ईमेरिया एसर्वुलिना स्पोरोज़ोइट्स के साथ मैडिन-डार्बी बोवाइन किडनी (एमडीबीके) कोशिकाओं के विट्रो संक्रमण में: वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग करके परजीवी सेलुलर आक्रमण और प्रतिकृति का मात्रात्मक विश्लेषण।

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सार

पोल्ट्री coccidiosis पशुधन उद्योग के लिए काफी आर्थिक नुकसान का कारण बनता है। इस बीमारी के लिए एमेरिया परजीवी जिम्मेदार हैं। वैश्विक स्तर पर, E. acervulina और E. Tenella सबसे आम Eimeria spp में से हैं। संक्रमित ब्रॉयलर। ई. टेनेला आमतौर पर विवो और इन विट्रो अध्ययनों में एक संक्रमण मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है। दूसरी ओर, ई. एसर्वुलिना का इन विट्रो परिस्थितियों में बमुश्किल अध्ययन किया गया है। ई। टेनेला संक्रमण के लिए इन विट्रो मॉडल में एक अच्छी तरह से स्थापित और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मैडिन डार्बी बोवाइन हैगुर्दासेल लाइन (एमडीबीके); हालांकि, ई. एसर्वुलिना के लिए मेजबान कोशिकाओं के रूप में एमडीबीके कोशिकाओं की उपयुक्तता के बारे में बहुत कम जानकारी है। हमने एमडीबीके मोनोलयर्स को ई. एसर्वुलिना स्पोरोज़ोइट्स की दो अलग-अलग खुराक, 5×104 और 2×105 से संक्रमित किया और संक्रमण के बाद 24 और 96 एच पर संस्कृतियों का मूल्यांकन किया। तुलना के लिए, हमने ई. टेनेला स्पोरोज़ोइट्स का उपयोग करके एक समान संक्रमण परख की। परजीवी प्रजनन का आकलन करने के लिए, वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करके ई. एसर्वुलिना एससीएआर मार्कर और ई. टेनेला आईटीएस -1 जीन की डीएनए प्रतियों की संख्या निर्धारित की गई थी। हमने पाया कि ई. टेनेला (पी) की तुलना में ई. एसर्वुलिना प्रतियों की संख्या 24 एचपीआई पर काफी बढ़ गई।<0.05). after="" 96="" hpi,="" e.="" acervulina="" gene="" copies="" were="" considerably="" reduced="" while="" e.="" tenella="" continued="" to="" multiply=""><0.05). our="" results="" show="" that="" mdbk="" monolayers="" could="" be="" used="" for="" in vitro="" research="" aimed="" to="" study="" e.="" acervulina="" sporozoite="" cell="" invasion.="" nevertheless,="" modifications="" of="" in vitro="" cultivation="" appear="" necessary="" to="" allow="" qualitative="" and="" quantitative="" studies="" over="" longer="" periods="" of="" parasite="">

कीवर्ड:कोक्सीडायोसिस; एइमेरिया एसर्वुलिना; ईमेरिया टेनेला; मुर्गी पालन; एमडीबीके कोशिकाएं; गुर्दा

