एकतरफा किडनी इस्केमिया-रीपरफ्यूजन चोट के बाद किडनी फाइब्रोसिस पर कॉन्ट्रालेटरल नेफरेक्टोमी समय और इस्केमिक स्थितियों का प्रभाव

परिचय

की घटनातीक्ष्ण गुर्दे की चोट(एकेआई) हाल के वर्षों में दुनिया भर में नाटकीय रूप से बढ़ गया है [1]। नैदानिक ​​​​अभ्यास में AKI अंग प्रत्यारोपण, छिड़काव के बाद पोस्टऑपरेटिव, रक्तस्राव, निर्जलीकरण, सदमे और सेप्सिस के कारण हो सकता है [2]। हाल के महामारी विज्ञान और प्रयोगात्मक अध्ययनों से पता चला है कि AKI की गंभीरता, आवृत्ति और अवधि बाद की घटनाओं से निकटता से जुड़ी हुई है।दीर्घकालिक वृक्क रोग(सीकेडी)। AKI के बाद किडनी फ़ाइब्रोसिस सीकेडी या यहां तक ​​​​कि सीकेडी का कारण बन सकता हैअंतिम चरण की किडनी की बीमारी(ईएसकेडी) [3-5], जिसका अर्थ है कि एकेआई और सीकेडी जुड़े हुए सिंड्रोम हैं [6]। हालाँकि, कई प्रयोगात्मक और नैदानिक ​​​​अध्ययनों के बावजूद AKI से CKD में संक्रमण के अंतर्निहित तंत्र अज्ञात बने हुए हैं। पशु मॉडल उन तंत्रों की जांच के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं जिनके द्वारा AKI सीकेडी की ओर ले जाता है। किडनी इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट (आईआरआई) एकेआई के प्रमुख कारणों में से एक है, और आईआरआई-प्रेरित एकेआई के कई पशु मॉडल विकसित किए गए हैं [7], जिसमें द्विपक्षीय आईआरआई (बीआईआरआई) मॉडल, बरकरार कॉन्ट्रालेटरल किडनी के साथ एकतरफा आईआरआई मॉडल शामिल है। , एक साथ कॉन्ट्रैटरल नेफरेक्टोमी के साथ यूआईआरआई मॉडल, और विलंबित कॉन्ट्रैटरल नेफरेक्टोमी के साथ यूआईआरआई मॉडल।

बीआईआरआई मॉडल कम सुसंगत है क्योंकि जब दोनों किडनी की इस्केमिक चोट बहुत हल्की होती है, तो लंबी अवधि में कोई महत्वपूर्ण फाइब्रोटिक परिवर्तन नहीं होते हैं। जब AKI बहुत गंभीर होता है, तो तीव्र चोट चरण में चूहों की मृत्यु हो सकती है। इसके अलावा, दोनों किडनी की चोट में छोटे अंतर से कुछ हफ्तों के बाद उनकी क्रोनिक किडनी पैथोलॉजी में महत्वपूर्ण अंतर हो सकता है [8,9]। एक साथ कॉन्ट्रैटरल नेफ्रोटॉमी वाला यूआईआरआई मॉडल बीआईआरआई मॉडल के समान है क्योंकि दूसरी तरफ नेफरेक्टोमी के कारण केवल घायल किडनी बची है [10]। बरकरार कॉन्ट्रैटरल किडनी वाले आईआरआई मॉडल में, इस्केमिक किडनी का फाइब्रोसिस गंभीर है [11,12]। शोधकर्ताओं द्वारा दीर्घकालिक अवलोकन के लिए यह मॉडल बहुत सुसंगत और विश्वसनीय है। हालाँकि, एक विपरीत क्षतिग्रस्त गुर्दे की उपस्थिति के कारण, इसका उपयोग अनुमानित ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर (ईजीएफआर), सीरम क्रिएटिनिन (एससीआर), और रक्त यूरिया नाइट्रोजन (बीयूएन) [11-14] के मूल्यांकन के लिए नहीं किया जा सकता है। ऊपर उल्लिखित दो यूआईआरआई मॉडल की तुलना में, विलंबित कॉन्ट्रैटरल नेफरेक्टोमी वाला यूआईआरआई मॉडल इन समस्याओं पर काबू पाता है और इसका उपयोग एकेआई और किडनी फ़ंक्शन मॉनिटरिंग के बाद दीर्घकालिक अवलोकन दोनों के लिए किया जा सकता है। इसलिए, यह मॉडल AKI-CKD संक्रमण [15] का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है।

