल-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में मूल्यांकन किया गया था।

4.5. एचएएफएस गुप्त अंशों का पृथक्करण और एकाग्रता

f-hAFS और p-hAFS को 24 घंटे के लिए सीरम-मुक्त माध्यम (SF) में 1 प्रतिशत O2 हाइपोक्सिया बनाम 20 प्रतिशत O2 नॉर्मोक्सिया (नियंत्रण) में सुसंस्कृत किया गया था, जिसके बाद का उपयोग आधारभूत संदर्भ के रूप में किया गया था। इस पूर्व शर्त रणनीति का उपयोग जैव-सक्रिय पैरासरीन कारकों की रिहाई को बढ़ाने के लिए किया गया था, जैसा कि हमने पहले बताया था [34,35,37,49]। hAFS को 24 घंटे के लिए सीरम-मुक्त (एसएफ) माध्यम (उच्च ग्लूकोज डल्बेको के संशोधित ईगल के माध्यम, डीएमईएम, 1 प्रतिशत एल-ग्लूटामाइन और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ, गिब्को-थर्मो फिशर साइंटिफिक, मोंज़ा, इटली) से संवर्धित किया गया था। (37 डिग्री पर 20 प्रतिशत ओ2 और 5 प्रतिशत सीओ2) या हाइपोक्सिक (1 प्रतिशत ओ2 और 5 प्रतिशत सीओ2, सेलएक्सपर्ट सी170आई और गैलेक्सी 48आर सीओ2 इन्क्यूबेटरों में 37 डिग्री पर, एपपेंडोर्फ, मिलान, इटली से) स्थितियां।

f-hAFS-CM और p-hAFS-CM को सेल के मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री पर 3 0 10 मिनट के लिए 0x g और 20 मिनट के लिए 2000× g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया; hAFS-CM को 3kDa चयनात्मक कट-ऑफ (एमिकॉन अल्ट्रा -15, मर्क मिलिपोर डार्मस्टैड, जर्मनी) के साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन मेम्ब्रेन का उपयोग करके 4 डिग्री पर 3 000 × g for90 मिनट पर केंद्रित किया गया और फिर आगे 4 पर केंद्रित किया गया। 30 मिनट के लिए 3000× g पर डिग्री। एचएएफएस-ईवी को एचएएफएस-सीएम से सीरियल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग और केंद्रित किया गया था। संक्षेप में, hAFS-CM को सेल मलबे को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 300 × g पर 4 डिग्री पर और 20 मिनट के लिए 2000x g पर एकत्र किया गया था। सतह पर तैरनेवाला तब 40 मिनट के लिए 10,000 × g पर संसाधित किया गया था। गोली को त्याग दिया गया था और सतह पर तैरनेवाला को बेकमैन कल्टर के स्विंगिंग-बाल्टी SW55Ti सेंट्रीफ्यूज रोटार का उपयोग करके 120 मिनट के लिए 10,000 × g पर ऑप्टिमा L -90 K (बेकमैन कल्टर, मिलान, इटली) में अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा संसाधित किया गया था। विषम एचएएफएस-ईवी युक्त गोली को 120 मिनट के लिए 100, 000 × जी पर अंतिम सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ पीबीएस में धोया गया था और फिर पीबीएस में 0.22 उम ताकना फिल्टर झिल्ली के साथ फ़िल्टर किया गया था। एचएएफएस-सीएम में और एचएएफएस-ईवीएस की सतह पर प्रोटीन सांद्रता को बीसिनकोनिक एसिड (बीसीए) परख (थर्मो फिशर साइंटिफिक, मोंज़ा, इटली) का उपयोग करके मापा गया था। समाधान / 10 डिग्री उत्पादक कोशिकाओं के कुरूप के संदर्भ में hAFS-CM और hAFS-EVs उपज का मूल्यांकन करने के लिए 570 एनएम पर Gen5 माइक्रोप्लेट रीडर पर नमूने प्राप्त किए गए थे।