किडनी/गुर्दे की बीमारी में सुधार करेगा सिस्टैन्च

परिचय

कुक्कुट उद्योग में Coccidiosis एक आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण रोग है (ब्लेक एट अल। 2020)। यह रोग ईमेरिया जीनस के एपिकोम्पलेक्सन परजीवी के कारण होता है। संक्रमण स्पोरुलेटेड oocysts के मौखिक अंतर्ग्रहण के माध्यम से होता है। एक बार मेजबान में, oocysts स्पोरोज़ोइट्स छोड़ते हैं जो आंतों के उपकला कोशिकाओं पर आक्रमण करते हैं। मेजबान कोशिकाओं के अंदर, स्पोरोज़ोइट्स अलैंगिक और यौन गुणन चक्रों से गुजरते हैं। इस प्रकार Oocysts उत्पन्न होते हैं और परिणामस्वरूप मल में बह जाते हैं। संक्रमित जानवर वजन घटाने, दस्त, कम अंडा उत्पादन पेश कर सकते हैं, और यह रोग कुछ मामलों में घातक हो सकता है (लोपेज़-ओसोरियो एट अल 2020)। Eimeria की सात प्रजातियां (E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. Mitis, E. necatrix, E. praecox, और E. Tenella) विश्व स्तर पर एवियन कोक्सीडायोसिस के लिए जिम्मेदार हैं। Oocysts आकारिकी, विकृति विज्ञान, और रोग की गंभीरता इन प्रजातियों के बीच सामान्य विभेदक कारक हैं। सभी सात Eimeria, E. acervulina, E. Tenella, और E. maxima ब्रॉयलर फ़ार्म में सबसे अधिक प्रचलित हैं (जॉर्डन एट अल 2018; मोरेस एट अल 2015; ग्योर्के एट अल 2013)। इन 3 प्रजातियों में से, ई. टेनेला को अत्यधिक रोगजनक माना जाता है जबकि ई. एसर्वुलिना और ई. मैक्सिमा मध्यम रोगजनकता दिखाते हैं (लोपेज़-ओसोरियो एट अल। 2020)। रोगजनकता में भिन्नता के बावजूद, मध्यम रोगजनक ईमेरिया एसपीपी। जैसे कि ई. एसर्वुलिना सह-संक्रमण के दौरान रोग की गंभीरता को बढ़ा सकता है (Hiob et al. 2017)। संक्रमण अनुसंधान में पशु मॉडल एक मूल्यवान तत्व हैं। हालांकि, कोकिडियन परजीवियों के इन विट्रो अध्ययन सेलुलर स्तर पर रोग की आधारभूत समझ में योगदान कर सकते हैं (मारुगन-हर्नांडेज़ एट अल। 2020, बुसाइट एट अल। 2018, थबेट एट अल। 2017)। इसके अलावा, वे भविष्य के उपचारों के लिए आधारभूत डेटा प्रदान करने वाला एक उपयोगी उपकरण हो सकते हैं (थाबेट एट अल। 2017; खलाफला एट अल। 2011)। गैर-एवियन सेल लाइनों (मारुगन-हर्नांडेज़ एट अल। 2020; थाबेट एट अल। 2017) में विकसित होने की अपनी क्षमता के कारण, ई। टेनेला को व्यापक रूप से इन विट्रो अनुसंधान (मारुगन-हर्नांडेज़ एट अल। 2020) में एक मॉडल जीव के रूप में उपयोग किया गया है। ; थाबेट एट अल। 2019, 2017; खलाफला एट अल। 2011) और वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर) जैसे आणविक दृष्टिकोणों के उपयोग सहित इन विट्रो और विवो अनुसंधान में ई। टेनेला के लिए काफी प्रयास किए गए हैं। (मारुगन-हर्नांडेज़ एट अल। 2020; थाबेट एट अल। 2019, 2017; हिओब एट अल। 2017; राज एट अल। 2013)। अन्य ईमेरिया प्रजातियों के लिए कम प्रयासों की सूचना दी गई है, जिसमें ई। एसर्वुलिना (नासिरी-बोंटेम्प्स 1976; इटागाकी एट अल। 1974; स्ट्राउट एट अल। 1965; हियोब एट अल 2017) शामिल हैं। इस अध्ययन का उद्देश्य वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करके एमडीबीके सेल मोनोलयर्स में ई. एसर्वुलिना स्पोरोज़ोइट्स के इन विट्रो आक्रमण और प्रतिकृति का मूल्यांकन करना था।

सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे के डायलिसिस में सुधार होगा