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फिर भी, विभिन्न इस्केमिक स्थितियां और कॉन्ट्रैटरल नेफरेक्टोमी और यूआईआरआई के बीच का अंतराल AKI के बाद सीकेडी की प्रगति और गंभीरता पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है। पिछले अध्ययनों ने पोस्ट-एकेआई किडनी फाइब्रोसिस पर इस्कीमिक अवधि के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित किया है और इस्कीमिया के दौरान शरीर के मुख्य तापमान पर अधिक ध्यान नहीं दिया है। उदाहरण के लिए, स्क्रीपनीक एट अल। [12] जल स्नान प्रणाली द्वारा 38 डिग्री सेल्सियस पर इस्कीमिक तापमान को नियंत्रित किया गया, जिसकी इस्कीमिक अवधि 30 मिनट थी, और यूआईआरआई के 8 दिन बाद कॉन्ट्रैटरल अक्षुण्ण किडनी को हटा दिया गया। परिणाम से पता चला कि यूआईआरआई के 28 दिन बाद इस्केमिक किडनी में महत्वपूर्ण फाइब्रोटिक परिवर्तन हुए थे। समान इस्केमिक अवधि के साथ, जिओ एट अल। [8] दिखाया गया कि यूआईआरआई के 11 दिन बाद महत्वपूर्ण फाइब्रोटिक परिवर्तन हुए जब इस्केमिक तापमान 37 सी 38 सी पर नियंत्रित किया गया था और यूआईआरआई और कॉन्ट्रैटरल नेफरेक्टोमी के बीच का समय अंतराल 10 दिन था। कुछ शोधकर्ता, जैसे कोलोम्बारो एट अल। [14] और ली एट अल। [16] ने अपने अध्ययन में इस्कीमिक तापमान का उल्लेख नहीं किया।

इस बीच, कुछ लोगों ने इस मॉडल में कॉन्ट्रैटरल नेफरेक्टोमी और यूआईआरआई के बीच समय अंतराल के प्रभाव पर शोध किया, जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच व्यापक रूप से भिन्न परिणाम सामने आए, जिसने बाद के प्रयोगों को भी नाटकीय रूप से प्रभावित किया। इस अध्ययन में, हमने AKI के बाद किडनी फाइब्रोसिस को प्रभावित करने वाले मुख्य कारकों के प्रभावों की जांच की, जिसमें कॉन्ट्रैटरल नेफरेक्टोमी और uIRI के बीच का समय अंतराल, इस्केमिया के दौरान शरीर का मुख्य तापमान और इस्कीमिक अवधि शामिल है। हमारा उद्देश्य AKI CKD संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल बनाने के लिए एक संदर्भ प्रदान करना था

सामग्री और विधियाँ पशु मॉडल

नर C57BL/6J चूहों (8-10 सप्ताह की आयु, लगभग 22 ग्राम वजन; GemPharmatech Co., Ltd., नानजिंग, चीन) को शांक्सी मेडिकल यूनिवर्सिटी के पशु प्रयोग केंद्र में भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच प्रदान की गई। प्रजनन की स्थितियाँ इस प्रकार थीं: आर्द्रता 40-70%, तापमान 23 सी, वायु स्वच्छता वर्ग 7, रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में नियंत्रित 12-एच प्रकाश/अंधेरा चक्र, फ़ीड सीओ60 विकिरण, और शुद्ध पानी। इस अध्ययन की सभी प्रक्रियाओं को शांक्सी मेडिकल यूनिवर्सिटी के दूसरे अस्पताल की पशु आचार समिति (नैतिकता संख्या: DW2022028) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

प्रोटोकॉल

इस बात पर विचार करते हुए कि इस्केमिक अवधि, इस्केमिया के दौरान शरीर का मुख्य तापमान, और कॉन्ट्रैटरल अनइंजर्ड किडनी के उच्छेदन का समय सभी एकेआई और उसके बाद किडनी फाइब्रोसिस की गंभीरता पर प्रभाव डाल सकते हैं, हमने उपरोक्त तीन कारकों के प्रभावों की व्यक्तिगत रूप से जांच की, अन्य दो तय किए गए। तीन प्रयोग इस प्रकार किये गये।

