एमटीटी परख के साथ सिस्टांच ट्यूबुलोसा से फेनिलथेनोइड ग्लाइकोसाइड का हस्तक्षेप

1 परिचय

परजीवी पौधासिस्टान्चे टुबुलोसा(श्रेंक) आर. वाइट (ओरोबैंचेसीपरिवार) उत्तरी अफ़्रीकी, अरब और एशियाई देशों में व्यापक रूप से वितरित है [1]।सी. ट्यूबुलोसाऔरसी. डेजर्टीकोलापारंपरिक चीनी चिकित्सा में महत्वपूर्ण हैं, इनका उपयोग नपुंसकता, बांझपन, कटिवात और कोलोनिक जड़ता के कारण होने वाले कब्ज के इलाज के लिए किया जाता है [2]। इसके अलावा, इथेनॉलिक अर्कसी. ट्यूबुलोसाचूहों में सेरेब्रल हाइपोक्सिया के खिलाफ एक महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक प्रभाव दिखाया गया है [3]।

एंडोथेलियल कोशिकाएं हाइपोक्सिक पल्मोनरी हाइपरटेंशन के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। EA.hy926 एंडोथेलियल सेल लाइन प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं के समान ही है। EA.hy926 एंडोथेलियल कोशिकाओं पर C. ट्यूबुलोसा इथेनॉलिक अर्क के एंटी-हाइपोक्सिक प्रभाव के हमारे अध्ययन के दौरान, हमने देखा कि 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-yl)-2,5-डाइफेनिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड (MTT) परख, जिसका उपयोग आमतौर पर साइटोटॉक्सिसिटी और साइटोस्टैटिक गतिविधि के अध्ययनों में सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए किया जाता है, ने उपचार के बाद EA.hy926 सेल व्यवहार्यता में वृद्धि दिखाकर विरोधाभासी परिणाम उत्पन्न किए।

किसी औषधीय एजेंट के संभावित साइटोटॉक्सिक या साइटोप्रोटेक्टिव प्रभावों की पहचान करने के लिए कोशिका व्यवहार्यता का सटीक आकलन आवश्यक है। इसलिए, हमने जांच की कि सी. ट्यूबुलोसा इथेनॉलिक अर्क में मौजूद कौन से घटक एमटीटी परख के साथ देखे गए विरोधाभासी परिणामों के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं। हमने दो मुख्य अलग किएफेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (PhGs)सी. ट्यूबुलोसा इथेनॉलिक अर्क से,इचिनाकोसाइड (जिसे आगे यौगिक 1 कहा जाएगा) और एक्टियोसाइड (जिसे आगे यौगिक 2 कहा जाएगा)हमने विभिन्न तरीकों का उपयोग करके EA.hy926 सेल व्यवहार्यता पर उनके प्रभाव को निर्धारित किया। इसके अलावा, यह स्पष्ट करने के लिए कि यौगिक 1 और 2 का कौन सा प्रतिस्थापन विरोधाभासी परिणामों के लिए जिम्मेदार हो सकता है, हमने उन्हीं तरीकों का उपयोग करके EA.hy926 सेल व्यवहार्यता पर उनके एग्लिकोन, कैफिक एसिड (यौगिक 3 के बाद) और 3,4-डाइहाइड्रॉक्सिलफेनिलएथेनॉल (यौगिक 4 के बाद) का परीक्षण किया।

एपोप्टोसिस को रोकने के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2. परिणाम और चर्चा

2.1.यौगिकों की पहचान

पृथक किये गये दो यौगिकों की संरचनासी. ट्यूबुलोसा इथेनॉलिक अर्कपरमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) और द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण द्वारा पहचान की गई, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। यौगिक 1 की पहचान पहले से रिपोर्ट किए गए एनएमआर (तालिका 1) और एमएस (एम/जेड 785 [एम−एच]−) डेटा [4] के साथ तुलना करके इचिनाकोसाइड के रूप में की गई थी। यौगिक 2 एनएमआर स्पेक्ट्रा यौगिक 1 के समान ही थे, सिवाय -डी-ग्लूकोपाइरानोसिल समूह (तालिका 1) की अनुपस्थिति के। यौगिक 2 (एम/जेड 623 [एम−एच]−) की पहचान इस प्रकार की गई थीएक्टियोसाइड[5] महत्वपूर्ण बात यह है कि दोनों यौगिकों में एक ही एग्लिकोन होता है, जिसमें कैफिक एसिड (यौगिक 3) और 3,4-डाइहाइड्रॉक्सिलफेनिलएथेनॉल (यौगिक 4) शामिल हैं।