4.6. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा एचएएफएस-ईवी की विशेषता

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) विश्लेषण हिताची टीईएम माइक्रोस्कोप (एचटी78 0 0 श्रृंखला, हिताची हाई टेक्नोलॉजीज, मोंज़ा, इटली) पर किया गया था। मेगा व्यू 3 कैमरा और त्रिज्या सॉफ्टवेयर (ईएमएसआईएस, मुएनस्टर, जर्मनी) के साथ डिजिटल छवियां ली गईं। f-hAFS और p-hAFS को 3.7 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड (PA) घोल में 1:1 पतला hAFS पूर्ण माध्यम से तय किया गया, 0.1 M कैकोडायलेट बफर में धोया गया, और फिर कमरे के तापमान पर तुरंत 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। 0.1 एम कैकोडायलेट बफर जिसमें 2.5 प्रतिशत ग्लूटाराल्डिहाइड (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी साइंस, हैटफील्ड, पीए, यूएसए) होता है। सेल छर्रों को एलएच के लिए ऑस्मियम टेट्रोक्साइड में और 1 घंटे के लिए 1 प्रतिशत यूरेनिल एसीटेट समाधान में पोस्ट-फिक्स किया गया था। नमूने 24 घंटे के लिए 42 डिग्री और 48 घंटे 60 डिग्री पर एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से निर्जलित किए गए थे और एपॉक्सी राल (पॉली-बेड; पॉलीसाइंसेस यूरोप जीएमबीएच, मिनियापोलिस, जर्मनी) में एम्बेडेड थे। अल्ट्राथिन वर्गों (50 एनएम) को लीका अल्ट्राकट माइक्रोटोम (लीका माइक्रोसिस्टम्स, मिलान, इटली) के साथ काटा गया था और 50 प्रतिशत इथेनॉल समाधान में 5 प्रतिशत यूरेनिल एसीटेट के साथ काउंटरस्टैंड किया गया था। f-hAFS-EVs और p-hAFS-EVs को 20 uL PBS सॉल्यूशन में फिर से जोड़ा गया और 0.1 M फॉस्फेट बफर सॉल्यूशन (pH7.4) में 2 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड की समान मात्रा जोड़कर तय किया गया। ईवीएस को तब 10 मिनट के लिए फॉर्मवार-कार्बन कोटेड कॉपर ग्रिड पर पैराफिल्म पर 5 μL बूंदों पर ग्रिड तैरकर adsorbed किया गया था। इसके बाद, ईवीएस का पालन करने वाले ग्रिड को पीबीएस में धोया गया और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2 प्रतिशत यूरेनिल एसीटेट समाधान द्वारा नकारात्मक रूप से दाग दिया गया। बेहतर संरक्षण और परीक्षा से पहले हवा को सुखाने के लिए सना हुआ ग्रिड 2.5 प्रतिशत मिथाइलसेलुलोज में एम्बेडेड थे। एचएएफएस-ईवी के मॉर्फोमेट्री विश्लेषण को 40 पर 10 बेतरतीब ढंग से लिए गए माइक्रोग्राफ पर मापा गया था। 000 × g आवर्धन। त्रिज्या सॉफ्टवेयर (ईएमएसआईएस, मुएनस्टर जर्मनी) के माप संवाद बॉक्स में एम्बेडेड मनमानी लाइन फ़ंक्शन का उपयोग करके आकार की गणना की गई थी। hAFS-EVs आकार वितरण की कल्पना करने के लिए, परिणामों को स्कैटर डॉट प्लॉट के रूप में और आवृत्ति वितरण के रूप में प्लॉट किया गया था जिसमें प्रत्येक आकार को माध्य मान और सीमा के लिए रेखाओं के साथ एक बिंदु के रूप में दर्शाया गया है।