सामग्री और तरीके

E. acervulina और E. Tenella oocysts Oocysts का मार्गE. acervulina और E. Tenella को अलग-अलग स्वस्थ 11-दिन पुराने चूजों में Eckert et al से संशोधित विधि के अनुसार पारित किया गया था। (1995)। स्पोरुलेटेड oocysts को एकत्र किया गया और आगे के उपयोग तक 4 प्रतिशत पोटेशियम डाइक्रोमेट समाधान में 4 डिग्री पर संग्रहीत किया गया।oocysts की शुद्धि और उत्तेजनादोनों Eimeria प्रजातियों के Oocysts को 4 प्रतिशत पोटेशियम डाइक्रोमेट समाधान से साफ किया गया था। इसके बाद, रेंटेरिया-सोलिस एट अल द्वारा वर्णित संशोधित विधि के अनुसार स्पोरोज़ोइट्स को उत्तेजित और शुद्ध किया गया। (2020)।कोश पालनमैडिन-डार्बी बोवाइनगुर्दा(MDBK) मोनोलयर्स (DSMZ, ब्राउनश्वेग, जर्मनी) को संक्रमण मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया था। एमडीबीके कोशिकाओं को (2 × 105 कोशिकाओं / कुएं) 24- में अच्छी तरह से प्लेटों में डल्बेको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) के साथ 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 100 आईयू पेनिसिलिन, 100 कुरूप / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया गया था। 2.5 यूजी/एमएल एम्फोटेरिसिन और हवा में 5 प्रतिशत CO2 के वातावरण में 37 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया, जब तक कि वे 80 प्रतिशत संगम तक नहीं पहुंच गए।एमेरिया स्पोरोज़ोइट्स के साथ एमडीबीके कोशिकाओं का संक्रमणकंफ्लुएंट एमडीबीके मोनोलयर्स को ई. एसर्वुलिना स्पोरोज़ोइट्स के साथ टीका लगाया गया था। संक्रमण की विभिन्न बहुलता (एमओआई) दरों (परजीवी: सेल) के आधार पर एक संक्रमण खुराक का चयन करने के लिए प्रारंभिक अध्ययन किया गया: {{0}}.25, 0.5, 1.{ {9}}, 1.5, और 5.0 (ताहा एट अल। अप्रकाशित डेटा)। संक्रमण के लिए दो अलग-अलग खुराकें चुनी गईं: 5×104 (एमओआई: 0.25) या 2×105 स्पोरोज़ोइट्स/वेल (एमओआई: 0.5)। संक्रमण के संपर्क में आने वाली संस्कृतियों को तब डीएमईएम माध्यम में 41 डिग्री पर 2 प्रतिशत एफबीएस, 100 आईयू पेनिसिलिन, 100 कुरूप/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2.5 कुरूप/एमएल एम्फोटेरिसिन के साथ ऊष्मायन किया गया था। दो अलग-अलग ऊष्मायन समय लागू किए गए: संक्रमण के बाद 24 घंटे (एचपीआई) और 96 एचपीआई। ई. टेनेला स्पोरोज़ोइट्स के लिए संक्रमण खुराक और ऊष्मायन समय का एक समान सेट आयोजित किया गया था। सभी प्रयोगों में एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल था जिसमें असंक्रमित एमडीबीके मोनोलयर्स (एनसी-असंक्रमित कोशिकाएं) शामिल थे। सभी assays तीन प्रतियों में किए गए थे। 24 एचपीआई के बाद, कोशिकाओं को बाँझ पीबीएस (पीएच 7.2) के साथ तीन बार धोया गया और 96 एचपीआई समूह में एक नया माध्यम जोड़ा गया जबकि 24 एचपीआई संस्कृतियों को समाप्त कर दिया गया। प्रत्येक ऊष्मायन अवधि (क्रमशः 24 एचपीआई या 96 एचपीआई) के अंत में मोनोलयर्स को ट्रिप्सिनाइज़ किया गया था।