2.2. कोशिका व्यवहार्यता परख

EA.hy926 कोशिका व्यवहार्यता पर यौगिक 1–4 के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए MTT और CCK{{0}} परख का उपयोग किया गया। MTT परख से पता चला कि EA.hy926 कोशिकाओं की व्यवहार्यता 25 और 50 μM यौगिक 1, 2, या 3 (यौगिक 1 के लिए 166.3% और 174.1%, यौगिक 2 के लिए 205.8% और 224.3%, और यौगिक 3 के लिए क्रमशः 164.8% और 189.6%; p < 0.05) के साथ उपचार के बाद काफी बढ़ गई, जब नियंत्रण कोशिकाओं से तुलना की गई (चित्र 2A)। इसके अलावा, कोशिकाओं के रूपात्मक निरीक्षण ने निर्धारित किया कि 50 μM यौगिक 1, 2, या 3 के साथ उपचार से बैंगनी फॉर्मेज़ान क्रिस्टल का निर्माण बढ़ गया इसके विपरीत, CCK-8 परख ने सुझाया कि 12.5, 25, और 50 μM यौगिक 1, 2, या 3 (यौगिक 1 के लिए 75.5%, 45.1%, और 43.7%, यौगिक 2 के लिए 85.5%, 51.8%, और 34.3%, और यौगिक 3 के लिए क्रमशः 64.5%, 48.2%, और 36.4%; p < 0.05) के उपचार के बाद नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में कोशिका व्यवहार्यता में उल्लेखनीय कमी आई (चित्र 2B)। यौगिक 4 ने MTT या CCK-8 परख में कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं किया। दो परखों से प्राप्त परिणामों के बीच विसंगति यह सुझाव देती है कि दो में से एक परख EA.hy926 कोशिका व्यवहार्यता पर यौगिक 1 और 2 के प्रभावों को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं कर सकती है।

2.3. होचस्ट द्वारा एपोप्टोसिस मूल्यांकन

होचस्ट 33342 का धुंधलापन एक कोशिका-पारगम्य डीएनए धुंधलापन है जो पराबैंगनी प्रकाश द्वारा उत्तेजित होता है और 460 से 490 एनएम पर नीला प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करता है। एपोप्टोटिक कोशिकाओं के संघनित क्रोमेटिन सामान्य कोशिकाओं के क्रोमेटिन की तुलना में अधिक चमकीले रंग के होते हैं [6]। जबकि नियंत्रण कोशिकाओं ने समान रूप से फैले हुए क्रोमेटिन, सामान्य अंगक और अक्षुण्ण कोशिका झिल्ली का प्रदर्शन किया, 48 घंटे के लिए 50 μM यौगिक 1, 2, या 3 के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं ने एपोप्टोटिक कोशिकाओं का विशिष्ट धुंधलापन दिखाया (चित्र 4A)। इसके विपरीत, यौगिक 4 के 50 μM के संपर्क में आने से नियंत्रण उपचार की तुलना में एपोप्टोटिक नाभिक की संख्या में वृद्धि नहीं हुई।

2.4. एपोप्टोटिक कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण

एनेक्सिन वी-एफआईटीसी/पीआई डबल-स्टेनिंग परख एनेक्सिन वी-एफआईटीसी के फॉस्फेटिडिलसेरिन से उच्च-आत्मीयता बंधन द्वारा एपोप्टोटिक कोशिकाओं की पहचान करता है, जो एपोप्टोसिस से गुजरने वाली कोशिकाओं में बाह्य रूप से प्रकट होता है [7]। इस परख में, व्यवहार्य कोशिकाएँ एनेक्सिन वी या पीआई से नहीं बंधती हैं और इसलिए वे दागदार नहीं होती हैं (निचला बायाँ चतुर्थांश), प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाएँ एनेक्सिन वी-एफआईटीसी (निचला दायाँ चतुर्थांश) के बंधन द्वारा हरे रंग की हो जाती हैं, और देर से एपोप्टोटिक कोशिकाएँ एनेक्सिन वी-एफआईटीसी के फॉस्फेटिडिलसेरिन और पीआई के नेक्रोटिक कोशिकाओं से बंधन द्वारा क्रमशः हरे और लाल रंग की हो जाती हैं (ऊपरी दायाँ चतुर्थांश)। जैसा कि चित्र 4B में दिखाया गया है, 50 μM यौगिक 1, 2, या 3 के साथ 48 घंटे तक इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं में एपोप्टोटिक कोशिकाओं का प्रतिशत 3.74% (नियंत्रण कोशिकाओं) से बढ़कर क्रमशः 10.32%, 12.95% और 11.30% हो गया। नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में, यौगिक 4 ने एपोप्टोटिक EA.hy926 कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि नहीं की।