f-hAFS-EVs और p-hAFS-EVs का भी नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग एनालिसिस (NTA) द्वारा विश्लेषण किया गया ताकि 10 डिग्री कोशिकाओं द्वारा जारी कणों का आकलन किया जा सके। एचएएफएस-ईवी को पीबीएस समाधान में 1:100 पतला किया गया था और नैनोसाइट एलएम 10 (मालवर्न इंस्ट्रूमेंट्स, मालवर्न, यूके) पर अधिग्रहित किया गया था, जिसमें प्रत्येक 60 एस के कम से कम 3 अलग-अलग फ्रेम दर्ज किए गए थे। सॉफ्टवेयर में बैच प्रक्रिया विकल्प का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के तीन अलग-अलग अधिग्रहणों का विश्लेषण किया गया। 4.7.LC-MS/MS hAFS-CM और hAFS-EVs का विश्लेषण 4.7.1.इन-सॉल्यूशन डाइजेस्ट

एचएएफएस-सीएम और एचएएफएस के 3 जैविक प्रतिकृति पर प्रोटीन विश्लेषण किया गया था। नॉर्मोक्सिक या हाइपोक्सिक प्रीकंडीशनिंग (n =24 अलग-अलग स्थितियों) के बाद f-hAFS और p-hAFS से EVs। hAFS-CM और hAFS-EVs के नमूनों को 0 में निलंबित कर दिया गया। 1M NHCO3 pH 7.9 और RapigestIM के साथ इलाज किया गया। एसएफ अभिकर्मक (वाटर्स कंपनी, मिलफोर्ड, एमए, यूएसए) 0.25 प्रतिशत (w/v) की अंतिम एकाग्रता पर। परिणामी निलंबन 100 डिग्री पर 2{{40}} मिनट के लिए हिलाते हुए लगाए गए थे। सीक्वेंसिंग ग्रेड मॉडिफाइड ट्रिप्सिन (Promega Inc, Madison, WI, USA) को 1:50 (w/w) के एंजाइम/सब्सट्रेट अनुपात में रात भर में 0.1 M NH4HCO3 pH7.9 में 37 डिग्री पर जोड़कर प्रत्येक नमूने पर पाचन किया गया। 10 प्रतिशत CHSCN के साथ बफर। सुबह में ट्रिप्सिन (1:100 w/w) का एक अतिरिक्त विभाज्य जोड़ा गया, और पाचन 4 घंटे तक जारी रहा। इसके अलावा, 0.5 प्रतिशत ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) गिग्मा-एल्ड्रिच इंक।, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) ने एंजाइमी प्रतिक्रिया को रोक दिया, और बाद में 45 मिनट के लिए 37 डिग्री पर ऊष्मायन ने रैपिजेस्ट एसिड हाइड्रोलिसिस पूरा किया [108]। जल-अमिश्रणीय अवक्रमण उत्पादों को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 13.000 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए हटा दिया गया था। अंत में, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, पियर्स टीएम सी -18 स्पिन कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, मोंज़ा, इटली) का उपयोग करके ट्राइप्टिक डाइजेस्ट मिश्रण को हटा दिया गया था, और 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड (सिग्मा-एल्ड्रिच इंक, सेंट) में फिर से जोड़ा गया था। लुइस, एमओ, यूएसए) पानी में (एलसी-एमएस अल्ट्रा क्रोमासोल्वटीएम, हनीवेल रीडेल-डी हेनटीएम, मुस्केगॉन, एमआई, यूएसए) 0.1 ug/μL की सांद्रता पर।