प्रोटोकॉल 1: किडनी के कार्य और पोस्ट-एकेआई फाइब्रोसिस पर कॉन्ट्रैटरल नेफरेक्टोमी और यूआईआरआई के बीच के अंतराल के प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए, बाईं किडनी का इस्केमिक समय 24 मिनट पर तय किया गया था और किडनी के दौरान शरीर का मुख्य तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर तय किया गया था। इस बीच इस्किमिया। बायीं किडनी आईआरआई के बाद दाहिनी किडनी का उच्छेदन क्रमशः 7वें दिन, 10वें दिन और 14वें दिन किया गया (n=8 प्रति समूह)। हमने पिछले अध्ययनों [8,10,12,15] और हमारे पूर्व-प्रयोगात्मक परिणामों के आधार पर इस्किमिया और किडनी रिसेक्शन की अवधि निर्धारित की। अध्ययन प्रोटोकॉल के लिए चित्र 1(ए-सी) देखें।

प्रोटोकॉल 2: एकेआई-सीकेडी संक्रमण पर इस्केमिया के दौरान शरीर के मुख्य तापमान के प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए, बाईं किडनी का इस्कीमिक समय 24 मिनट तय किया गया था, और बाईं किडनी आईआरआई के 14 दिन बाद दाहिनी किडनी को हटा दिया गया था। मुख्य शरीर का तापमान क्रमशः 36 C, 36.5 C, 37 C, 37.5 C, और 38 C पर नियंत्रित किया गया (n=8 प्रति समूह)। अध्ययन प्रोटोकॉल के लिए चित्र 1(डी) देखें।

प्रोटोकॉल 3: AKI से CKD में संक्रमण पर किडनी की इस्कीमिक अवधि के प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए, इस्कीमिया के दौरान मुख्य शरीर का तापमान 37 C पर तय किया गया था, और बाईं किडनी IRI के 14 दिन बाद दाहिनी किडनी को हटा दिया गया था। हमने यह समय बिंदु इसलिए चुना क्योंकि किडनी फ़ाइब्रोसिस, जो कि AKI से CKD के बाद सामान्य परिवर्तन था, रिपोर्टों [8,10,12,15] और हमारे पूर्व-प्रयोगात्मक परिणामों के अनुसार बहुत स्पष्ट था। बाईं किडनी का इस्केमिक समय क्रमशः 21 मिनट, 24 मिनट, 27 मिनट और 30 मिनट पर नियंत्रित किया गया था (n=8 प्रति समूह)। अध्ययन प्रोटोकॉल के लिए चित्र 1(ई) देखें।

बायीं किडनी के आईआरआई के 8 सप्ताह बाद सभी चूहों को इच्छामृत्यु दे दी गई। बाएं गुर्दे के ऊतक का एक हिस्सा बाद के आरटी-पीसीआर और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था, और दूसरा हिस्सा हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण के लिए तटस्थ फॉर्मेलिन में तय किया गया था। जैव रासायनिक परीक्षण के लिए रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस के माध्यम से रक्त के नमूने एकत्र किए गए।

चित्र 1. विलंबित कॉन्ट्रैटरल नेफरेक्टोमी के साथ एकतरफा इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट (यूआईआरआई) के प्रोटोकॉल। (ए-सी): बायीं किडनी को दिन 0 पर आईआरआई के अधीन किया गया था, और दाहिनी किडनी का उच्छेदन अलग-अलग समय बिंदुओं (दिन 7, दिन 1 0, और दिन 14) पर इस्कीमिक अवधि के साथ किया गया था। किडनी इस्किमिया के दौरान शरीर के मुख्य तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रखते हुए 24 मिनट पर निर्धारित किया जाता है। (डी): बाईं किडनी को दिन 0 पर आईआरआई के अधीन किया गया था, और दाहिनी किडनी का उच्छेदन इस्केमिक के साथ शरीर के विभिन्न तापमान (36 सी, 36.5 सी, 37 सी, 37.5 सी, और 38 सी) के तहत किया गया था। बाईं किडनी का समय 24 मिनट तय किया गया, और दाईं किडनी को बाईं किडनी आईआरआई के 14 दिन बाद हटा दिया गया। (ई): बायीं किडनी को 0 दिन पर आईआरआई के अधीन किया गया था, और दायीं किडनी का उच्छेदन अलग-अलग इस्केमिक अवधि (21 मिनट, 24 मिनट, 27 मिनट और 30 मिनट) में किया गया था, जिसमें किडनी के दौरान शरीर का मुख्य तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर तय किया गया था। इस्केमिया, और बायीं किडनी आईआरआई के 14 दिन बाद दाहिनी किडनी हटा दी गई। 56वें ​​दिन तक किडनी का वजन, किडनी का कार्य, किडनी हिस्टोलॉजिकल चोट और किडनी फाइब्रोसिस का आकलन किया गया।