CCK-8 परख और होचस्ट 33342 स्टेनिंग द्वारा प्राप्त परिणामों के अनुरूप, फ्लो साइटोमेट्री परख ने दिखाया कि यौगिक 1, 2 और 3 ने EA.hy926 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित किया। कुल मिलाकर, ये अवलोकन बताते हैं कि यौगिक 1-3 के साथ उपचार के बाद MTT परख के साथ देखी गई EA.hy926 कोशिका व्यवहार्यता में वृद्धि एक गलत-सकारात्मक परिणाम का प्रतिनिधित्व करती है।

रोग प्रतिरोधक क्षमता बढ़ाने के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.5. चर्चा

1983 में, मॉसमैन ने कोशिका प्रसार और साइटोटॉक्सिसिटी को मापने के लिए एक कलरिमेट्रिक एमटीटी माइक्रोप्लेट परख विकसित की [8]। यह सरल परख, और इसके संशोधन, अब दुनिया भर की कोशिका जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में बड़े पैमाने पर उपयोग किए जाते हैं। स्तनधारी कोशिकाओं में अंशांकन अध्ययनों ने संकेत दिया कि कम किए गए पाइरीडीन न्यूक्लियोटाइड कोफ़ेक्टर, एनएडीएच, अधिकांश एमटीटी कमी के लिए ज़िम्मेदार है। यह पूरे कोशिकाओं का उपयोग करने वाले अध्ययनों द्वारा समर्थित था [9]। इसलिए एमटीटी कमी चयापचय रूप से सक्रिय कोशिकाओं से जुड़ी हुई है और न केवल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के साथ जुड़ी हुई है, बल्कि एंडोसोम/लाइसोसोम कम्पार्टमेंट और प्लाज़्मा झिल्ली सहित साइटोप्लाज्म और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल झिल्लियों के साथ भी जुड़ी हुई है [10]। एमटीटी अणु पर शुद्ध सकारात्मक चार्ज प्लाज्मा झिल्ली क्षमता के माध्यम से इसके सेलुलर अपटेक के लिए प्राथमिक कारक है।

विशेष रूप से, एमटीटी परख कभी-कभी किसी परीक्षित यौगिक के विशिष्ट कोशिकाओं पर वास्तविक प्रभाव को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं कर सकती है। हालांकि, एमटीटी परख में विरोधाभासी परिणाम देने वाले रासायनिक संरचनाओं या समूहों की पहचान नहीं की गई है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एमटीटी परख (-)-एपिगैलोकैटेचिन-3-गैलेट के एंटीप्रोलिफेरेटिव प्रभाव को कम करके आंक सकती है, जो हरी चाय में सबसे प्रचुर मात्रा में पाया जाने वाला पॉलीफेनोल है [11]। ट्यूमर कीमोसेंसिटिविटी का पता लगाने के लिए एमटीटी परख का उपयोग करने वाले अध्ययनों में, एपिरूबिसिन, पैक्लिटैक्सेल, डोसेटेक्सेल और इमैटिनिब मेसिलेट (ग्लीवेक) जैसे कैंसर विरोधी कीमोथेरेप्यूटिक एजेंट ने सेल व्यवहार्यता में वृद्धि दिखाई [12,13]। इसके अलावा, कई अध्ययनों ने बताया है कि कुछ पौधों के अर्क और रेडॉक्स-सक्रिय पॉलीफेनोल एमटीटी परख में हस्तक्षेप कर सकते हैं क्योंकि वे कोशिकाओं की अनुपस्थिति में एमटीटी टेट्राजोलियम नमक को सीधे कम करते हैं [14]।

माइक्रोप्लेट रीडर में स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण से पहले एमटीटी फॉर्मेजान क्रिस्टल को घुलनशील बनाने की आवश्यकता और प्रतिक्रिया की अंतर्निहित अंतबिंदु प्रकृति, एमटीटी परख के उपयोग को कुछ अनुप्रयोगों तक सीमित कर देती है। इससे टेट्राजोलियम एनालॉग्स का विकास हुआ जिसमें फेनिल मोइटीज को नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए सल्फोनेट समूहों से सजाया गया था, जैसे कि 2,3-बिस-(2-मेथॉक्सी-4-नाइट्रो- 5-सल्फोफेनिल)-2एच-टेट्राजोलियम-5-कार्बोक्सानिलाइड (एक्सटीटी), एक नकारात्मक रूप से चार्ज किया गया आंतरिक नमक [15] और 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-इल)-5-(3-कार्बोक्सीमेथॉक्सीफेनिल)-2-(4-सल्फोफेनिल)-2एच-टेट्राजोलियम (एमटीएस), एक कमज़ोर अम्लीय आंतरिक नमक जो एमटीटी से निकटता से संबंधित है [16]। इन संशोधनों के परिणामस्वरूप संस्कृति माध्यम-घुलनशील फॉर्मेज़न उत्पादों का उत्पादन हुआ जिसने परिमाणीकरण से पहले घुलनशीलता चरण की आवश्यकता को समाप्त कर दिया। तदनुसार, चूंकि इन अणुओं पर बढ़े हुए ऋणात्मक आवेश ने कोशिका झिल्लियों के आर-पार जाने की उनकी क्षमता कम कर दी [17], टेट्राज़ोल डाई की कमी को सुविधाजनक बनाने या कमी की दर को बढ़ाने के लिए मध्यवर्ती इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता (आईईए), जैसे कि 1-मेथॉक्सी-5-मिथाइल फेनाज़िन मिथाइल सल्फेट (1-मेथॉक्सी पीएमएस) की आवश्यकता थी।

हाल ही में, जल में घुलनशील टेट्राजोलियम लवणों की एक नई पीढ़ी विकसित की गई है, जिनमें से WST-1 प्रोटोटाइप है [18]। WST-1, एक नकारात्मक रूप से चार्ज किया गया डाइसल्फोनेटेड आंतरिक लवण जिसमें आयोडीन अवशेष होता है, 1-मेथॉक्सी पीएमएस की उपस्थिति में एक्सटीटी और एमटीएस से अधिक स्थिर है, यह अनिवार्य आईईए है। इसने WST-1/1-मेथॉक्सी पीएमएस को एक सुविधाजनक एकल अभिकर्मक कोशिका प्रसार किट के रूप में विपणन किया। WST श्रृंखला में कई अन्य टेट्राजोलियम लवण विकसित किए गए हैं, जिनमें से सबसे उपयोगी शायद WST-8 [19] है। WST-8 में WST-1 के समान सेलुलर कमी गुण प्रतीत होते हैं और इसे CCK-8 परख के रूप में स्वतंत्र रूप से विपणन किया जा रहा है। डब्लूएसटी-8 कोशिका अभेद्य है और इसलिए इसे इंट्रासेल्युलर एनएडीएच से डब्लूएसटी-8 तक इलेक्ट्रॉन परिवहन के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली के पार 1-मेथॉक्सी पीएमएस द्वारा मध्यस्थता के माध्यम से बाह्य रूप से कम किया जाता है। हालाँकि एमटीटी और डब्लूएसटी-8/1-मेथॉक्सी पीएमएस कमी दोनों इंट्रासेल्युलर एनएडीएच द्वारा संचालित होती हैं, एनएडीएच का स्रोत इन दोनों तरीकों के भीतर भिन्न प्रतीत होता है। डब्लूएसटी-8/1-मेथॉक्सी पीएमएस कमी मैलेट/एस्पार्टेट शटल पर अधिक निर्भर करती है जो माइटोकॉन्ड्रियल ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड चक्र-एनएडीएच को एक्स्ट्रामाइटोकॉन्ड्रियल स्पेस से जोड़ती है [20]।