4.7.2.तरल क्रोमैटोग्राफी

ट्रिप्सिन डाइजेस्ट किए गए मिश्रणों का विश्लेषण एक नैनो-लिक्विड क्रोमैटोग्राफिक सिस्टम, एक्ज़िजेंट नैनोएलसी-अल्ट्रा [2] 2 डी सिस्टम (एक्सीजेंट, एबी एससीआईईएक्स डबलिन, डबलिन, सीए, यूएसए का हिस्सा) से युक्त एक प्लेटफॉर्म के माध्यम से किया गया था, जिसे ट्रैप-एल्यूट मोड में कॉन्फ़िगर किया गया था। एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ युग्मित। संक्षेप में, नमूने (0.8 कुरूप इंजेक्शन) पहले एक पेप्टाइड ट्रैप (200 um × 500 um ChromXP C18- पर लोड किए गए थे। सीएल, 3 उम, 120 ए) और 3 μL/मिनट के प्रवाह पर 10 मिनट के लिए पानी में 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड के साथ आइसोक्रेटिक मोड में चल रहे लोडिंग पंप से धोया। दस-पोर्ट वाल्व के स्वचालित स्विचिंग ने फिर फंसे हुए मिश्रण को नैनो-उलट चरण कॉलम (75 um × 15 सेमी ChromXP C 18- CL, 3 um, 120 A) पर 150 मिनट के एलुएंट बी के ढाल के माध्यम से हटा दिया। (एलुएंट ए, पानी में 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड; एलुएंट बी, एसीटोनिट्राइल में 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड) 300 एनएल / मिनट की प्रवाह दर पर। गहराई में, ढाल था: 5-10 प्रतिशत बिन 3 मिनट, 10-40 प्रतिशत बिन 130 मिनट, 40-95 प्रतिशत बिन 10 मिनट और 7 मिनट के लिए 95 प्रतिशत बी पर होल्डिंग। 4.7.3.मास स्पेक्ट्रोमेट्री

MS / MS विश्लेषण एक नैनोस्प्रे आयन स्रोत से लैस LTQ-OrbitrapXL मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक, मोंज़ा, इटली) पर किया गया था। स्प्रे केशिका वोल्टेज 1.7 kV पर सेट किया गया था और आयन स्थानांतरण केशिका तापमान 22 0 डिग्री पर रखा गया था। पूर्ण MS स्पेक्ट्रा को सकारात्मक आयन मोड में 400-1600 m/z रेंज में दर्ज किया गया था, जिसमें 60000 की संकल्प शक्ति (आधी-अधिकतम पर पूर्ण चौड़ाई) और 2 स्पेक्ट्रा/s की स्कैन दर थी। इस कदम के बाद पांच निम्न-रिज़ॉल्यूशन वाले MS/MS इवेंट हुए, जो क्रमिक रूप से पूर्ण MS स्पेक्ट्रम (35 प्रतिशत टकराव ऊर्जा पर) से चुने गए शीर्ष पांच आयनों पर डेटा-निर्भर तरीके से उत्पन्न हुए, 0.5 मिनट के गतिशील बहिष्करण का उपयोग करते हुए। एमएस / एमएस विश्लेषण। मास स्पेक्ट्रोमीटर स्कैन फ़ंक्शन और उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी सॉल्वेंट ग्रेडिएंट्स को Xcalibur डेटा सिस्टम संस्करण 1.4 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, मोंज़ा, इटली) द्वारा नियंत्रित किया गया था।