डीएनए निष्कर्षण और वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (RT-qPCR)निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार डीनेसी ब्लड एंड टिश्यू किट (क्यूजेन, हिल्डेन, जर्मनी) का उपयोग करके ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाओं से डीएनए निकाला गया। RT-qPCR को E. acervulina अनुक्रम विशेषता प्रवर्धित क्षेत्र (SCAR) मार्कर Ac-R 01-1731 और राइबोसोमल डीएनए (ITS -1) जीन के E. टेनेला आंतरिक लिखित स्पेसर 1 की प्रतियों की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। परजीवी प्रतिकृति का सहसंबंध। ब्लेक एट अल द्वारा वर्णित विधियों के अनुसार RT-qPCR assays आयोजित किए गए थे। (2008) और कवाहरा एट अल। (2008), क्रमशः, कुछ संशोधनों के साथ। संक्षेप में, एक 20 μl मात्रा प्रतिक्रिया में 10 μl SYBR ग्रीन® मास्टर मिक्स (थर्मो साइंटिफिक, ड्रेइच, जर्मनी), 500 एनएम फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर (तालिका 1), डीएनए टेम्पलेट के 2 μl, और 7 μl न्यूक्लियस-मुक्त पानी शामिल थे। प्रत्येक परख में एक गैर-टेम्पलेट नियंत्रण (NTC) जिसमें न्यूक्लियस-मुक्त पानी होता है। RT qPCR प्रतिक्रियाओं को तीन प्रतियों में प्रवर्धित किया गया और बायो-रेड CFX कनेक्ट रियल-टाइम पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम (बायो-रेड, फेल्डकिर्चेन, जर्मनी) पर आयोजित किया गया। RT-qPCR की स्थिति 5 मिनट के लिए 95 डिग्री और उसके बाद 30 एस के लिए 95 डिग्री के 40 चक्र थे। एनीलिंग 59.8 डिग्री और 20 एस के लिए 58 डिग्री पर किया गया, क्रमशः ई. एसर्वुलिना और ई. टेनेला के लिए, इसके बाद 20 एस का एक विस्तार चक्र 72 डिग्री पर किया गया। एक वियोजन वक्र बनाने के लिए 60 से 95 डिग्री के तापमान रेंज को शामिल करते हुए एक पिघलने वाला वक्र कार्यक्रम लागू किया गया था। अंत में, E. acervulina और E. Tenella मानक वक्र क्रमशः जीनोमिक डीएनए के एक सीरियल कमजोर पड़ने और क्लोन ITS -1 जीन अंशों (थाबेट एट अल। 2015 के अनुसार) के एक सीरियल कमजोर पड़ने से उत्पन्न हुए थे।

सांख्यिकीय विश्लेषण

D'Agostino-Pearson and Shapiro–Wilk normality tests were used to determine the normal distribution of data. A two-way ANOVA test was used for comparison of reproduction considering time points, infection doses, and Eimeria species. Differences were considered statistically significant when p>0.05. सभी सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म 9 सॉफ्टवेयर (सैन डिएगो, सीए, यूएसए) में किए गए थे।

परिणाम और चर्चा

E. acervulina SCAR मार्कर और E. Tenella ITS-1 जीन की जीन प्रतियों को सफलतापूर्वक प्रवर्धित किया गया और प्रत्येक प्रतिक्रिया में RT-qPCR के माध्यम से पता लगाया गया। 24 एचपीआई की ऊष्मायन अवधि के बाद, 5 × 104 स्पोरोज़ोइट्स की एक खुराक के आवेदन के बाद पाई गई प्रतियों की संख्या ई। एसर्वुलिना (1.88 × 105 ± 5.56 × 104) की तुलना में काफी अधिक (पी =0.0002) थी। ई. टेनेला के लिए (3.60×104±5.37×103) (चित्र 1)। इसी तरह, ई. टेनेला (1.27×105±9.32×103 ) 24 एचपीआई की तुलना में ई. एसर्वुलिना (4.82×105±8.50×104) के लिए काफी अधिक (पी{20}}.0002) प्रतियां प्राप्त की गईं। 2×105 स्पोरोज़ोइट्स का अनुप्रयोग (चित्र 1)। इसके विपरीत, 96 एचपीआई 5 × 104 स्पोरोज़ोइट्स के साथ संक्रमण के बाद, ई। एसरवुलिना संक्रमित संस्कृतियों में प्रतियों की संख्या ई की तुलना में काफी (पी=0.0044) कम (6.96 × 103 ± 3.87 × 103) थी। टेनेला (1.24 × 105 ± 1.01 × 105)। इसी तरह, 96 एचपीआई की लंबी अवधि के लिए मोनोलयर्स के साथ इनक्यूबेट किए गए 2 × 105 स्पोरोज़ोइट्स की उच्च खुराक के परिणामस्वरूप ई. एसर्वुलिना प्रतियों (3.35 × 104 ± 1.53 × 104) की कम मात्रा में काफी (पी =0 .0044) हुआ। ई. टेनेला के साथ तुलना (4.98×105±1.28×105) (चित्र 1)।

हमने एमडीबीके मोनोलयर्स पर आक्रमण करने और बाद में 24 और 96 एचपीआई से अधिक गुणा करने के लिए ई. एसर्वुलिना की क्षमता का परीक्षण किया। ई. एसर्वुलिना कल्चर का मूल्यांकन करने के पहले प्रयास परिवर्तनशील परिणामों के साथ किए गए हैं। स्ट्राउट एट अल। (1965) संक्रमित विभिन्न प्राथमिक (चिकन भ्रूणगुर्दाऔर फ़ाइब्रोब्लास्ट) और स्थायी कोशिका रेखाएँ (माउस फ़ाइब्रोब्लास्ट, हेला कोशिकाएँ)। स्ट्राउट एट अल। (1965) ने सभी सेल लाइनों में 24 एचपीआई पर पहचानने योग्य सेल संक्रमण की सूचना दी। दिलचस्प बात यह है कि उन्होंने किसी भी परीक्षण किए गए सेल मॉडल (स्ट्राउट एट अल। 1965) में 24 एचपीआई से अधिक की अवधि में परजीवी वृद्धि नहीं देखी, जो कि जीन की घटती संख्या की हमारी टिप्पणियों के अनुसार है।

प्रतियां 96 एचपीआई। Naciri-Bontemps (1976) ने चिकन में E. acervulina की वृद्धि की सूचना दीगुर्दा93 एचपीआई तक कोशिकाओं और मेरोजोइट्स के टीकाकरण के बाद ओसिस्ट का गठन देखा। हालांकि, हमारे सर्वोत्तम ज्ञान के लिए, बाद के प्रकाशनों द्वारा इन निष्कर्षों की पुष्टि नहीं की गई थी ई। एसर्वुलिना स्पोरोज़ोइट्स (तालेबी 2001) से संक्रमित एमडीबीके मोनोलयर्स पर केवल एक लेख प्रकाशित किया गया है। संक्षेप में, लेखक ने 24 hpi के लिए E. acervulina sporozoites के लिए पहले हाइपरिम्यून चिकन या खरगोश एंटीसेरा के साथ इलाज किए गए MDBK कोशिकाओं को उजागर किया। संस्कृतियों को दाग दिया गया और इंट्रासेल्युलर स्पोरोज़ोइट्स को सूक्ष्म रूप से गिना गया। दुर्भाग्य से, अध्ययन पूरी तरह से एंटीसेरम (तालेबी 2001) द्वारा परजीवी निषेध का प्रतिशत प्रस्तुत करता है, और इस प्रकार, इस मॉडल में संक्रमण की प्रभावकारिता पर निष्कर्ष आसानी से नहीं निकाला जा सकता है। हमारे ज्ञान के लिए, ई. एसर्वुलिना के लिए संक्रमण मॉडल के रूप में एमडीबीके कोशिकाओं का उपयोग करने का कोई और प्रयास नहीं बताया गया है। स्ट्राउट एट अल के निष्कर्षों के अनुसार। (1965), हमने 24 एचपीआई पर पीक परजीवी प्रजनन देखा और बाद में 96 एचपीआई पर कम प्रतिलिपि संख्याओं द्वारा एक अलग कमी का प्रतिनिधित्व किया। स्ट्राउट एट अल। (1965) और नासिरी-बोंटेम्प्स (1976) ने गुणात्मक डेटा की सूचना दी जो केवल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण से उत्पन्न हुए। हालांकि, परजीवी प्रजनन का आकलन करने के लिए RT-qPCR एक अधिक सटीक और संवेदनशील साधन है। वास्तव में, RT-qPCR आजकल आमतौर पर मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए उपयोग किया जाता है और कोकिडिया के प्रजनन का आकलन करने के लिए सफलतापूर्वक स्थापित किया गया है (उदाहरण के लिए, मारुगन-हर्नांडेज़ एट अल। 2020, रेंटेरिया सोलिस एट अल। 2020, थाबेट एट अल। 201 9, बस्सियर एट अल। । 2018, हिओब एट अल। 2017, थाबेट एट अल। 2017, राज एट अल। 2013, खलाफला एट अल। 2011)