प्रारंभिक प्रयोगों में, हमने पुष्टि की कि यौगिक 1, 2, 3 और 4 सीधे एमटीटी टेट्राजोलियम लवण को कम नहीं कर सकते (दिखाया नहीं गया)। वर्तमान अध्ययन में, निर्माता के प्रोटोकॉल में संकेत के अनुसार, एमटीटी या सीसीके-8 घोल डालने से पहले माइक्रोप्लेट्स को फॉस्फेट-बफर सलाइन (पीबीएस) से सावधानीपूर्वक धोकर अभिकर्मक के साथ यौगिकों का सीधा प्रभाव समाप्त किया गया था। फिर भी, दो तरीकों का उपयोग करके प्राप्त परिणाम अभी भी विरोधाभासी थे (चित्र 2)। जैसी कि उम्मीद थी, यौगिक 1, 2 और 3 के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन ने नियंत्रण समूह (चित्र 3) की तुलना में टेट्राजोलियम लवण को बैंगनी फॉर्मेज़ान में कम करने में वृद्धि की,

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या यौगिक 1, 2, 3 और 4 EA.hy926 कोशिकाओं में अपोप्टोसिस को प्रेरित कर सकते हैं, सेलुलर रूपात्मक परिवर्तन और फॉस्फेटिडिलसेरिन बाह्यकरण का मूल्यांकन किया गया। CCK-8 परख के साथ देखी गई सेलुलर व्यवहार्यता में कमी के अनुरूप, एनेक्सिन V-FITC/PI का उपयोग करके होचस्ट स्टेनिंग और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के परिणामों ने सुझाव दिया कि यौगिक 1, 2 और 3 उपचार के बाद देखी गई वृद्धि अवरोधन, कम से कम आंशिक रूप से, EA.hy926 सेल अपोप्टोसिस के कारण थी। हमारे परिणामों ने इस विचार का भी समर्थन किया कि यौगिक 1 और 2 दोनों में मौजूद कैफ़ेइल समूह MTT परख के साथ प्राप्त विरोधाभासी परिणामों के लिए जिम्मेदार था।

हमारे निष्कर्षों के समान, रोटलरिन, एक शक्तिशाली बड़े चालकता वाले पोटेशियम चैनल ओपनर, ने इन विट्रो में एमटीटी के प्रति प्रतिक्रियाशीलता नहीं दिखाई। हालांकि, इसने कोशिकाओं के अंदर फॉर्मेजन क्रिस्टल के गठन को दृढ़ता से बढ़ाया, एक परिणाम जो रोटलरिन द्वारा एनएफ-κB के निषेध और डीएनए में [3 एच]-थाइमिडीन समावेशन के विश्लेषण द्वारा देखे गए कोशिका प्रसार के साथ स्पष्ट संघर्ष में था [21]। जिस तंत्र से रोटलरिन ने एमटीटी कमी को बढ़ाया, उसका श्रेय इसके माइटोकॉन्ड्रियल अनयुग्मन प्रभाव को दिया गया [22]। रोटलरिन में सिन्नामॉयल एसिड प्रतिस्थापन समूह होता है। सिन्नामॉयल एसिड की तुलना में, यौगिक 3 में दो अतिरिक्त हाइड्रॉक्सिल अवशेष होते हैं इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए यौगिक 1, 2 और एक रासायनिक अयुग्मक, जैसे कि ट्राइफ्लूरोकार्बोनिलसाइनाइड फेनिलहाइड्राजोन (एफसीसीपी) के बीच तुलनात्मक अध्ययन की आवश्यकता है।

 यौन क्रिया में सुधार के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. प्रायोगिक अनुभाग

3.1. अभिकर्मक और रसायन

यौगिक 3 (कैफीक एसिड-पाउडर, शुद्धता=98.6%) चेंग्दू पुश बायो-टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड (चेंग्दू, चीन) से खरीदा गया था। यौगिक 4 (3,4-डाइहाइड्रॉक्सिलफेनिलएथेनॉल-तेल, शुद्धता=98.5%) चेंग्दू मस्ट बायो-टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड (चेंग्दू, चीन) से प्राप्त किया गया था। एमटीटी और डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। सीसीके-8 परख डोजिन प्रयोगशालाओं (कुमामोटो, जापान) से खरीदी गई थी। होचस्ट 33342 और एनेक्सिन वी-एफआईटीसी/पीआई एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट बेयोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी (हैमेन, चीन) से खरीदी गई थी।

3.2. पादप सामग्री

सी. ट्यूबुलोसाचीन के झिंजियांग उइगर स्वायत्त क्षेत्र के युतियान प्रान्त से तने एकत्र किए गए थे। वाउचर नमूनों को थर्ड मिलिट्री मेडिकल यूनिवर्सिटी (चोंग्किंग, चीन) के हाई एल्टीट्यूड मेडिसिन की प्रमुख प्रयोगशाला में जमा किया गया और चेंगदू यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन (चेंगदू, चीन) के यी झांग द्वारा प्रमाणित किया गया।

3.3. पादप सामग्री का निष्कर्षण और पृथक्करण

हवा में सुखाए गए सी. ट्यूबुलोसा (0.6 किग्रा) तने को पाउडर बनाया गया और 50% इथेनॉल के साथ 2 घंटे के लिए 70 डिग्री पर निकाला गया। कम दबाव में विलायक को हटाने के बाद, इथेनॉलिक अर्क (212.5 ग्राम) को भंग कर दिया गया और पानी (2 एल) में निलंबित कर दिया गया और एन-ब्यूटेनॉल (2 एल × 3) के साथ निकाला गया। एन-ब्यूटेनॉल अर्क (110 ग्राम) को एक पॉलियामाइड कॉलम पर क्रोमैटोग्राफ किया गया और इथेनॉल/पानी (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) के साथ निक्षालन करके पांच अंश (ए-ई) बनाए गए। अंश बी (65 ग्राम) को ओडीएस कॉलम पर विभाजित किया गया; इथेनॉल के साथ निक्षालन: पानी (1:9) इथेनॉल/पानी (1:4) के साथ निक्षालन से यौगिक 2 (1 ग्राम) अलग किया गया।

एनएमआर स्पेक्ट्रा को ब्रूकर एवेंस 600 स्पेक्ट्रोमीटर पर CD3OD में टेट्रामेथिलसिलेन (TMS) के साथ आंतरिक मानक के रूप में रिकॉर्ड किया गया। मास स्पेक्ट्रा को बायोटीओएफ-क्यू मास स्पेक्ट्रोमीटर पर किया गया।

3.4. कोशिका संवर्धन

EA.hy926 सेल लाइन्स अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (मानासास, VA, USA) से प्राप्त की गई थीं। कोशिकाओं को RPMI 1640 माध्यम में संवर्धित किया गया, जिसमें 10% (v/v) भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% (v/v) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन को 5% CO2 के साथ 37 डिग्री पर आर्द्र वातावरण में पूरक किया गया।

3.5. कोशिका व्यवहार्यता

एमटीटी और सीसीके{{0}} परख का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया गया। यौगिक 1 और 2, और उनके एग्लिकोन, कैफिक एसिड (3) और 3,4-डाइहाइड्रॉक्सिलफेनिलएथेनॉल (4) को डीएमएसओ में अंतिम डीएमएसओ सांद्रता < 0.1% (v/v) तक कल्चर मीडिया में घोला गया।

EA.hy926 कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट पर 4 × 103 कोशिकाओं/वेल पर बोया गया। 24 घंटे तक इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 6.25–50 μM यौगिक 1, 2, 3, या 4 के साथ उपचारित किया गया। कल्चर माध्यम को हटा दिया गया और कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर सलाइन (PBS) से दो बार धोया गया। स्टॉक MTT समाधान (5 mg·mL−1) के एलिक्वॉट्स (10 μL) को 100 μL माध्यम वाले प्रत्येक वेल में मिलाया गया और 4 घंटे के लिए कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट किया गया। इनक्यूबेशन के बाद, माध्यम को हटा दिया गया और फॉर्मेज़ान क्रिस्टल को घुलनशील बनाने के लिए प्रत्येक वेल में DMSO के 150 μL एलिक्वॉट्स डाले गए। माइक्रोप्लेट रीडर (बायो-टेक सिनर्जी HT, विनोस्की, VT, USA) का उपयोग करके 490 nm पर अवशोषण को मापा गया। सेल व्यवहार्यता को एमटीटी कमी के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था, नियंत्रण कोशिकाओं के अवशोषण को 100% मान दिया गया था। सभी प्रयोग तीन बार किए गए और औसत ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत किए गए।

CCK-8 परख साहित्य के अनुसार थोड़े संशोधनों के साथ की गई [23]। विशेष रूप से, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 6.25-50 μM यौगिक 1, 2, 3, या 4 के साथ उपचारित किया गया और 10 μL CCK-8 घोल और 100 μL कल्चर मीडिया को जोड़ने से पहले दो बार PBS से धोया गया। माइक्रोप्लेट को 2 घंटे के लिए 37 डिग्री पर इनक्यूबेट करने के बाद, माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 450 एनएम पर अवशोषण को मापा गया। सेल व्यवहार्यता को नियंत्रण कोशिकाओं (100%) के सापेक्ष व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था। सभी प्रयोग तीन बार किए गए और औसत ± एसडी के रूप में व्यक्त किए गए।

3.6. होचस्ट 33342 स्टेनिंग द्वारा एपोप्टोसिस मूल्यांकन

होचस्ट 33342 स्टेनिंग द्वारा एपोप्टोटिक रूपात्मक परिवर्तन देखे गए। संक्षेप में, EA.hy926 कोशिकाओं को 48-वेल प्लेट्स (2 × 104 कोशिकाएं/वेल) पर बोया गया और 37 डिग्री पर 48 घंटे के लिए 50 μM यौगिक 1, 2, 3, या 4 के साथ उपचारित किया गया, दो बार PBS से धोया गया, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% (v/v) पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ स्थिर किया गया। PBS से दो बार धोने के बाद, कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए होचस्ट 33342 (10 ug·mL−1) के साथ स्टेन्ड किया गया और दो बार PBS से धोया गया। होचस्ट-स्टेन्ड न्यूक्लिआई को फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप (ओलंपस, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके देखा गया।

3.7. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एपोप्टोसिस विश्लेषण

एपोप्टोटिक कोशिकाओं का पता एनेक्सिन वी-एफआईटीसी/पीआई डबल-स्टेनिंग और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा लगाया गया। संक्षेप में, 50 μM यौगिक 1, 2, 3, या 4 के साथ 48 घंटे तक उपचार करने के बाद, कोशिकाओं को काटा गया और 1 × 105 कोशिकाओं·mL−1 पर PBS में फिर से लटका दिया गया। 25 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 500× g पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, 195 μL एनेक्सिन वी-FITC बाइंडिंग बफर और 5 μL एनेक्सिन वी-FITC मिलाया गया। हल्के भंवर-मिश्रण के बाद, मिश्रण को अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। 25 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 500× g पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, 190 μL FITC-संयुग्मित एनेक्सिन वी बाइंडिंग बफर और 10 μL PI मिलाया गया। सौम्य भंवर-मिश्रण के बाद, नमूनों का विश्लेषण 30 मिनट के भीतर FACSCalibur फ्लो साइटोमीटर (बेकटन डिकिंसन, सैन जोस, CA, USA) का उपयोग करके किया गया।

3.8. सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी प्रायोगिक डेटा को औसत ± एसडी के रूप में व्यक्त किया गया था। प्रायोगिक नमूनों और संबंधित नियंत्रण के बीच अंतर के महत्व का मूल्यांकन एसपीएसएस सॉफ्टवेयर (संस्करण 11.5) का उपयोग करके विचरण के एकतरफा विश्लेषण (एनोवा) द्वारा किया गया था। सांख्यिकीय महत्व को p < 0.05 पर सेट किया गया था।

4 निर्णय

हमारे परिणाम बताते हैं कि एमटीटी परख में देखी गई व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का अधिक अनुमान कुछ यौगिकों की साइटोटॉक्सिसिटी को छिपा सकता है। इसलिए, दवा स्क्रीनिंग प्रक्रियाओं के दौरान, हम भ्रामक परिणाम उत्पन्न करने से बचने के लिए कोशिका व्यवहार्यता (जैसे सीसीके-8 और 3 एच-टीडीआर परख) पर विशिष्ट यौगिक के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

टेस्टोस्टेरोन स्राव को बढ़ावा देने के लिए प्राकृतिक सिस्टेन्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%