4.7.4.प्रोटिओमिक डाटा प्रोसेसिंग और डाटा माइनिंग

थर्मो साइंटिफिक प्रोटिओम डिस्कवरर सॉफ्टवेयर, संस्करण 2.1 में निहित सीक्वेस्ट एचटी सर्च इंजन का उपयोग करके सभी उत्पन्न डेटा की खोज की गई थी। प्रयोगात्मक MS/MS स्पेक्ट्रा को 2 जनवरी में डाउनलोड किए गए Uniprot Homo Sapiens proteome डेटाबेस (74600 प्रविष्टियों) के सिलिको पाचन में प्राप्त सैद्धांतिक द्रव्यमान स्पेक्ट्रा के साथ तुलना करके ट्राइप्टिक पेप्टाइड अनुक्रमों से सहसंबद्ध किया गया था। 020 (www.uniprot.org, 10 मार्च 2021 को एक्सेस किया गया)। पेप्टाइड अनुक्रमों और संबंधित प्रोटीनों की पहचान के लिए निम्नलिखित मानदंडों का उपयोग किया गया था: एक एंजाइम के रूप में ट्रिप्सिन, प्रति पेप्टाइड में तीन छूटी हुई दरारें, अग्रदूत आयनों के लिए ± 50 पीपीएम की बड़े पैमाने पर सहनशीलता, और ± 0.8 दा फॉर-टुकड़ा आयनों। पेरकोलेटर नोड का उपयोग लक्ष्य-डिकॉय रणनीति के साथ 0.05 [109] के अधिकतम डेल्टा सीएन पर विचार करते हुए, क्यू-मानों के आधार पर 0.01 (सख्त) के पेप्टाइड स्पेक्ट्रम मैच (पीएसएम) स्तर पर अंतिम झूठी खोज दर (एफडीआर) देने के लिए किया गया था। केवल छह अमीनो एसिड और रैंक 1 की न्यूनतम पेप्टाइड लंबाई वाले पेप्टाइड्स पर विचार किया गया था। प्रोटीन समूहन और सख्त पारसीमोनी सिद्धांतों को लागू किया गया। MS डेटा को PRIDE [10] पार्टनर रिपॉजिटरी (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, 10 मार्च 2021 को एक्सेस किया गया) के माध्यम से प्रोटिओमएक्सचेंज कंसोर्टियम में जमा किया गया है। SEQUEST एल्गोरिथम से प्राप्त 48 प्रोटीनों को संरेखित, सामान्यीकृत किया गया था। , और लेबल-मुक्त तुलना। औसत पेप्टाइड स्पेक्ट्रम मैचों (एपीएसएम) [111,112] का उपयोग करते हुए इस उद्देश्य के लिए एक इन-हाउस एल्गोरिदम, अर्थात्, बहुआयामी एल्गोरिथम प्रोटीन मैप (एमएप्रोमा) नियोजित किया गया था, जो एक प्रोटीन के लिए पहचाने गए सभी स्पेक्ट्रा के औसत के अनुरूप है और, परिणामस्वरूप , इसके सापेक्ष बहुतायत में, प्रत्येक विश्लेषण की स्थिति में। गहराई से, विभेदित रूप से व्यक्त प्रोटीन का चयन करने के लिए, उपसमूह (भ्रूण-बनाम पेरिनाटल-एचएएफएस-सीएम और एचएएफएस-ईवी दोनों के लिए, हाइपोक्सिक सेल प्रीकॉन्डिशनिंग उत्तेजना पर भी विचार करते हुए), दो MAProMa पर 0.4 और 5 की सीमा लागू करके जोड़ीदार थे। इंडेक्स DAve (डिफरेंशियल एवरेज) और DCI (डिफरेंशियल कॉन्फिडेंस इंडेक्स), क्रमशः। DAve, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का मूल्यांकन करता है, को (XY)/(X＋Y)/0.5 के रूप में परिभाषित किया गया था, जबकि DCI जो अंतर अभिव्यक्ति के विश्वास का मूल्यांकन करता है, को (X प्लस Y) × (XY) / 2 X और Y के रूप में परिभाषित किया गया था। शब्द दो तुलनात्मक नमूनों में दिए गए प्रोटीन के PSM का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, प्रत्येक जांच की स्थिति से प्राप्त औसत प्रोटीन सूचियों को रैखिक विभेदक विश्लेषण (एलडीए) के अधीन किया गया था, और सबसे बड़े एफ अनुपात वाले प्रोटीन (4.5 से अधिक या बराबर) और सबसे छोटा पी-मान (से कम या बराबर) 0.001) को पदानुक्रमित क्लस्टरिंग द्वारा बनाए रखा और संसाधित किया गया, वार्ड की विधि और यूक्लिडियन की दूरी मीट्रिक को JMP 15.2 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके लागू किया गया। विशेष रूप से, F अनुपात त्रुटि माध्य वर्ग द्वारा विभाजित मॉडल माध्य वर्ग का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि p-मान ने उस गणना से अधिक F मान प्राप्त करने की संभावना का संकेत दिया, यदि वास्तव में, जनसंख्या समूह के बीच कोई अंतर नहीं था। 4.8. एचएएफएस-सीएम और हैव-ईवीएस की साइटोकाइन और केमोकाइन प्रोफाइलिंग

