इन विट्रो में एक संयंत्र सहायक के रूप में सिस्टैंच डेजर्टिकोला से पानी निकालने योग्य पॉलीसेकेराइड की इम्यूनोस्टिम्युलेटरी गतिविधि

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एलियन झांग, ज़िमेई यांग, क्वानक्सियाओ ली, यू यांग, गान झाओ, बिन वांग, दाओचेंग वू

1 झिंजियांग की लैब ऑफ बायोलॉजिकल रिसोर्सेज एंड जेनेटिक इंजीनियरिंग, कॉलेज ऑफ लाइफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी, झिंजियांग यूनिवर्सिटी, उरुमकी, झिंजियांग, चीन,

मेडिकल मॉलिक्यूलर वायरोलॉजी की 2 प्रमुख लैब, स्कूल ऑफ बेसिक मेडिकल साइंस, शंघाई मेडिकल कॉलेज, फुडन यूनिवर्सिटी, शंघाई, चीन,

3 कॉलेज ऑफ लाइफसाइंस एंड टेक्नोलॉजी, शीआन जियाओतोंग विश्वविद्यालय, जियान, शांक्सी, चीन

सार

आधुनिक टीकों में एक सुरक्षित और प्रभावी टीका सहायक महत्वपूर्ण है। विभिन्न चीनीहर्बल पॉलीसेकेराइड्सप्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय कर सकता है।सिस्टांचे डेजर्टिकोला(सीडी) एक पारंपरिक चीनी जड़ी बूटी और एक सहायक उम्मीदवार है। यहाँ, हमने पुष्टि की है किपानी निकालने योग्य पॉलीसेकेराइड्ससीडी (डब्ल्यूपीसीडी) इन विट्रो और विवो में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को संशोधित कर सकता है। एक खुराक पर निर्भर तरीके से, डब्ल्यूपीसीडी ने एमएचसी के अभिव्यक्ति स्तरों को विनियमित करके murine मज्जा-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं (बीएम-डीसी) की परिपक्वता और कार्य को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ावा दिया। -II, CD86, CD80, और CD40, एलोजेनिक टी सेल प्रसार, और IL-12 और TNF- की पैदावार टोल-जैसे रिसेप्टर4 (TLR4) के माध्यम से, जैसा कि इन विट्रो प्रयोगों द्वारा दर्शाया गया है। इसके अलावा, चूहों में इसकी इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गतिविधि भी देखी गई। WPCD ने IgG, IgG1, और IgG2a के टाइटर्स में प्रभावी रूप से सुधार किया और T और B कोशिकाओं के प्रसार, CD4 प्लस T कोशिकाओं में IFN- और IL -4 के उत्पादन और CD8 में IFN- के अभिव्यक्ति स्तर को स्पष्ट रूप से बढ़ाया। प्लस टी कोशिकाएं फिटकरी से बेहतर हैं। इसके अलावा, WPCD तिल्ली में DC पर CD40 और CD80 के अभिव्यक्ति स्तरों को स्पष्ट रूप से विनियमित कर सकता है और Treg आवृत्ति को डाउन-रेगुलेट कर सकता है। अध्ययन से पता चलता है कि सिस्टैंच डेजर्टिकोला के पॉलीसेकेराइड टीएलआर4 सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से डीसी को सक्रिय करके ह्यूमर इम्युनिटी और सेलुलर इम्युनिटी दोनों को प्राप्त करने के लिए एक सुरक्षित और प्रभावी वैक्सीन सहायक है।

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परिचय

बीमारियों को नियंत्रित करने या रोकने के लिए टीके महत्वपूर्ण हैं। नव निर्मित और वर्तमान विकासशील टीके अत्यधिक शुद्ध पुनः संयोजक हैंएंटीजनउच्च सुरक्षा के साथ, लेकिन शुद्ध एंटीजन संतोषजनक को उत्तेजित नहीं कर सकते हैंरोग प्रतिरोधक क्षमता का पता लगनाक्षीण या निष्क्रिय रोगज़नक़ तैयारियों के साथ तुलना। सहायक की सहायता से, टीके लगातार प्रेरित कर सकते हैंप्रतिरक्षा प्रतिक्रिया[1,2]। नए शक्तिशाली सहायक टीके के विकास और मानव स्वास्थ्य दोनों में व्यापक रूप से चिंतित हैं। आज तक, विभिन्न सहायकों की पहचान की गई है और बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। ये सहायक टीकों को कई लाभों के साथ प्रदान करते हैं, जिसमें एंटीजन की आवश्यक मात्रा को कम करना, सामान्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक प्रतिरक्षणों की संख्या को कम करना, और अधिक तीव्र, व्यापक और मजबूत उत्प्रेरण शामिल है।प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया[3-5]। यद्यपि कई शक्तिशाली सहायक विकसित किए गए हैं, जैसे कि लिपोपॉलीसेकेराइड (LPS) और फ्रायंड का पूर्ण सहायक (FCA), वे अपनी विषाक्तता के कारण व्यापक रूप से लागू नहीं होते हैं। इसलिए, केवल कुछ सहायक, जैसे कि फिटकरी, को नैदानिक ​​उपयोग [6] के लिए लाइसेंस दिया गया है। कुल मिलाकर, संक्रामक और गैर-संक्रामक रोगों के खिलाफ बेहतर रोगनिरोधी और चिकित्सीय टीकों को बढ़ावा देने के लिए अधिक प्रभावी और सुरक्षित सहायक विकसित किए जाने चाहिए।

सहायक के विकास में सुरक्षा एक महत्वपूर्ण विचार कारक है। चीनी जड़ी-बूटियों के घटकों में पोषक तत्व और महत्वपूर्ण सक्रिय कंपोजिट शामिल हैं, जैसे कि फेनोलिक यौगिक और पॉलीसेकेराइड, जो शक्तिशाली इम्युनोस्टिममुलेंट [7–9] के रूप में कार्य कर सकते हैं। उनमें से, पारंपरिक चीनी जड़ी बूटियों से पॉलीसेकेराइड को उनकी प्रतिरक्षात्मक गतिविधियों और कम विषाक्तता के कारण व्यापक रूप से खोजा गया है। उदाहरण के लिए, एफसीए जैसे अन्य सहायक पदार्थों की विषाक्तता के बिना इनुलिन एक प्रतिरक्षा सहायक है। AdvaxTM डेल्टा इनुलिन एडजुवेंट ने भी टीकों की प्रतिरक्षण क्षमता को सफलतापूर्वक बढ़ाया है [10,11]। एस्ट्रैगलस, जिसे चीनी में हुआंगकी और लैटिन में रेडिक्स एस्ट्रागली के नाम से भी जाना जाता है, दुनिया भर में व्यापक रूप से वितरित किया जाता है। पॉलीसेकेराइड इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गतिविधि के लिए जिम्मेदार इसके प्रमुख सक्रिय तत्वों में से एक है। प्रायोगिक अध्ययनों से पता चला है कि एस्ट्रैगलस पॉलीसेकेराइड में इन विट्रो और विवो [12, 13] दोनों में मजबूत इम्युनोमोडायलेटरी प्रभाव था। वैक्सीन सहायक के रूप में लाइसियम बरबरम पॉलीसेकेराइड ने भी अच्छे सुधार और उत्तेजक प्रभाव दिखाए [14, 15]। इन अध्ययनों ने सुझाव दिया कि चीनी हर्बल पॉलीसेकेराइड सहायक विकास के लिए आदर्श उम्मीदवार थे।