शल्य प्रक्रिया

सर्जरी से पहले, सभी चूहों को पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ 12 घंटे तक उपवास किया गया और उन्हें 3% पेंटोबार्बिटल सोडियम 5 {{13 }} मिलीग्राम/किग्रा इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन दिया गया। एनेस्थीसिया के दौरान, विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों में मलाशय का तापमान क्रमशः 36 C, 36.5 C, 37 C, 37.5 C, या 38 C पर बनाए रखा गया था। इसे प्राप्त करने के लिए, चूहे को उसकी पीठ के बल एक हीटिंग पैड (CW{{10}}, बार्बरस ग्रोथ, झेजियांग, चीन) पर उसके सिर और गर्दन को फैलाकर रखा गया ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि उसका वायुमार्ग बना रहे। अबाधित, और प्रक्रिया के दौरान सूखने से बचाने के लिए आँखों को गर्म नमकीन धुंध से ढक दिया गया था। एनेस्थीसिया के बाद चूहे की बायीं पीठ के बालों को हेयर क्लिपर से काट दिया गया। फिर सर्जिकल क्षेत्र की त्वचा को 75% अल्कोहल स्वैब से साफ किया गया। आमतौर पर बाल शेव करने के बाद चूहे के शरीर का तापमान गिर जाता है। सर्जिकल प्रक्रिया तब की गई जब शरीर का मुख्य तापमान स्थिर हो गया, जिसमें लगभग 15 मिनट लग सकते थे। बाईं किडनी को बाईं पृष्ठीय त्वचा को मध्य रेखा के बगल में 0.5 सेमी और चूहे की पसली के पिंजरे के निचले किनारे पर 0.5 सेमी काटकर देखा जा सकता है। फिर हमने बाईं किडनी को शरीर के गुहा से बाहर निकालने के लिए एक हाथ से बाएं पेट को दबाया, कुंद घुमावदार संदंश के साथ किडनी को उठाया (किडनी को नुकसान न पहुंचे इसका ध्यान रखते हुए), किडनी के पेडिकल को अलग किया और इसे जल्दी से क्लैंप किया, और क्लैंप को लगा दिया इसे गर्म और नमीयुक्त बनाए रखने के लिए त्वचा के नीचे किडनी। सफल इस्किमिया की विशेषता गुर्दे के रंग में लाल से गहरे बैंगनी तक क्रमिक परिवर्तन था, जो विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों में क्रमशः 21 मिनट, 24 मिनट, 27 मिनट और 30 मिनट तक चला। क्लैंप छोड़ने के 2-5 मिनट के भीतर किडनी का रंग वापस लाल हो गया। फिर हमने पेट की गुहा को परतदार टांके से बंद कर दिया। यूआईआरआई के बाद क्रमशः 7वें, 10वें और 14वें दिन अलग-अलग प्रायोगिक समूहों में दाहिनी पृष्ठीय त्वचा और मांसपेशियों को काटा गया और दाहिनी किडनी को काट दिया गया। फिर घाव को मानक टांके से बंद कर दें। प्रत्येक सर्जरी के बाद, सर्जरी के दौरान तरल पदार्थ के नुकसान की भरपाई के लिए 500 एलएल सेलाइन को इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया। उसी समय, चूहे को लगभग 2-3 घंटे तक हीटिंग पैड पर रखा गया जब तक कि उसे आवास पिंजरे में स्थानांतरित करने से पहले पूरी तरह से होश नहीं आ गया। दिखावटी समूह ने किडनी पेडिकल को नहीं दबाया, और बाकी सर्जिकल ऑपरेशन यूआईआरआई समूह के समान ही थे। इस मॉडल के संचालन में 2 साल से अधिक के अनुभव वाले एक ही व्यक्ति द्वारा सभी सर्जिकल ऑपरेशन किए गए थे।

गुर्दा समारोह परख

एससीआर स्तर क्रिएटिनिन किट (जाफ विधि, 100020170, बायोसिनो बायोटेक्नोलॉजी और विज्ञान) द्वारा मापा गया था। बीयूएन स्तर को यूरिया किट (यूरेज़-ग्लूटामेट डिहाइड्रोजनेज विधि, बायोसिनो बायोटेक्नोलॉजी और विज्ञान) द्वारा मापा गया था।

गुर्दे के वजन का आकलन

पेशाब करने के बाद, चूहों के शरीर का वजन एक सटीक इलेक्ट्रॉनिक पैमाने द्वारा मापा गया। ताजी किडनी को पहले से ठंडे खारे पानी से तीन बार धोया गया, फिर किडनी पर मौजूद अतिरिक्त पानी को फिल्टर पेपर से साफ कर दिया गया। किडनी कैप्सूल को बर्फ पर छील दिया गया और किडनी का तुरंत वजन किया गया। एमजी/जी में सही किडनी वजन का मूल्यांकन करने के लिए किडनी के वजन और शरीर के वजन के अनुपात की गणना की गई थी।

हेमेटोक्सिलिन-एओसिन (एचई) धुंधलापन और गुर्दे की चोट स्कोर

तटस्थ फॉर्मेलिन-निर्धारित किडनी ऊतकों को नियमित रूप से निर्जलित किया गया, पैराफिन में एम्बेडेड किया गया, सेक्शन किया गया (3 एलएम), और किडनी के ऊतकों की क्षति का निरीक्षण करने के लिए एचई के साथ दाग दिया गया। प्रत्येक अनुभाग के किडनी कॉर्टेक्स के दस बेतरतीब ढंग से चयनित क्षेत्रों को 4{3}}0 आवर्धन पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ कैप्चर किया गया। दो रोगविज्ञानियों ने ग्लोमेरुलस और गुर्दे की नलिकाओं की चोट का अलग-अलग आकलन किया। निम्नलिखित मानदंडों का उपयोग करके ट्यूबलर चोट को {{20}}-4 के पैमाने पर स्कोर किया गया था [17]: 0, कोई चोट नहीं; 1, गुर्दे के 1-25% क्षेत्र को प्रभावित करता है; 2, किडनी क्षेत्र के 26-50% को प्रभावित करता है; 3, गुर्दे के 51-75% क्षेत्र को प्रभावित करता है; और 4, गुर्दे के 75-100% क्षेत्र को प्रभावित करता है। किडनी ट्यूबलर चोट के क्षेत्र की गणना करके ट्यूबलर चोट की डिग्री का अर्ध-मात्रात्मक मूल्यांकन किया गया था। ग्लोमेरुलर चोट का मूल्यांकन किया गया था और निम्नलिखित मानदंडों का उपयोग करके मेसेंजियल विस्तार या स्केलेरोसिस के प्रतिशत क्षेत्र के अनुसार 0-4 के पैमाने पर स्कोर किया गया था [17]: 0, सामान्य ग्लोमेरुली; 1, 1-25% क्षेत्र घायल; 2, 26-50% क्षेत्र घायल; 3, 51-75% क्षेत्र घायल; और 4, 76-100% क्षेत्र घायल हो गया। अंतिम ग्लोमेरुलर क्षति स्कोर ¼ 0 (% ग्रेड 0 ग्लोमेरुली) þ 1 (% ग्रेड 1 ग्लोमेरुली) þ 2 (% ग्रेड 2 ग्लोमेरुली) þ 3 (% ग्रेड 3 ग्लोमेरुली) þ 4 (% ग्रेड 4 ग्लोमेरुली)। प्रति चूहे 50 से अधिक ग्लोमेरुली बनाए गए।

मैसन का ट्राइक्रोम धुंधलापन

न्यूट्रल फॉर्मेलिन-फिक्स्ड किडनी के ऊतकों को नियमित रूप से निर्जलित किया गया, पैराफिन में एम्बेड किया गया, सेक्शन किया गया (3 एलएम), और किडनी फाइब्रोसिस का निरीक्षण करने के लिए मैसन के ट्राइक्रोम के साथ दाग दिया गया। मैसन के ट्राइक्रोम-सना हुआ स्लाइस में, किडनी कॉर्टेक्स के बीस गैर-अतिव्यापी क्षेत्रों को 200 आवर्धन के तहत कैप्चर किया गया था। स्वचालित माप और विश्लेषण के लिए इमेज-प्रो प्लस इमेज विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था। फ़ाइब्रोटिक क्षेत्र के प्रतिशत का उपयोग किडनी इंटरस्टिशियल फ़ाइब्रोसिस के स्तर का पता लगाने के लिए किया गया था [8]।

आरटी-पीसीआर

ट्राइज़ोल द्वारा प्रत्येक समूह के गुर्दे के ऊतकों से कुल एमआरएनए निकाला गया और इसकी एकाग्रता को मापा गया, फिर इसे सीडीएनए (टाका रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट) में बदल दिया गया। टैक्मैन प्रतिदीप्ति विधि (टीबी ग्रीन प्रीमिक्स एक्स टैक II रियल-टाइम आरटी-पीसीआर) का उपयोग गुर्दे के ऊतकों में फ़ाइब्रोनेक्टिन (एफएन) और कोलेजन I (सीओएल-आई) आरएनए अभिव्यक्तियों को मापने के लिए किया गया था। विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग FN (आगे: {{3}GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 और रिवर्स: {{5}ACTGGATGGGTGGGAAT-30 ), और COL-I (आगे: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{) के लिए किया गया था। {9}} और उलटा: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (सांगॉन बायोटेक कंपनी लिमिटेड, शंघाई, चीन द्वारा प्रदान किया गया)। प्रवर्धन की स्थितियाँ इस प्रकार हैं: 30 एस के लिए 95 सी, 5 एस के लिए 95 सी, 30 एस के लिए 60 सी, 40 चक्र; 10 एस के लिए 95 सी, 5 एस के लिए 65 सी, और 95 सी/5 सी। उत्पादों के प्रवर्धन वक्र और घुलनशीलता वक्र का विश्लेषण करने के बाद, सापेक्ष एमआरएनए स्तर तुलनात्मक सीटी विधि (डीडीसीटी) द्वारा निर्धारित किया गया था। आंतरिक संदर्भ के रूप में 18SrRNA (आगे: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG{{29%) और उल्टा: {{30}AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) के साथ।

पश्चिमी ब्लॉट

रेडियो-इम्यूनो-प्रिसिएशन-परख (आरआईपीए) लिसीज़ बफर का उपयोग गुर्दे के ऊतकों को लीज़ करने के लिए किया गया था और प्रोटीन की एकाग्रता बीसीए विधि द्वारा निर्धारित की गई थी। ग्रेडिएंट जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग 50 एलजी नमूनों से प्रोटीन को अलग करने के लिए किया गया था। फिर प्रोटीन को नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया। 2 घंटे के लिए 5% नॉनफैट दूध के साथ अवरुद्ध करने के बाद, झिल्ली को ए-स्मूथ मसल एक्टिन (ए-एसएमए) (1:1000, नंबर 19245, सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी) के खिलाफ खरगोश एंटी-माउस मोनोक्लो नाल एंटीबॉडी के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉट किया गया। ), क्रमशः FN (1:1000, No.ab2413, ABCam), या COL-I (1:1000, No.72026, सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी)। अगले दिन, झिल्लियों को 0.5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर फिर से गर्म किया गया। टीबीएसटी से धोने के बाद, झिल्लियों को 2 घंटे के लिए एचआरपी संयुग्मित एफ़िनीप्योर गोट एंटी-खरगोश आईजीजी (एच þ एल) (1:1000, नंबर बीए1054, बॉस्टर बायोलॉजिकल टेक्नोलॉजी) के साथ इनक्यूबेट किया गया। टीबीएसटी से दोबारा धोने के बाद, इम्युनोब्लॉट्स को देखने के लिए उन्हें अल्ट्रा-हाई-सेंसिटिविटी ईसीएल केमिलुमिनसेंस अभिकर्मक से रंग दिया गया। बी-एक्टिन को आंतरिक संदर्भ के समान झिल्ली पर मापा गया था। लक्ष्य प्रोटीन बनाम बी-एक्टिन की सापेक्ष अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करके प्रोटीन अभिव्यक्ति निर्धारित की गई थी।

डेटा और सांख्यिकीय विश्लेषण

जांचे गए सभी डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया गया है। दोनों समूहों के बीच तुलना एक स्वतंत्र टी-परीक्षण द्वारा की गई। जब डेटा वितरण सामान्य होता है, और विचरण सजातीय होता है, तो एकाधिक समूहों के बीच तुलना को एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा एक्सेस किया जाता है, जब विचरण विषम होता है, तो सांख्यिकीय महत्व का आकलन करने के लिए वेल्च एनोवा का उपयोग किया जाता है, इसके बाद कई तुलनाओं के लिए टुकी का पोस्ट हॉक परीक्षण किया जाता है। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म 8.0 सॉफ्टवेयर द्वारा आयोजित किए गए थे। p < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।

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