hAFS-CM की साइटोकाइन और केमोकाइन प्रोफाइलिंग और हाइपोक्सिक पूर्व शर्त के बाद f-hAFS और p-hAFS द्वारा प्राप्त हैव-ईवी का मूल्यांकन प्रोटिओम प्रोफाइलरटीएम ह्यूमन एक्सएल साइटोकाइन एरे किट (आर एंड डी सिस्टम, मिनियापोलिस, एमएन, यूएसए) के अनुसार किया गया था। निर्माता के निर्देशों। hAFS-CM और hAFS-EVs के बीस कुरूप नमूनों का उपयोग किया गया। झिल्ली छवियों को एक केमिडॉक मिनी एचडी 9 ऑटो (यूविटेक कैम्ब्रिज, यूके) द्वारा अधिग्रहित किया गया था, विशिष्ट साइटोकाइन / केमोकाइन सामग्री का मूल्यांकन इमेजजे सॉफ्टवेयर (https पर उपलब्ध) का उपयोग करके प्रत्येक पता लगाने योग्य साइटोकाइन के लिए सकारात्मक पिक्सेल तीव्रता (मनमानी इकाई के माध्यम से) की मात्रा का मूल्यांकन करके किया गया था। //imagej.nih.gov/ij/, 10 मार्च 2021 को एक्सेस किया गया [13])। 4.9. एचएएफएस-ईवीएस और अगले से आरएनए एक्सट्रैक्शन

पीढ़ी अनुक्रमण

निर्माता के निर्देशों के अनुसार RNA को f-hAFS-EVs और p-have-EVs से miRNeasy Micro Kit (क्यूजेन, मिलान, इटली) से अलग किया गया था। 6 से 150 न्यूक्लियोटाइड्स (एनटी) तक के छोटे आरएनए की सामग्री का आकलन करने के लिए छोटे नॉनकोडिंग आरएनए चिप के साथ एगिलेंट स्मॉल आरएनए किट का उपयोग करके आरएनए अखंडता और आकार वितरण का मूल्यांकन किया गया था। क्यूबिट माइक्रोआरएनए परख किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक, मोंज़ा, इटली) का उपयोग निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए माइक्रोआरएनए (miRNAs) सामग्री को निर्धारित करने के लिए किया गया था। miRNA अनुक्रमण पुस्तकालयों को इनपुट के रूप में पृथक miRNAs के 18.5ng का उपयोग करके और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए QIAseq miRNA लाइब्रेरी किट (क्यूजेन, मिलान, इटली) का उपयोग करके तैयार और प्रवर्धित किया गया था। टेपस्टेशन (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, फोस्टर सिटी, सीए, यूएसए) द्वारा गुणवत्ता जांच और परिमाणीकरण के बाद पुस्तकालयों को एगिलेंट हाई सेंसिटिविटी डी 1000 स्क्रीनटेप का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था। "सीक्वेंसिंग लाइब्रेरी qPCR क्वांटिफिकेशन" गाइड (इलुमिना इंक, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) के बाद वास्तविक समय qPCR द्वारा गुणवत्ता नियंत्रण के लिए पूल किए गए पुस्तकालयों का मूल्यांकन किया गया था और उच्च आउटपुट हिट v2.5 (75 चक्र) का उपयोग करके इलुमिना नेक्स्टसेक प्लेटफॉर्म द्वारा अनुक्रमित किया गया था। इलुमिना इंक, सैन डिएगो, सीए, यूएसए)। बेस कॉलिंग डिफ़ॉल्ट Illumina NextSeq500 वर्कफ़्लो के साथ की गई थी।