सिस्टांचे डेजर्टिकोला वाईसी मा(सीडी, "रू कांग रोंग" चीनी में) एक मूल्यवान पारंपरिक चीनी जड़ी बूटी है और आमतौर पर इसके बेहतर टॉनिक प्रभावों के कारण "रेगिस्तान के जिनसेंग" के रूप में माना जाता है। यह झिंजियांग में शुष्क या अर्ध-शुष्क क्षेत्रों में वितरित किया जाता है। चीन में, इसके सूखे मांसल तने का उपयोग सैकड़ों वर्षों से टॉनिक भोजन के रूप में किया जाता रहा है [16, 17]। कई वर्षों से, उबला हुआ सीडी ओवरस्ट्रेन-प्रेरित हानि के इलाज के लिए टॉनिक भोजन के रूप में इस्तेमाल किया गया है, यह सुझाव देता है कि यह मौखिक प्रशासन के लिए सुरक्षित है। यह पौधा अपने व्यापक औषधीय कार्यों के कारण व्यापक रूप से चिंतित है। हाल के फाइटोकेमिकल और औषधीय अध्ययनों से पता चला है कि पॉलीसेकेराइड मुख्य जैविक रूप से सक्रिय घटक थे और विभिन्न जैविक प्रभाव थे, जिनमें इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गतिविधि, एंटीऑक्सिडेंट प्रभाव और विरोधी भड़काऊ प्रभाव [18-21] शामिल थे। हालांकि, शिनजियांग में सी. डेजर्टिकोला से पानी निकालने योग्य पॉलीसेकेराइड की प्रतिरक्षा वृद्धि गतिविधि शायद ही कभी रिपोर्ट की गई थी।

यह सर्वविदित है कि डीसी महत्वपूर्ण एंटीजन-प्रेजेंटिंग सेल (एपीसी) हैं जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू करने और जन्मजात और अनुकूली कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए आवश्यक संकेत प्रदान करते हैं। डीसी द्वारा प्रतिजन तेज में सुधार करने वाले कुछ सहायक सह-उत्तेजक या एमएचसी अणुओं को बढ़ा सकते हैं और प्रतिरक्षा बढ़ा सकते हैं। जब डीसी की परिपक्वता शुरू होती है, तो अधिक सह-उत्तेजक अणु और साइटोकिन्स उत्पन्न होते हैं और डीसी अलग-अलग फेनोटाइप दिखाते हैं [22, 23]।

इस अध्ययन में, हमने सबसे पहले शोषण किया कि क्या WPCD विवो में TLR4 सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से DC के सक्रियण को बढ़ावा दे सकता है। चूंकि डीसी जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के बीच की कड़ी थे, इसलिए हमने अनुमान लगाया कि डब्ल्यूपीसीडी द्वारा प्रेरित डीसी सक्रियण अनुकूली प्रतिरक्षा के परिणाम को प्रभावित करेगा। हमने डब्ल्यूपीसीडी के साथ इलाज किए गए चूहों में ओवलब्यूमिन (ओवीए) के लिए विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच की, जिसमें आईजीजी, आईजीजी 1, और आईजीजी 2 ए उपवर्ग, टी- और बी-प्रसार, और साइटोकाइन का उत्पादन शामिल है। हमने जांच की कि क्या WPCD उपचार से इन चूहों की तिल्ली में DC और Treg कोशिकाओं की गतिविधि बढ़ जाएगी। हमारे निष्कर्षों ने सी। डेजर्टिकोला से प्राकृतिक पॉलीसेकेराइड की संभावित इम्युनोमोडायलेटरी गतिविधि को साबित किया और इसके आवेदन के दायरे का विस्तार किया

सामग्री और तरीके

जानवरों

आठ से दस सप्ताह पुराने C57BL/6, BALB/c, या ICR मादा चूहों को झिंजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी (उरुमकी, झिंजियांग, चीन) के फर्स्टहॉस्पिटल से खरीदा गया था। शिनजियांग यूनिवर्सिटी फॉर एनिमल हेल्थ एंड वेलबीइंग की एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (एसीयूसी) के दिशानिर्देशों के अनुसार चूहों को रोग-मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था। शिनजियांग विश्वविद्यालय के एयूसीसी द्वारा पशु प्रयोग प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई थी।

जलीय अर्क का निष्कर्षण

C. डेजर्टिकोला चीन के झिंजियांग प्रांत का एक पौधा है। कच्चे पॉलीसेकेराइड को पानी की निकासी और इथेनॉल वर्षा के माध्यम से प्राप्त किया गया था। संक्षेप में, 100 ग्राम सूखे सी. डेजर्टिकोला को पीसकर पाउडर बनाया गया और फिर फ़िल्टर किया गया। पाउडर को पेट्रोलियम ईथर के साथ कमरे के तापमान पर बार-बार रिफ्लक्स किया गया और फिर रंगीन सामग्री और लिपिड को हटाने के लिए 1 घंटे के लिए निर्जल इथेनॉल के साथ रिफ्लक्स किया गया। अवशेषों को तीन बार उबलते पानी से निकाला गया और अर्क को एक साथ जमा किया गया, 10 मिनट के लिए 4000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, और 4 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर रिफ्लक्स किया गया। कच्चे पॉलीसेकेराइड को अवक्षेपित करने के लिए घोल में 95 प्रतिशत इथेनॉल की चार गुना मात्रा डाली गई। कच्चे पॉलीसेकेराइड को आसुत जल में फिर से भंग कर दिया गया और प्रोटीन को हटाने के लिए सैवेज अभिकर्मक के साथ इलाज किया गया। अर्क को पीबीएस में भंग कर दिया गया और 0.22-μm फिल्टर के माध्यम से निष्फल कर दिया गया। अंत में, WPCD की कुल चीनी सामग्री 59.58 प्रतिशत थी, जैसा कि फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विश्लेषण [24] द्वारा इंगित किया गया था।

डीसी की पीढ़ी

बीएम-डीसी को पहले वर्णित विधि के अनुसार मामूली संशोधनों के साथ उत्पन्न किया गया था [25]। C57BL/6 चूहों से अस्थि मज्जा DC को RPMI -1640 पूर्ण माध्यम (गिब्को) के साथ 10 प्रतिशत भ्रूण बछड़ा सीरम (Hyclone) के साथ पूरक किया गया। एकत्रित कोशिकाओं को RPMI -1640 माध्यम में 50 μM -mercaptoethanol (सिग्मा, सेंट लुइस, MO) और 20 ng/mL murine GM-CSF (पेप्रोटेक, रॉकी हिल, NY) के साथ फिर से निलंबित कर दिया गया और 37˚ पर इनक्यूबेट किया गया। 5 प्रतिशत CO2 वातावरण में C. संस्कृति माध्यम के आधे हिस्से को हर 1-2 दिनों में जीएम-सीएसएफ युक्त एक नए माध्यम से बदल दिया गया। कोशिकाओं को 6 दिन पर एकत्र किया गया था, 24 घंटे के लिए WPCD, LPS (100 एनजी / एमएल) (सिग्मा, सेंट लुइस, एमओ) की विभिन्न खुराक के साथ इलाज किया गया था, और फिर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किया गया था।

इन विट्रो में डीसी और टी सेल सक्रियण की परिपक्वता का पता लगाना

बीएम-डीसी पर डब्ल्यूपीसीडी के इन विट्रो परिपक्वता प्रभाव का मूल्यांकन एफएसी द्वारा फेनोटाइपिक विश्लेषण परिणामों के आधार पर किया गया था। 7 वें दिन, C57BL/6 से BM-DC को GM-CSF की उपस्थिति में प्रेरित किया गया और फिर WPCD (0.01, 0) के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया।{{11 }}2, 0.05, 0.1, और 0.2 मिलीग्राम/एमएल) 12 घंटे के लिए तीन प्रतियों में। एलपीएस (100 एनजी/एमएल) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। पीबीएस में बीएम-डीसी धोए जाने के बाद और एफसी ब्लॉक (बीडी बायोसाइंसेज, सीए) का उपयोग गैर-प्रतिरक्षी-बाध्यकारी-बाध्यकारी को रोकने के लिए किया गया था, कोशिकाओं को पीबीएस में उपयुक्त एफआईटीसी-, पीई- या एपीसी-संयुग्मित सीडी 40, सीडी 11 सी, सीडी का उपयोग करके दाग दिया गया था। {24}}, सीडी80, और एमएचसी-द्वितीय एंटीबॉडी (बीडी) 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए। दागी गई कोशिकाओं का पता FACs Calibur (BD) द्वारा लगाया गया था। डेटा विश्लेषण फ्लोजो सॉफ्टवेयर (ट्री स्टार) के साथ किया गया था।

इन विट्रो में DCS परिपक्वता प्रयोग में, निर्माता के निर्देशों के अनुसार साइटोकाइन परख किट (बोस्टर, वुहान, चीन) का उपयोग करके IL-12 और TNF- का विश्लेषण करने के लिए सेल कल्चर सुपरनैटेंट्स भी एकत्र किए गए थे। 450 एनएम पर अवशोषण को एलिसा प्लेट रीडर (बायो-रेड, यूएसए) से मापा गया था। नमूनों में साइटोकिन मात्रा की गणना प्रतिगमन रेखीय विधि के अनुसार पुनः संयोजक साइटोकिन्स के मानक घटता के साथ की गई थी।

उनकी एलोजेनिक उत्तेजक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए, मिश्रित लिम्फोसाइट प्रतिक्रिया (एमएलआर) का प्रयोग एमटीटी (सिग्मा, सेंट लुइस, एमओ) परख द्वारा पिछली विधि [26] के अनुसार किया गया था। संक्षेप में, उत्तेजक कोशिकाओं के रूप में उपयोग किए जाने वाले C57BL/6 चूहों से BM-DCs को RPMI -1640 मध्यम प्लस GM-CSF में दिन 7 पर बरामद किया गया और 37˚C पर 12 घंटे के लिए WPCD के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया। कोशिकाओं को 24-वेल प्लेट में चढ़ाने से पहले RPMI -1640 माध्यम में धोया और फिर से निलंबित कर दिया गया था। प्रत्युत्तर कोशिकाओं के रूप में सिंगलप्लेनोसाइट निलंबन को BALB/c चूहों से अलग किया गया था। बीएम-डीसी को 1:5 और 1:10 के अनुपात के अनुसार स्प्लेनोसाइट्स के साथ मिलाया गया। कोशिकाओं को 37˚C पर 5 प्रतिशत CO2 वातावरण में तीन दिनों के लिए तीन प्रतियों में सुसंस्कृत किया गया था। एलपीएस उपचार का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। बाद में अंतिम 4-एच खेती के लिए 20 μL एमटीटी के साथ संस्कृतियों को जोड़ा गया। मापने तरंग दैर्ध्य (490 एनएम) और संदर्भ तरंग दैर्ध्य (650 एनएम) पर अवशोषण को टी सेल प्रसार विश्लेषण के लिए मापा गया था। सभी नमूनों को एक पृष्ठभूमि नियंत्रण के खिलाफ मापा गया था।

इन विट्रो में टीएलआर 4 अवरोधक द्वारा उपचार

BM-DC को 1 घंटे के लिए 5 μM TAK -242 (TLR4, Medchemexpress Inc.USA का अवरोधक) के साथ पूर्व-उपचार किया गया और फिर 12 घंटे के लिए WPCD (100 और 200 ug/mL) की विभिन्न सांद्रता के साथ सह-सुसंस्कृत किया गया। तीन प्रतियों में गोल्गी स्टॉप की उपस्थिति या अनुपस्थिति में। सकारात्मक नियंत्रण में, LPSwas जोड़ा गया। एफएसी द्वारा सतह मार्कर सीडी 86 और सीडी40 और एलिसा द्वारा क्रमशः साइटोकिन्स टीएनएफ-ए और आईएल-12 के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला का पता लगाया गया था।

टीकाकरण प्रोटोकॉल

तीव्र विषाक्तता परीक्षण। इस अध्ययन में मौखिक तीव्र विषाक्तता परीक्षण में, 40 स्वस्थ वयस्क ICR चूहों का उपयोग किया गया था। खुराक से पहले आईसीआर चूहों को उपवास किया गया (भोजन लेकिन रात भर पानी नहीं)। WPCD को प्रत्येक जानवर को 7 दिनों के लिए क्रमशः 0, 50, 500, या 5000 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन की खुराक में मौखिक रूप से प्रशासित किया गया था। नियंत्रण समूह में खारा-उपचारित और फिटकरी-उपचारित चूहों को शामिल किया गया था। जानवरों को लगातार 14 दिनों के भीतर प्रतिदिन देखा गया। मृत्यु दर और नैदानिक ​​​​संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए चूहों को व्यक्तिगत रूप से देखा गया था। इसके अलावा, पूरे प्रयोग के दौरान शरीर के वजन और उनके भोजन और पानी की खपत को मापा गया। 14 वें दिन, प्लीहा या थाइमस इंडेक्स की गणना (तिल्ली या थाइमस वजन / शरीर के वजन) × 10 के रूप में की गई थी।

विवो में डब्ल्यूपीसीडी इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गतिविधि का पता लगाना। यह जांचने के लिए कि क्या डब्ल्यूपीसीडी में इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गतिविधि थी, ओवलब्यूमिन (ओवीए) (सिग्मा) का उपयोग मॉडल एंटीजन के रूप में किया गया था और मादा आईसीआर चूहों को यादृच्छिक रूप से 7 समूहों (नकारात्मक नियंत्रण समूह (0.9 प्रतिशत NaCl और WPCD 400 कुरूप) में विभाजित किया गया था। और सकारात्मक नियंत्रण (OVA के साथ फिटकरी 200 कुरूप))। चूहों को 20, 100, या 400 कुग की खुराक के अनुसार 2- सप्ताह के अंतराल के साथ अकेले 10 कुरूप ओवीए या ओवीए के साथ डब्ल्यूपीसीडी के साथ दो बार सूक्ष्म रूप से प्रशासित किया गया था। आईजीजी टाइटर्स, आईजीजी उपवर्गों, स्प्लेनोसाइट प्रसार और साइटोकाइन, डीसी सतह मार्करों और ट्रेग आवृत्ति का पता लगाने के लिए बूस्टर टीकाकरण के बाद रक्त के नमूने और प्लीहा प्राप्त किए गए थे।

ओवीए-विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाना

पिछली विधि [27] के अनुसार एलिसा द्वारा ओवीए-विशिष्ट आईजीजी टाइटर्स और उपवर्गों की जांच की गई थी। एलिसा प्लेट्स (नननक, थर्मो फिशर साइंटिफिक) को रात भर लेप किया गया और फिर ब्लॉक कर दिया गया। सीरम के नमूनों को IgG अनुमापांक विश्लेषण या IgG1 और IgG2a (दक्षिणी बायोटेक, इंक.) का पता लगाने के लिए क्रमिक रूप से पतला किया गया था। प्लेटों को पीबीएसटी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एचआरपी-संयुग्मित एंटी-माउस आईजीजी, आईजीजी 1, और आईजीजी 2 ए युक्त ऊष्मायन किया गया था। वर्णमिति प्रतिक्रिया को टेट्रामेथिलबेन्ज़िडाइन (टीएमबी) के साथ विकसित किया गया था और फिर 450 एनएम/655 एनएम पर अवशोषण मापा गया और ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) इकाइयों के रूप में व्यक्त किया गया।

स्प्लेनोसाइट प्रसार और साइटोकाइन का पता लगाना

स्प्लेनोसाइट प्रसार एमटीटी परख द्वारा निर्धारित किया गया था। 21 वें दिन पहले टीकाकरण के बाद, एक एकल स्प्लेनोसाइट निलंबन प्राप्त किया गया था। कोशिकाओं को RPMI -1640 माध्यम में 96- अच्छी तरह से प्लेटों में 1 × 106 कोशिकाओं / अच्छी तरह से तीन प्रतियों की सांद्रता के अनुसार सुसंस्कृत किया गया था। संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए ओवीए (अंतिम एकाग्रता 10 कुरूप / एमएल), कोना (अंतिम एकाग्रता 5 कुरूप / एमएल) (सिग्मा, सेंट लुइस, एमओ), और एलपीएस (अंतिम एकाग्रता 100 एनजी / एमएल) से प्रेरित किया गया था। . कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था और एमटीटी (सिग्मा, सेंट लुइस, एमओ) के 20 μL (5 मिलीग्राम / एमएल) को प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया था और एक और 4 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। रंग विकास (सिग्मा) को रोकने के लिए प्रत्येक कुएं में 50 μL DMSO जोड़ने के बाद, एक माइक्रोटिटर प्लेट रीडर (बायो-रेड, सीए, यूएसए) द्वारा प्लेटों को 570 एनएम पर पढ़ा गया। स्प्लेनोसाइट प्रसार को उत्तेजना सूचकांक (एसआई) के रूप में व्यक्त किया गया था, जो एक उत्तेजित कुएं का OD570 एनएम अनुपात एक अस्थिर कुएं का था।

टी कोशिकाओं में आईएल -4 और आईएफएन- की पैदावार को मामूली संशोधनों [27, 28] के साथ प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार इंट्रासेल्युलर साइटोकाइन धुंधला द्वारा मापा गया था। पहले टीकाकरण के बाद 21 वें दिन सिंगल स्प्लेनोसाइट सस्पेंशन तैयार किया गया था। लाल रक्त कोशिका लसीका के बाद, स्प्लेनोसाइट (2 × 106 कोशिकाओं / एमएल) को ओवीए (10 कुरूप / एमएल) के साथ 4- एच उत्तेजना के लिए ऊष्मायन किया गया था और गोल्गी स्टॉप (बीडी) को 12 एच ऊष्मायन, पीएमए के रूप में जोड़ा गया था। सकारात्मक नियंत्रण। कोशिकाओं को एकत्र किया गया, पीबीएस से धोया गया, सीडी 4- एफआईटीसी / सीडी 8- एफआईटीसी के साथ दाग दिया गया, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार साइटो फिक्स / साइटोपर्म किट (बीडी) के साथ तय और पारगम्य किया गया। इंट्रासेल्युलर साइटोकाइन धुंधला 20 मिनट के लिए 4˚C पर IL-4-PE या IFN- -APC एंटीबॉडी की उपयुक्त एकाग्रता के साथ किया गया था। FACs द्वारा दागी गई कोशिकाओं का पता लगाया गया। फ्लोजो में डेटा विश्लेषण किया गया था।

तिल्ली में डीसी परिपक्वता और Treg कोशिकाओं का आकलन

चूहों में स्प्लेनोसाइट्स से डीसी की परिपक्वता के विश्लेषण के लिए, सीडी 11 सी-पीई, सीडी 40- एफआईटीसी, और सीडी 80- एपीसी एंटीबॉडी के साथ सेल सतह धुंधलापन किया गया था। पहले टीकाकरण के 3 दिन बाद, सिंगल स्प्लेनोसाइट सस्पेंशन (1 × 106 सेल / एमएल) प्राप्त किया गया था और कोशिकाओं को दोहरे धुंधलापन के अधीन किया गया था। फ्लोरोसेंट तीव्रता को FACs Calibur द्वारा मापा गया था और मापा डेटा का विश्लेषण FlowJo द्वारा किया गया था।

यह देखने के लिए कि क्या WPCD CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg कोशिकाओं की आवृत्ति को डाउन-रेगुलेट कर सकता है। दूसरे टीकाकरण के बाद दिन 7 पर सिंगल स्प्लेनोसाइट सस्पेंशन तैयार किया गया था। स्प्लेनोसाइट (2 × 106 कोशिकाओं / एमएल) को सीडी 4- एपीसी एंटीबॉडी के साथ सेल की सतह के धुंधला होने के अधीन किया गया था, इसके बाद उपयुक्त सीडी 25- एफआईटीसी और फॉक्सप 3- पीई एंटीबॉडी के साथ परमाणु साइटोकाइन धुंधला हो गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार माउस रेगुलेटरी टी-सेल स्टेनिंग किट (eBios ciences)। FAC पर CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg कोशिकाओं की आवृत्ति का परीक्षण किया गया। फ्लोजो में डेटा विश्लेषण किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण

कई प्रायोगिक समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण करने के लिए विचरण (ANOVA) परीक्षणों (Tukey's Multiple-Comparison Test) का एकतरफा विश्लेषण किया गया था। सभी मानों को माध्य ± SD के रूप में व्यक्त किया जाता है। पी< 0.05="" is="" believed="" to="" be="" statistically="" significant.="" the="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" prism="" 5.0="">

परिणाम

WPCD ने इन विट्रो में BM-DCs की परिपक्वता और कार्य को बढ़ावा दिया

सह-उत्तेजक अणुओं और साइटोकिन्स [29, 30] के प्रकारों सहित डीसी के सक्रियण द्वारा अनुकूली प्रतिरक्षा निर्धारित की जाती है। प्रारंभ में, हमने जांच की कि क्या डब्ल्यूपीसीडी सह-उत्तेजक अणुओं की अभिव्यक्ति को बढ़ावा दे सकता है। WPCD की विभिन्न खुराकों के अनुसार, C57BL/6 से BM-DCs को प्रशासित किया गया। कोशिकाओं में CD11c, CD86, CD80, CD40 और MHC-II के अभिव्यक्ति स्तरों का विश्लेषण किया गया (चित्र 1)। एसएससी और एफएससी के साथ गेटेड कोशिकाओं ने दिखाया कि डब्ल्यूपीसीडी की विभिन्न खुराक के साथ उपचार ने बीएम-डीसी (डेटा नहीं दिखाया गया) की आकृति विज्ञान को नहीं बदला। सीडी 86, सीडी80, और सीडी40 के अभिव्यक्ति स्तर अनुपचारित समूह की तुलना में खुराक पर निर्भर तरीके से काफी ऊपर-विनियमित थे और डब्ल्यूपीसीडी के 20 कुग/एमएल की खुराक के तहत पठार तक पहुंच गए थे, लेकिन अंतर था LPS समूह (चित्र 1A-1C) के साथ तुलना में महत्वपूर्ण नहीं है। MHC-II का अभिव्यक्ति स्तर 50 ug/mL (चित्र 1D) की खुराक के तहत इसके अधिकतम मूल्य तक बढ़ गया था। सेलुलर सतह मार्करों के विश्लेषण परिणामों ने प्रदर्शित किया कि एलपीएस या डब्ल्यूपीसीडी के साथ इलाज किए गए डीसी ने सीडी 86, सीडी 80, सीडी 40 और एमएचसी-द्वितीय के अभिव्यक्ति स्तर में काफी वृद्धि की और फेनोटाइपिक परिपक्वता को बढ़ावा दिया।

कुछ सहायक डीसी पर सह-उत्तेजक अणुओं को बढ़ा सकते हैं या सीधे साइटोकिन्स के स्राव को प्रेरित कर सकते हैं। IL-12 और TNF- Th1 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय करने के लिए प्रमुख साइटोकिन्स हैं। हमने डब्ल्यूपीसीडी उपचार पर बीएम-डीसी में साइटोकाइन की पैदावार का विश्लेषण किया। BM-DC को 12 घंटे के लिए WPCD की विभिन्न सामग्रियों के साथ इलाज करने के बाद, सतह पर तैरनेवाला एक एलिसा किट के साथ IL -12 और TNF- की सामग्री का पता लगाने के लिए एकत्र किया गया था। डब्ल्यूपीसीडी खुराक पर निर्भर रूप से आईएल -12 (छवि 2 ए) और टीएनएफ- (छवि 2 बी) की प्रस्तुतियों को बढ़ा सकता है। परिणामों ने प्रदर्शित किया कि डब्ल्यूपीसीडी डीसी की कार्यात्मक परिपक्वता को प्रेरित कर सकता है

एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में, डीसी को कार्यात्मक रूप से सक्रिय करना आवश्यक है। फिर, एलोजेनिक टी सेल प्रसार के उच्च स्तर को पूरी तरह से परिपक्व डीसी द्वारा प्रेरित किया गया था। इसलिए, डब्ल्यूपीसीडी के लिए डीसी की कार्यात्मक प्रतिक्रिया की जांच एमएलआर द्वारा की गई थी। एलपीएस के समान डब्ल्यूपीसीडी-प्रेरित डीसी की आवंटन क्षमता को संकेतित अनुपात (छवि 2सी और 2डी) पर खुराक पर निर्भर तरीके से नाटकीय रूप से बढ़ाया गया था। परिणामों ने संकेत दिया कि डब्ल्यूपीसीडी ने एंटीजन प्रस्तुति में सुधार किया और इन विट्रो में एमएलआर द्वारा टी-सेल प्रतिक्रिया को अनुकूलित किया।

WPCD ने TLR4 पाथवे के माध्यम से DC की परिपक्वता को बढ़ावा दिया

उपरोक्त परिणामों से यह अनुमान लगाया जा सकता है कि डब्ल्यूपीसीडी द्वारा सक्रिय बीएम-डीसी ने एलपीएस (एक टीएलआर 4 लिगैंड) के समान डीसी सतह अणु अभिव्यक्तियों का संकेत दिया। इस प्रकार हमने अनुमान लगाया कि BM-DC को WPCD द्वारा TLR4 मार्ग के माध्यम से सक्रिय किया जाता है। बीएम-डीसी के बाद टीएके -242 (टीएलआर4 अवरोधक) के साथ ढोंग किया गया और 12 घंटे के लिए डब्ल्यूपीसीडी और एलपीएस के साथ सह-सुसंस्कृत किया गया, सीडी 40, सीडी 86, टीएनएफ-ए, या आईएल {{12 की अभिव्यक्ति }} FAC या ELISA द्वारा पता लगाया गया था। जैसा कि चित्र 3ए और 3बी में दिखाया गया है, टीएके -242 उपचार के परिणामस्वरूप सीडी40 और सीडी की काफी डाउन-रेगुलेटेड अभिव्यक्तियां हुई हैं 86 एलपीएस या डब्ल्यूपीसीडी से प्रेरित हैं, और आईएल का साइटोकाइन उत्पादन -12 या TNF-a में भी काफी कमी आई (चित्र 3C और 3D)। परिणामों ने संकेत दिया कि डब्ल्यूपीसीडी टीएलआर4 मार्ग के माध्यम से डीसी परिपक्वता को सक्रिय कर सकता है।

WPCD ने हास्य और सेलुलर प्रतिरक्षा को बढ़ाया

तुलना के उद्देश्य से, हमने ओवीए-प्रतिरक्षित चूहों में विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रभाव पर डब्ल्यूपीसीडी के प्रभावों का मूल्यांकन किया। टीकाकरण से पहले और पहले टीकाकरण के बाद 14, 21,35, और 49 दिनों में, एलिसा द्वारा आईजीजी टिटर और आईजीजी उपवर्ग सीरम का पता लगाने के लिए रक्त एकत्र किया गया था। ओवीए के लिए आईजीजी एंटीबॉडी प्रतिक्रिया एक खुराक पर निर्भर तरीके से डब्ल्यूपीसीडी प्रशासन (100 और 400 कुरूप) की खुराक में वृद्धि के साथ बढ़ी (चित्र 4)। इष्टतम सांद्रता WPCD की 100 कुरूप/एमएल थी और 21, 35, और 49 दिनों में अकेले ओवीए की तुलना में आईजीजी प्रतिक्रियाओं में दो गुना वृद्धि हुई (चित्र 4ए)। ओवीए-विशिष्ट IgG1 और IgG2a एंटीबॉडी स्तरों में 20 और 100 कुरूप WPCD प्रशासन में उल्लेखनीय वृद्धि 35 दिन (छवि 4B) पर सीरम में OVA समूह की तुलना में प्राप्त की गई थी। इस बीच, फिटकिरी ने प्रतिरक्षित चूहों में केवल ओवीए-विशिष्ट आईजीजी और आईजीजी1 एंटीबॉडी के अभिव्यक्ति स्तरों को बढ़ावा दिया। अकेले डब्ल्यूपीसीडी ने ओवीए-विशिष्ट एंटीबॉडी को ट्रिगर नहीं किया। उपरोक्त परिणामों ने स्पष्ट रूप से संकेत दिया कि WPCD ने फिटकरी की तुलना में उच्च एंटीबॉडी टाइटर्स और अधिक संतुलित Th1 / Th2 प्रतिक्रियाएं उत्पन्न कीं।

स्प्लेनोसाइट प्रसार सेलुलर प्रतिरक्षा का एक और संकेतक है। ConA टी-कोशिकाओं को उत्तेजित करता है और LPS B-सेल प्रसार को उत्तेजित करता है। पहले टीकाकरण के 21 दिन बाद, एकल स्प्लेनोसाइट निलंबन प्राप्त किया गया और क्रमशः ओवीए (10 कुरूप/एमएल), ओवीए 323-339 (10 कुरूप/एमएल) पेप्टाइड, कोना (5 कुरूप/एमएल) और एलपीएस (5 यूजी/एमएल) 48 घंटे के लिए। तब टी कोशिकाओं के प्रसार को एमटीटी विधि द्वारा मापा गया था। डब्ल्यूपीसीडी ओवीए और डब्ल्यूपीसीडी (छवि 5) से प्रतिरक्षित चूहों में ओवीए-एंटीजन, कॉन ए-माइटोजेन और एलपीएस माइटोजेन-उत्तेजित स्प्लेनोसाइट प्रसार को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ावा दे सकता है और डब्ल्यूपीसीडी की इष्टतम एकाग्रता 100 ug/mL थी। इन आंकड़ों ने संकेत दिया कि ओवीए-प्रतिरक्षित चूहों में एक टीका सहायक के रूप में डब्ल्यूपीसीडी फिटकिरी की तुलना में टी-कोशिकाओं और बी कोशिकाओं की सक्रियता को अधिक प्रभावी ढंग से प्रेरित कर सकता है।

ओवीए टीकों के साथ तैयार किए गए सभी परीक्षण किए गए डब्ल्यूसीपीडी सहायक समान रूप से मजबूत हास्य और सेलुलर प्रतिरक्षा (अंजीर 4 और 5) उत्पन्न करते हैं। इन आंकड़ों के आधार पर, ओवीए-विशिष्ट टी हेल्पर (टीएच) सेल प्रतिक्रिया पर डब्ल्यूपीसीडी प्रभावों का और अधिक मूल्यांकन करने के लिए, हमने फ्लो साइटोमेट्री (छवि 6) द्वारा सीडी 8 प्लस और सीडी 4 प्लस टी कोशिकाओं में साइटोकाइन अभिव्यक्तियों का विश्लेषण किया। पहले टीकाकरण के बाद 21वें दिन, चूहों के एक एकल स्प्लेनोसाइट को अलग किया गया और फिर ओवीए (10 कुरूप/एमएल) के साथ सह-संवर्धित किया गया। 100 कुरूप ओवीए/डब्ल्यूपीसीडी के साथ प्रशासित समूह में सीडी4 प्लस टी कोशिकाओं में आईएल -4 उपज ओवीए/एलम समूह और ओवीए समूह की तुलना में काफी अधिक थी और पीएमए (छवि 6ए) के समान थी। इसके अलावा, सीडी 8 प्लस और सीडी 4 प्लस टी कोशिकाओं में आईएफएन- उपज भी ओवीए / डब्ल्यूपीसीडी (20, 100, और 400 कुरूप) (छवि 6 बी और 6 सी) के साथ प्रशासित चूहों में काफी बढ़ गई थी। एलम एडजुवेंट की तुलना में, डब्ल्यूपीसीडी ने टी कोशिकाओं से आईएल -4 और आईएफएन-स्राव को उत्प्रेरण करने की बेहतर क्षमता दिखाई।

WPCD ने DC की परिपक्वता को प्रेरित किया और विवो में Treg की आवृत्ति कम कर दी

डीसीएस को प्राथमिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू करने में शामिल सबसे शक्तिशाली एपीसी के रूप में मान्यता प्राप्त है। इस प्रकार, पहले टीकाकरण के 3 दिन बाद, हमने चूहों में तिल्ली में DC पर CD40 और CD80 पर WPCD के प्रभावों की भी जांच की (चित्र 7A और 7B)। 100- ug OVA/WPCD समूह के चूहों ने OVA/Alum समूह की तुलना में DC पर CD40 और CD80 के उच्च स्तर का उत्पादन किया। इन आंकड़ों से पता चला कि डब्ल्यूपीसीडी डीसी को सक्रिय कर सकता है और चूहों में डीसी परिपक्वता को प्रेरित कर सकता है। Treg कोशिकाएं सहनशीलता और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को संतुलित कर सकती हैं। आगे की जांच करने के लिए कि WPCD ने प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कैसे संशोधित किया, चूहों में तिल्ली में Treg कोशिकाओं को एक माउस नियामक टी सेल धुंधला किट के साथ दाग दिया गया। पहले टीकाकरण के 21 दिन बाद, कुल CD4 प्लस T कोशिकाओं (चित्र 7C) में CD25 प्लस फॉक्सवे प्लस Treg कोशिकाओं की घटी हुई आवृत्ति देखी गई। OVA और OVA/Alum समूहों की तुलना में, WPCD समूह ने काफी कम Treg आवृत्ति दिखाई।

चूहों में WPCD का सुरक्षा मूल्यांकन

मौखिक तीव्र विषाक्तता का अनुमान लगाने के लिए, हमने तीव्र विषाक्तता परीक्षण किया। 5000 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन के साथ मौखिक रूप से प्रशासित चूहों ने कोई असामान्य व्यवहार या दुष्प्रभाव नहीं दिखाया और विषाक्तता मूल्यांकन परीक्षण में कोई मृत्यु दर नहीं पाई गई। डब्ल्यूपीसीडी की विभिन्न खुराकों के साथ प्रशासित चूहों के विभिन्न समूहों के बीच शरीर के वजन बढ़ने, थाइमस इंडेक्स और प्लीहा इंडेक्स में कोई महत्वपूर्ण अंतर दर्ज नहीं किया गया था और इसमें कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (तालिका 1)। 14 दिनों के बाद कोई मृत्यु दर नहीं देखी गई। इसलिए, WPCD का LD50 मान 5000 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम शरीर के वजन से अधिक था।

यह जांचने के लिए कि क्या डब्ल्यूपीसीडी का चूहों के विकास पर नकारात्मक प्रभाव पड़ा है, चमड़े के नीचे के टीकाकरण से पहले और बाद में, प्रत्येक माउस (तालिका 2) के लिए शरीर का वजन क्रमशः निर्धारित किया गया था। चूहों के बाद के अवलोकन में, साइड इफेक्ट या असामान्य व्यवहार नहीं देखा गया। इसके अलावा, डब्ल्यूपीसीडी के साथ प्रशासित चूहों के शरीर के वजन और खारा समाधान या ओवीए / फिटकरी के साथ प्रशासित चूहों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा। इन अवलोकन परिणामों ने प्रदर्शित किया कि डब्ल्यूपीसीडी का प्रशासन सुरक्षित था।

बहस

टीकों [31] में सहायक घटक प्रमुख घटक हैं। जीनोमिक्स और प्रोटिओमिक्स में प्रगति के कारण, अधिक से अधिक पुनः संयोजक और सिंथेटिक वैक्सीन अणुओं की पहचान की गई है। इसलिए, अधिक सहायक और योगों की आवश्यकता है। कुछ शक्तिशाली सहायक आम तौर पर बढ़ी हुई विषाक्तता से संबंधित होते हैं, उदाहरण के लिए, एफसीए। इसलिए, विभिन्न सहक्रियात्मक घटकों से युक्त एक सुरक्षित सूत्रीकरण खोजना आवश्यक है जो अंततः वांछित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है। चीनी जड़ी बूटियों से पॉलीसेकेराइड गैर-विषैले होते हैं और कोई महत्वपूर्ण दुष्प्रभाव नहीं दिखाते हैं [32,28]। एक निश्चित टीके के लिए एक सुरक्षित सहायक की आवश्यकता होती है।

सिस्टैंच डेजर्टिकोला एक महत्वपूर्ण टॉनिक जड़ी बूटी है और चीन के उत्तर-पश्चिम में शुष्क भूमि और गर्म रेगिस्तान में व्यापक रूप से मौजूद है। Cistanche डेजर्टिकोला इम्यूनोमॉड्यूलेटरी, एंटीऑक्सिडेंट, जीवाणुरोधी और एंटीट्यूमर प्रभाव [20,21] सहित अपनी जैवसक्रियताओं के कारण व्यापक रूप से चिंतित है। सिस्टैंच डेजर्टिकोला के संरचनात्मक लक्षण वर्णन और प्रतिरक्षात्मक गतिविधि में कुछ प्रगति हुई है, जो विकासशील सहायकों के लिए एक अच्छा उम्मीदवार है। हमने प्रयोगात्मक रूप से इन विट्रो और विवो में WPCD के सहायक प्रभावों और तंत्र का मूल्यांकन किया। WPCD के उपचर्म प्रशासन ने सीरम एंटीबॉडी और लिम्फोसाइट प्रसार को बढ़ाकर, साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति को बढ़ाकर, DC परिपक्वता को बढ़ाकर, और CD4 प्लस CD25 प्लस फॉक्सवे प्लस Treg कोशिकाओं की आवृत्ति को कम करके हास्य और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा दिया।

डीसीएस भोली टी कोशिकाओं को भड़काने के लिए प्रमुख एपीसी हैं। डीसी की सक्रियता सहायक के लिए महत्वपूर्ण है। DCS, विशेष रूप से murine मज्जा-व्युत्पन्न DC, का उपयोग अक्सर सहायक और टीकों के मूल्यांकन के लिए किया जाता है। फ्लो साइटोमेट्री उन कोशिकाओं को अलग कर सकती है जो आसपास की कोशिकाओं से एंटीजन को पकड़ने के बाद सक्रिय हुई हैं। एफसीएम विश्लेषण में, उत्तेजित कोशिकाओं के एकत्रीकरण की डिग्री इम्युनोमोड्यूलेटर [3] की सुरक्षा के मूल्यांकन का एक अप्रत्यक्ष संकेतक है। इस प्रकार, इन विट्रो में डीसी में डब्ल्यूपीसीडी सहायक गतिविधि डेटा पशु मॉडल के लिए मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकता है। BM-DC मॉडल के आधार पर, इष्टतम WPCD सांद्रता रेंज में MHC-II, CD86, CD80, और CD40, साइटोकाइन उत्पादन, और एलोजेनिक टी सेल प्रसार के अभिव्यक्ति स्तरों का पता लगाया गया। MHC-II, CD86, CD80, और CD40 के अभिव्यक्ति स्तरों को BM-DC में विनियमित किया गया था और TNF-a और IL-12 की पैदावार को खुराक पर निर्भर तरीके से बढ़ाया गया था। एलोजेनिक टी सेल प्रसार देखा गया। बीएम-डीसी की आकृति विज्ञान नहीं बदला गया था। बीएम-डीसी सक्रियण और इन विट्रो में भड़काऊ साइटोकिन्स के स्राव को प्रेरित करके, डब्ल्यूपीसीडी सहायक एंटीजन की मात्रा और एपीसी की मात्रा में काफी वृद्धि कर सकता है और आईएफएन- को स्रावित करने के लिए टी कोशिकाओं को उत्तेजित कर सकता है, जो इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गतिविधि को बढ़ाने में योगदान देता है।

विभिन्न चीनी शाकाहारी पॉलीसेकेराइड प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करने में सक्षम हैं और टीएलआर 4 मार्ग [33,28] द्वारा डीसी परिपक्वता को उत्तेजित करने के माध्यम से उत्कृष्ट सहायक क्षमता रखते हैं। इस प्रकार, हम मानते हैं कि टीएलआर 4 डब्ल्यूपीसीडी-प्रेरित डीसी परिपक्वता के सिग्नलिंग मार्ग में भाग लेता है। जैसा कि अपेक्षित था, TLR4 अवरोधक उपचारों के परिणामस्वरूप TNF-a और IL-12 में उल्लेखनीय कमी आई। इसके अलावा, TLR4 मार्ग के निषेध ने DC पर CD 40 और CD80 की अभिव्यक्ति में भी बाधा उत्पन्न की, यह दर्शाता है कि DC की परिपक्वता TLR4 पर निर्भर थी। इसलिए, यह स्पष्ट है कि TLR4 WPCD- प्रेरित DCs परिपक्वता में भाग लेता है।

कई प्रयोगों में सहायक और टीका तैयार करने की इष्टतम खुराक अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जाती है। चूहों में WPCD सहायक और OVA प्रतिजनों के खुराक-प्रतिक्रिया संबंध का पता लगाने के लिए, हमने दो बार ICR चूहों को सूक्ष्म रूप से प्रशासित करने के लिए इन विट्रो में BM-DCs से पहले रिपोर्ट किए गए डेटा के आधार पर विभिन्न WPCD खुराक का चयन किया। हमने पाया कि डब्ल्यूपीसीडी ने ओवीए-विशिष्ट एंटीबॉडी की उपज में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि की और आईजीजी1 और आईजीजी2ए स्तरों की वृद्धि के साथ संतुलित Th1/Th2इम्यून प्रतिक्रिया को प्रेरित किया। विशेष रूप से, इष्टतम खुराक में फिटकरी के साथ इलाज किए गए IgG2a स्तर की तुलना में अधिक था। इसलिए, WPCD के परिणामस्वरूप विशिष्ट एंटीबॉडी के उच्च स्तर और कम इंजेक्शन के साथ उच्च प्रभावकारिता हुई।

नए टीकों को मजबूत सेलुलर प्रतिक्रियाओं को शामिल करने की आवश्यकता होती है, जिसमें एंटीबॉडी, टी हेल्पर (टीएच) कोशिकाएं और साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट्स (सीटीएल) शामिल होते हैं। चिकित्सीय टीके का उद्देश्य मजबूत टी-सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करना है। आदर्श सहायक टीके की शक्ति को बढ़ाता है और विषाक्त प्रभाव पैदा किए बिना कोशिका-मध्यस्थ प्रतिरक्षा को बढ़ावा देता है [34]। प्रतिरक्षित चूहों के मॉडल में टिप्पणियों के बीच, डब्ल्यूपीसीडी ने फिटकिरी की तुलना में ओवीए-विशिष्ट और गैर-विशिष्ट स्प्लेनोसाइट प्रसार में वृद्धि की। कुछ सहायक साइटोकिन्स और प्रतिरक्षा प्रणाली को विनियमित करते हैं। उदाहरण के लिए, सैपोनिन एक एंटीजन के लिए कोशिका-मध्यस्थ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उत्तेजित कर सकता है जो सामान्य रूप से केवल एंटीबॉडी को प्रेरित करता है। हमने आईएल -4 और आईएफएन- को संकेतक के रूप में परोक्ष रूप से चूहों में प्रतिरक्षा के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए चुना है। WPCD फिटकरी की तुलना में अधिक IL-4 और IFN- स्राव को प्रेरित कर सकता है। इस प्रकार, डब्ल्यूपीसीडी टीकाकरण के परिणामस्वरूप मजबूत सहायक टी-सेल प्रतिक्रियाएं और साइटोकाइन स्राव देखे गए, यह सुझाव देते हुए कि डब्ल्यूपीसीडी अधिक कुशलता से लिम्फोसाइटों को थ 1- टाइप साइटोकाइन और थ 2- टाइप साइटोकाइन को गुप्त करने के लिए उत्तेजित कर सकता है। फिटकरी।

प्रतिजन प्रस्तुति को प्रभावित करने वाले सहायक जटिल प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं। Treg कोशिकाएं Th1 और Th2 प्रतिक्रियाओं को संशोधित कर सकती हैं [35]। WPCD की एक उपयुक्त खुराक CD80 और CD40 के अभिव्यक्ति स्तर को बढ़ाकर और प्रारंभिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में OVA प्रतिजन प्रस्तुति की क्षमता को बढ़ाकर चूहों में DC की परिपक्वता को बढ़ावा दे सकती है। DCS सक्रियण और Treg आवृत्ति के प्रायोगिक परिणामों ने प्रदर्शित किया कि WPCD ने DC की परिपक्वता को प्रेरित किया और चूहों में तिल्ली में Treg आवृत्ति को कम किया। इन परिणामों ने साबित कर दिया कि डब्ल्यूपीसीडी ने एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं को लक्षित करके और टी-सेल विशिष्ट सक्रियण को बढ़ावा देकर ओवीए टीकों की प्रभावकारिता को बढ़ाया।

सहायक के विकास में, संबंधित संक्रमण के खिलाफ उपयुक्त प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को चुनिंदा रूप से प्रेरित करना मुश्किल है। उपयुक्त सहायक का मनुष्यों या जानवरों पर कम दुष्प्रभाव और विषाक्तता होनी चाहिए। इस प्रकार, तत्काल और दीर्घकालिक दुष्प्रभावों सहित WPCD सुरक्षा पर विचार किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में, हमने डब्ल्यूपीसीडी की तीव्र विषाक्तता और 110 दिनों के लिए चूहों के विकास प्रदर्शन पर डब्ल्यूपीसीडी के नकारात्मक प्रभाव का पता लगाया। WPCD की तीव्र विषाक्तता के परिणामों से पता चला कि शरीर के वजन, थाइमस इंडेक्स या प्लीहा इंडेक्स में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। WPCD का LD50 मान 5000 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम शरीर के वजन से अधिक था। चूहों के प्रायोगिक बाद के अवलोकन के दौरान, चूहों में कोई दुष्प्रभाव या असामान्य व्यवहार नहीं पाया गया। इन परिणामों ने संकेत दिया कि डब्ल्यूपीसीडी सुरक्षित था।

अंत में, इस अध्ययन में, डब्ल्यूपीसीडी, शिनजियांग के सी. डेजर्टिकोला से निकाले गए एक कच्चे पॉलीसेकेराइड ने सहायक के कुछ गुणों का प्रदर्शन किया। उदाहरण के लिए, WPCD ने DC को सक्रिय करके, एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को बढ़ाकर, साइटोकाइन उत्पादन में सुधार करके Th1 और Th2 दोनों प्रतिक्रियाओं को बढ़ाया। इसके अलावा, हमने इन विट्रो में TLR4 मार्ग के माध्यम से DCs की परिपक्वता और कार्य का विश्लेषण करके WPCD प्रभावकारिता के तंत्र का पता लगाया। केवल डब्ल्यूपीसीडी के साथ इलाज किए गए चूहों में, कोई स्पष्ट दुष्प्रभाव नहीं देखा गया था। इसलिए, डब्ल्यूपीसीडी के पास सेलुलर और विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में उच्च इम्युनोस्टिमुलेटरी गतिविधि थी। Adjuvants कई यौगिकों का मिश्रण हैं। कई कच्चे अर्क के मिश्रण में एक पौधे के अर्क की तुलना में अधिक लाभकारी प्रभाव हो सकते हैं। डब्ल्यूपीसीडी अर्क का व्यवस्थित रूप से पता लगाना, उनकी प्रभावकारिता और सुरक्षा का परीक्षण करना और उनके प्रभावों के तंत्र को स्पष्ट करना आवश्यक है।

सहायक सूचना

S1 फ़ाइल। आगमन चेकलिस्ट। (डीओसीएक्स)

स्वीकृतियाँ

प्रयोगों में अच्छे विचार प्रदान करने के लिए बिंग वांग और दाओचेंग वू को विशेष धन्यवाद के साथ।

लेखक का योगदान

संकल्पना: एलियन झांग, बिन वांग, दाओचेंग वू।

डेटा क्यूरेशन: ज़िमेई यांग, यू यांग। औपचारिक विश्लेषण: एलियन झांग, क्वानक्सियाओ ली।

वित्त पोषण अधिग्रहण: एलियन झांग। परियोजना प्रशासन: एलियन झांग।

संसाधन: एलियन झांग, गान झाओ। लेखन - मूल मसौदा: एलियन झांग।

लेखन - समीक्षा और संपादन: एलियन झांग, दाओचेंग वू।