हालांकि, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एमडीबीके कोशिकाओं में ई. एसर्वुलिना के इंट्रासेल्युलर विकास के विश्लेषण के लिए मूल्यवान डेटा प्रदान कर सकता है। इसलिए, ई. एसर्वुलिना की इन विट्रो जांच में आगे के लिए इस पर विचार किया जाना चाहिए। सैद्धांतिक रूप से, एवियन सेल लाइन चिकन ईमेरिया के लिए इन विट्रो संक्रमण मॉडल के रूप में बेहतर होगी क्योंकि वे प्राकृतिक मेजबान से उत्पन्न होते हैं और स्तनपायी-व्युत्पन्न सेल संस्कृतियों की तुलना में परजीवी और मेजबान के बीच बातचीत में अधिक प्रतिनिधि अंतर्दृष्टि की अनुमति दे सकते हैं। हालांकि, पोल्ट्री कोक्सीडायोसिस अनुसंधान के लिए उपयुक्त अधिकांश चिकन सेल संस्कृतियां प्राथमिक लाइनें हैं (बुसीरे एट अल। 2018, स्ट्राउट एट अल। 1965; नासिरी-बोंटेम्प्स 1976)। स्थायी संस्कृतियों की तुलना में प्राथमिक कोशिकाओं की कई सीमाएँ होती हैं। प्रयोगशाला प्रयोगों को शुरू करने के लिए ताजा पशु ऊतक की सामान्य आवश्यकता है, जो संदूषण के जोखिम से संबंधित हो सकता है (वर्मा एट अल। 2020)। इसके अलावा, प्राथमिक कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, जानवरों की बलि देनी पड़ती है जो नैतिक विचारों के विपरीत है। अंत में, प्राथमिक सेल लाइनों का मानकीकरण कठिनाइयों से संबंधित हो सकता है।

सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे के संक्रमण में सुधार होगा

इसलिए, एवियन कोकिडिया के इन विट्रो कल्चर पर काम करने वाले अधिकांश शोध समूहों में अमर सेल लाइनों का उपयोग सामान्य अभ्यास है। सामान्य तौर पर, स्तनपायी-व्युत्पन्न स्थायी संस्कृतियों को चुना जाता है क्योंकि वे वाणिज्यिक स्रोतों से आसानी से उपलब्ध हैं और एंटीबॉडी, मार्कर, प्रकाशित प्रोटोकॉल, जीनोमिक अनुक्रम आदि जैसे उपकरण स्थापित किए जाते हैं, जबकि कम सामान्यतः उपयोग किए जाने वाले चिकन सेल लाइनों के मामले में ऐसा नहीं होता है। . एमडीबीके कोशिकाएं एक गोजातीय-व्युत्पन्न स्थायी रेखा हैं जिनका उपयोग विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में किया जाता है। एमडीबीके सेल ई. टेनेला पर इन विट्रो अध्ययन के लिए अच्छी तरह से स्थापित हैं (मारुगन-हर्नांडेज़ एट अल। 2020, रेंटेरिया-सोलिस एट अल। 2020, थाबेट एट अल। 2019, बुसीरे एट अल। 2018, थबेट एट अल। 2017, खलाफला एट। अल। 2011)। मारुगन-हर्नांडेज़ एट अल। (2020), उदाहरण के लिए, एमडीबीके कोशिकाओं में ई. टेनेला के इंट्रासेल्युलर विकास का एक व्यापक विवरण आयोजित किया। इस अध्ययन में, लेखकों ने आरटी-क्यूपीसीआर और रिवर्स-ट्रांसक्रिपटेस रीयल-टाइम पीसीआर सेलुलर डिवीजन और ई. टेनेला के ट्रांसजेनिक उपभेदों के चरण विकास के माध्यम से ट्रैक किया।

हमारा लक्ष्य पीसीआर तकनीक द्वारा एमडीबीके कोशिकाओं में ई. एसर्वुलिना गुणन की मात्रा निर्धारित करना था। हमारे वर्तमान ज्ञान के अनुसार, ऐसा डेटा पहले प्रकाशित नहीं किया गया है। हमारे प्रयोग में रूपात्मक विश्लेषण पर विचार नहीं किया गया। हालांकि, यह बार-बार किया गया है (मारुगन-हर्नांडेज़ एट अल। 2020, थाबेट एट अल। 2017 और राज एट अल। 2013) ने दिखाया है कि जीन कॉपी संख्या में वृद्धि वास्तव में मेरोगनी के दौरान गुणन से संबंधित है। हमारे प्रयोग में दी गई शर्तों के तहत अलैंगिक गुणन के इस चरण से परे विकास की संभावना नहीं है। हमने पाया कि ई. टेनेला की तुलना में, ई. एसर्वुलिना स्पोरोज़ोइट्स कोशिका पर आक्रमण करते हैं और पहले 24 एचपीआई के दौरान उच्च दर से गुणा करते हैं। हालांकि, जीन प्रतियों की संख्या में 96 एचपीआई की काफी गिरावट आई है, जो ई. एसर्वुलिना के लिए परजीवी गुणन की गतिशीलता को दर्शाता है जो ई. टेनेला से स्पष्ट रूप से भिन्न है। इस प्रकार, ऐसा प्रतीत होता है कि विभिन्न ईमेरिया प्रजातियां इन विट्रो संस्कृति में अलग-अलग व्यवहार करती हैं और ई। टेनेला से एकमात्र स्थापित मॉडल जीव के रूप में प्राप्त सामान्य निष्कर्ष सावधानी के साथ तैयार किए जाने चाहिए। इन विट्रो गुणन की गतिशीलता का अधिक विस्तार से मूल्यांकन करने के लिए अधिक समय बिंदुओं को जोड़ना मददगार हो सकता है। इस अवधि के दौरान क्या होता है यह स्पष्ट करने के लिए अतिरिक्त तकनीकों को लागू किया जा सकता है और यदि भविष्य के उपचारों के लिए व्यावहारिक अनुप्रयोग इन परिणामों से प्राप्त हो सकते हैं।

फिर भी, हमने इस सेल लाइन में परजीवी आक्रमण की सफलता दिखाई है। इसलिए, एमडीबीके कोशिकाओं को आगे ई. एसर्वुलिना स्पोरोज़ोइट सेल आक्रमण के लिए संक्रमण मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। साथ ही, RT-qPCR और अन्य संवेदनशील उपकरणों के उपयोग की अनुशंसा की जाती है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि यह कोशिका रेखा ई. टेनेला संक्रमण का भी समर्थन करती है। यह दोनों ईमेरिया प्रजातियों के बीच तुलनात्मक अध्ययन में अनुवाद किया जा सकता है। इसके अलावा विस्तृत मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण एमडीबीके संस्कृति की उपयुक्तता का आकलन करने के लिए किया जाना चाहिए जैसा कि ई। एसर्वुलिना के लिए इन विट्रो मैट्रिक्स और अन्य चिकन ईमेरिया प्रजातियों के विकास के चरणों में किया जाना चाहिए। सहायता; हम पशुपालकों के रूप में उत्कृष्ट सहायता के लिए एम. फ्रित्शे, बी. श्नाइडविंड, और आर. शूमाकर (इंस्टीट्यूट ऑफ़ पैरासिटोलॉजी, यूनिवर्सिटी ऑफ़ लीपज़िग) के भी आभारी हैं। प्रयोगशाला के काम के दौरान बहुमूल्य मदद के लिए आर झांग (पशु और पशु चिकित्सा विज्ञान महाविद्यालय, दक्षिण पश्चिम मिंज़ू विश्वविद्यालय) को भी बहुत धन्यवाद। लेखक पशु परमिट की तैयारी के साथ अपने बहुमूल्य कार्य के लिए आर. श्माश्के (इंस्टीट्यूट ऑफ पैरासिटोलॉजी, यूनिवर्सिटी ऑफ लीपज़िग) को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।