4.10. miRNA अनुक्रमण का जैव सूचनात्मक डेटा विश्लेषण

Fastq फ़ाइलों को सबसे पहले Cutadapt [114] का उपयोग करके 3' एडॉप्टर और निम्न-गुणवत्ता वाले आधारों को काटकर संसाधित किया गया था। ट्रिमिंग के बाद, इन्सर्ट सीक्वेंस और यूएमआई सीक्वेंस की पहचान की गई। बिना एडेप्टर अनुक्रम के पढ़ता है, 16 बीपी से कम सम्मिलित अनुक्रमों के साथ पढ़ता है, और 10 बीपी से कम यूएमआई अनुक्रमों के साथ पढ़ता है त्याग दिया गया था। सम्मिलित अनुक्रमों को एनोटेट करने के लिए, बॉटी [15] का उपयोग करके GRCh38 मानव जीनोम असेंबली के लिए रीड्स को संरेखित किया गया था [15] प्रत्येक नमूने के लिए एक विशेष miRNA को सौंपे गए सभी रीड्स को गिना गया था, और संबंधित UMI को अद्वितीय अणुओं की गणना करने के लिए एकत्र किया गया था। उचित अनुरोध पर उपलब्ध कस्टम आर लिपियों द्वारा माध्यमिक विश्लेषण किया गया था। लिम्मा [116] और एजआर बायोकॉन्टर पैकेज [117] का उपयोग करके विभेदक संवर्धन विश्लेषण किया गया था।

4.11. सांख्यिकीय आंकड़े

परिणाम कम से कम तीन (n {0}}) स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± अर्ध के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। तुलना एकतरफा एनोवा द्वारा की गई, उसके बाद पोस्टहॉक टुके की बहु तुलना परीक्षण या छात्र के टी-टेस्ट द्वारा। ग्राफ-पैड प्रिज्म संस्करण 8.0.2 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, https://www.graphpad.com, 10 मार्च 2021 को एक्सेस किया गया) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था, जिसमें सांख्यिकीय महत्व * p पर सेट किया गया था।<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

अंत में, भ्रूण- और प्रसवकालीन एचएएफएस को आकार और वितरण में तुलनीय स्रावी शक्ति और ईवी संवर्धन के साथ फेनोटाइपिक रूप से समकक्ष पाया गया; फिर भी उनके गुप्त प्रोफाइल में कुछ भेदों की सराहना की जा सकती है। विशेष रूप से, भ्रूण एचएएफएस के विकासात्मक रूप से अपरिपक्व प्रोफाइल को उनके स्रावी योगों द्वारा पुनर्पूंजीकृत किया जा सकता है जो अधिक स्पष्ट प्रो-वास्कुलोजेनिक, प्रो-रीजेनरेटिव और कायाकल्प स्राव के साथ संपन्न होते हैं। हालांकि, प्रसवकालीन एचएएफएस अभी भी एंडोथेलियल सेल माइग्रेशन, इम्यून-मॉड्यूलेटरी, एंटी-इंफ्लेमेटरी और भ्रूण एचएएफएस के समान न्यूरोट्रॉफिक क्षमता से संबंधित कारकों की अभिव्यक्ति के माध्यम से एक प्रासंगिक पैरासरीन प्रोफाइल बनाए रखता है। ये निष्कर्ष चोट से संबंधित और सूजन / इस्केमिक-आधारित बीमारी के भविष्य के पैरासरीन थेरेपी का समर्थन करने वाली उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। इसलिए, विशिष्ट नैदानिक ​​​​परिदृश्य को देखते हुए सबसे आदर्श सेल स्रोत के रूप में भ्रूण या प्रसवकालीन एचएएफएस के चयन का मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

यह लेख Int से निकाला गया है। जे. मोल. विज्ञान 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms