भाग 2 इचिनाकोसाइड चूहे सेरेब्रोकोर्टिकल तंत्रिका टर्मिनलों में वोल्टेज-निर्भर सीए 2 प्लस एंट्री और प्रोटीन किनेज सी को दबाकर ग्लूटामेट रिलीज को रोकता है

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3. चर्चा

इस अध्ययन में, इचिनाकोसाइड, एक सक्रिय यौगिक हैहर्बा सिस्टांचे, चूहे सेरेब्रल कॉर्टेक्स तंत्रिका टर्मिनलों में बाधित4-अमीनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज। ग्लूटामेट रिलीज के इचिनाकोसाइड-मध्यस्थता निषेध के लिए संभावित अंतर्निहित तंत्र की जांच और चर्चा यहां की गई है।

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3.1. ग्लूटामेट रिलीज के इचिनाकोसाइड-मध्यस्थता निषेध के अंतर्निहित तंत्र ग्लूटामेट रिलीज

4-aminopyridine द्वारा विकसित दो घटक होते हैं: एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक Ca2 प्लस-निर्भर घटक, जो ग्लूटामेट युक्त अन्तर्ग्रथनी पुटिकाओं के एक्सोसाइटोसिस के माध्यम से उत्पन्न होता है; और एक Ca2 प्लस-स्वतंत्र घटक, जो लंबे समय तक विध्रुवण से उत्पन्न होता है, जिससे ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर की झिल्ली संभावित-मध्यस्थता बाहरी दिशा की ओर स्थिर-स्थिति में बदलाव होता है, इस प्रकार साइटोसोलिक ग्लूटामेट इफ्लक्स [31] को प्रभावित करता है। यहाँ, हमने देखा किइचिनाकोसाइडCa2 प्लस-मुक्त माध्यम (Ca2 प्लस-स्वतंत्र रिलीज) की उपस्थिति में 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज को महत्वपूर्ण रूप से बाधित नहीं किया। इसके अलावा, मनाया गयाइचिनाकोसाइड4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज के मध्यस्थता निषेध को बाफिलोमाइसिन ए1 (जो सिनैप्टिक वेसिकल्स की ग्लूटामेट सामग्री को कम करता है) द्वारा प्रभावी ढंग से रोका गया था, लेकिन डीएल-टीबीओए द्वारा नहीं (जो गैर-चयनात्मक रूप से सभी उत्तेजक अमीनो एसिड ट्रांसपोर्टर उपप्रकारों को रोकता है)। ये परिणाम बताते हैं किइचिनाकोसाइडतंत्रिका टर्मिनल प्लाज्मा झिल्ली ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर के उत्क्रमण के माध्यम से ग्लूटामेट के सीए 2 प्लस-स्वतंत्र साइटोसोलिक प्रवाह को प्रभावित किए बिना ग्लूटामेट रिलीज के सीए 2 प्लस-निर्भर एक्सोसाइटोसिस को प्रभावित करता है। सिनैप्टिक टर्मिनलों में, ना प्लस चैनल अवरोध या के प्लस चैनल सक्रियण झिल्ली उत्तेजना को स्थिर करता है और परिणामस्वरूप विकसित सीए 2 प्लस प्रविष्टि और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज [32,33] को कम करता है। इसलिए, अंतर्निहित संभावित तंत्रइचिनाकोसाइड-मध्यस्थता ग्लूटामेट रिलीज निषेध में सिनैप्टोसोमल उत्तेजना में कमी शामिल है। हालांकि, यह संभावना दो टिप्पणियों के आधार पर अस्थिर है: (1) 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित झिल्ली संभावित विध्रुवण, झिल्ली संभावित संवेदनशील डाई DiSC3(5) के साथ मापा गया था जो इसके अतिरिक्त से अप्रभावित थाइचिनाकोसाइड; और (2) इचिनाकोसाइड ने 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित Ca2 प्लस-स्वतंत्र ग्लूटामेट रिलीज को प्रभावित नहीं किया, रिलीज का एक घटक जो केवल झिल्ली क्षमता पर निर्भर करता है [31]। यदि प्रभाव सिनैप्टोसोमल उत्तेजना दमन के कारण नहीं होता है, तो यह सीएवी 2.2 (एन-टाइप) और सीएवी 2.1 (पी / क्यू-टाइप) सीए 2 प्लस चैनलों की गतिविधि में कमी के माध्यम से प्रकट हो सकता है जो ग्लूटामेट एक्सोसाइटोसिस के साथ मिलकर बनता है। तंत्रिका टर्मिनल [34-36]। फरा-2 का उपयोग करके, हम प्रदर्शित करते हैं किइचिनाकोसाइडCa2 प्लस सांद्रता में 4-अमीनोपाइरीडीन-विकसित वृद्धि को महत्वपूर्ण रूप से कम करता है। इसके अलावा, हमारे डेटा से पता चलता है कि निरोधात्मक प्रभावइचिनाकोसाइडCav2.2 (N-type) और Cav2.1 (P/Q-type) Ca2 के अवरोधक के संपर्क में आने के बाद 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज 42.4 प्रतिशत ˘ 2.3 प्रतिशत से घटकर 12.1 प्रतिशत ˘ 3.9 प्रतिशत हो गया। प्लस चैनल। इसके अलावा, हमने देखा किइचिनाकोसाइडइंट्रासेल्युलर Ca2 प्लस रिलीज इनहिबिटर की उपस्थिति में 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज को महत्वपूर्ण रूप से रोकना जारी रखा। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि सीएवी 2.2 (एन-टाइप) और सीएवी 2.1 (पी / क्यू-टाइप) सीए 2 प्लस चैनल गतिविधि का एक साथ दमन अंतर्निहित संभावित तंत्र हैइचिनाकोसाइड-मध्यस्थता ग्लूटामेट रिलीज निषेध। हालांकि, सीएवी2.2 (एन-टाइप) और सीएवी2.1 (पी/क्यू-टाइप) सीए2 प्लस चैनल गतिविधि के संयुक्त सक्रियण की कार्रवाई को अवरुद्ध नहीं कर सकाइचिनाकोसाइडपूरी तरह। इसलिए, अन्य अज्ञात प्रकार के Ca2 प्लस चैनल या अन्य प्रीसानेप्टिक मार्ग अवरोध में शामिल हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, GABAA रिसेप्टर्स प्रीसानेप्टिक स्तर पर मौजूद हैं, और उनके सक्रियण को Ca2 प्लस इनफ्लो और ग्लूटामेट रिलीज [37] को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। वर्तमान अध्ययन में, GABAA रिसेप्टर विरोधी SR95531 और bicuculline ने ग्लूटामेट रिलीज के इचिनाकोसाइड-मध्यस्थता निषेध को अवरुद्ध नहीं किया, यह सुझाव देते हुए कि GABAA रिसेप्टर्स वोल्टेज-निर्भर Ca2 प्लस चैनल गतिविधि में कमी और ग्लूटामेट रिलीज के बाद के निषेध में शामिल नहीं हैं।

वोल्टेज पर निर्भर Ca2 प्लस चैनलों के माध्यम से Ca2 प्लस प्रवेश, माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज, प्रोटीन किनेज सी, और प्रोटीन किनेज ए सहित तंत्रिका टर्मिनलों में ग्लूटामेट रिलीज से जुड़े कई प्रोटीन किनेसेस को सक्रिय करता है। यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि प्रोटीन किनेज सी अवरोधकों ने कुशलतापूर्वक विरोध कियाइचिनाकोसाइडग्लूटामेट रिलीज का मध्यस्थता निषेध; फिर भी, माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनसे अवरोधक PD98059 या प्रोटीन किनेज A अवरोधक H89 अप्रभावी था। इसके अलावा, कि। जे. मोल. विज्ञान 2016, 17, 1006 8 13 4- अमीनोपाइरीडीन-प्रेरित फॉस्फोराइलेशन ऑफ़ प्रोटीन किनसे सी के साथ प्रीट्रीटमेंट के बाद सिनैप्टोसोम में कमी आईइचिनाकोसाइडग्लूटामेट रिलीज को रोकने के लिए प्रभावी एकाग्रता पर। इसलिए, का सिग्नलिंग मार्गइचिनाकोसाइड-मध्यस्थता ग्लूटामेट रिलीज निषेध में प्रोटीन किनेज सी शामिल हो सकता है। प्रोटीन किनेज सी एक महत्वपूर्ण इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग सिस्टम है जो प्रीसानेप्टिक स्तर पर मौजूद है और न्यूरोट्रांसमीटर एक्सोसाइटोसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका है। उदाहरण के लिए, सिनैप्टिक वेसिकल ट्रैफिकिंग या भर्ती और एक्सोसाइटोसिस में शामिल कई सिनैप्टिक प्रोटीन, जैसे कि मिरिस्टॉयलेटेड एलेनिन-समृद्ध सी किनेज सब्सट्रेट, प्रोटीन किनसे सी [38,39] द्वारा फॉस्फोराइलेट किए जाते हैं। इस फॉस्फोराइलेशन प्रक्रिया को विध्रुवण-उत्तेजित Ca2 प्लस प्रविष्टि द्वारा बढ़ाया जा सकता है, जो ग्लूटामेट रिलीज [40] की सुविधा प्रदान करता है। इसलिए, हम यथोचित अनुमान लगा सकते हैं कि निरोधात्मक प्रभावइचिनाकोसाइडसीए 2 प्लस प्रविष्टि पर यहां देखा गया प्रोटीन किनेज सी गतिविधि को कम कर सकता है और इसके परिणामस्वरूप ग्लूटामेट रिलीज हो सकता है।

3.2. चिकित्सीय प्रभाव

अत्यधिक ग्लूटामेट रिलीज और ग्लूटामेट रिसेप्टर सक्रियण के कारण होने वाली एक रोग प्रक्रिया, एक्साइटोटॉक्सिसिटी, स्ट्रोक, दर्दनाक मस्तिष्क की चोट, पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग [13,41], और चिकित्सीय रणनीतियों जैसे तीव्र और पुरानी मस्तिष्क विकारों में न्यूरोनल मौत का प्रमुख कारण है। ग्लूटामेट रिलीज निषेध को शामिल करना ऐसी बीमारियों के इलाज के लिए न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियों का वादा कर सकता है।इचिनाकोसाइडरक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) में प्रवेश करने की पुष्टि की गई है और न्यूरोटॉक्सिसिटी [8,10-12,42] के विवो मॉडल में विभिन्न में न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव प्रदर्शित करता है। हालांकि इन न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभावों के तंत्र को पूरी तरह से समझा नहीं गया है, कई संभावित तंत्रों की सूचना दी गई है जिनमें भड़काऊ प्रतिक्रिया अवरोध, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन स्थिरीकरण, एंटीऑक्सीडेशन, फ्री रेडिकल मैला ढोना, और न्यूरोट्रॉफिक फ़ंक्शन मिमिकिंग [5,9,12,42] शामिल हैं। वर्तमान अध्ययन में, तंत्रिका टर्मिनलों से ग्लूटामेट रिलीज को कम करने के लिए इचिनाकोसाइड की क्षमता भी आंशिक रूप से इसके न्यूरोप्रोटेक्टिव तंत्र की व्याख्या कर सकती है। हालांकि, क्या यह प्रभाव ग्लूटामेट एक्साइटोटॉक्सिसिटी वारंट से जुड़े मस्तिष्क विकारों में इचिनाकोसाइड की स्पष्ट चिकित्सीय क्षमता में योगदान देता है।

4. सामग्री और तरीके

4.1. रसायन

Fura-2-एसिटॉक्सिमिथाइल एस्टर (Fura-2-AM) और 3',3',3'-dipropylthiadicarbocyanine आयोडाइड[DiSC3(5)] इनविट्रोजन (कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) से खरीदे गए थे। ω-कोनोटॉक्सिन MVIIC, रॉटलरिन,2-[1-(3-डाइमिथाइलैमिनोप्रोपाइल) इंडोल-3-yl]-3-(इंडोल-3-yl) मेनिमाइड ( GF109203X), 5,6,7,13-टेट्राहाइड्रो-13-मिथाइल-5-ऑक्सो-12H-इंडोलो[2,3-a]पाइरोलो[3,{ {27}}सी]कार्बाज़ोल-12-प्रोपेननिट्राइल (गो6976) और एन-[2-(पी ब्रोमोसिनामाइलिनो)एथिल]-5-आइसोक्विनोलिनसल्फ़ोनामाइड (एच89) टोक्रिसबायोसाइंस (ब्रिस्टल, यूके) से खरीदे गए थे। इचिनाकोसाइड, डैंट्रोलिन, डीएल-थ्रेओ-बीटा-बेंजाइल-ऑक्सीस्पार्टेट (डीएल-टीबीओए),7-क्लोरो-5-(2-क्लोरोफेनी)-1,5-डायहाइड्रो -4,1-बेंजोथियाजेपिन-2(3H)-एक (CGP37157), 2-(2-एमिनो-3-मेथॉक्सीफेनिल)-4 एच -1- बेंजोपायरन -4- एक) (पीडी98059), एथिलीन ग्लाइकॉल बीआईएस (-एमिनोइथाइल ईथर)-एन, एन, एन1, एन 1-टेट्राएसेटिक एसिड (ईजीटीए) और अन्य सभी अभिकर्मक खरीदे गए। सिग्मा-एल्ड्रिच कंपनी (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से।

4.2. जानवरों

दो महीने के नर स्प्राग-डावले चूहों का इस्तेमाल किया गया। जानवरों को मानकीकृत पर्यावरणीय परिस्थितियों (22 1 C; 50 प्रतिशत सापेक्ष आर्द्रता; 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र) के तहत रखा गया था और भोजन और पानी तक असीमित पहुंच की अनुमति दी गई थी। जानवरों को कत्ल द्वारा मार दिया गया था और सेरेब्रल कॉर्टेक्स को 4 C पर तेजी से हटा दिया गया था। प्रायोगिक प्रक्रियाओं को फू जेन इंस्टीट्यूशनलएनिमल केयर एंड यूटिलाइजेशन कमेटी (A10259) द्वारा अनुमोदित किया गया था, प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ गाइड के अनुसार। जानवरों की पीड़ा को कम करने और विश्वसनीय परिणाम देने के लिए आवश्यक न्यूनतम संख्या में जानवरों का उपयोग करने के लिए सभी प्रयास किए गए थे।

4.3. सिनैप्टोसोमल तैयारी

सिनैप्टोसोम को चूहों के सेरेब्रल कॉर्टेक्स से असंतत पेरकोल ग्रेडिएंट पर शुद्ध किया गया था जैसा कि पहले [43,44] में वर्णित है। संक्षेप में, ऊतक को 0.32 एम सुक्रोज (पीएच 7.4) युक्त एक माध्यम में समरूप बनाया गया था, समरूप को 1 0 मिनट के लिए 3 000 ˆ जी (5 {{25) पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। }}00 आरपीएम एक जेए 25.5 रोटर में; बेकमैन कल्टर, इंक., मियामी, एफएल, यूएसए) और 4 C, और सतह पर तैरनेवाला 14,500ˆ ग्राम पर 12 मिनट के लिए फिर से सेंट्रीफ्यूज किया गया था ( 11,000 आरपीएम एक जेए 25.5 रोटर में)। गोली को 0.32 एम सुक्रोज (पीएच 7.4) में धीरे से फिर से जोड़ा गया था, और इस सिनैप्टोसोमल सस्पेंशन (2 एमएल) के एक विभाज्य को 0.32 एम सुक्रोज, 1 एमएम ईडीटीए, 0.25 एमएम डीएल-डाइथियोथेरिटोल, और युक्त 3 एमएल पेरकोल असंतत ढाल पर रखा गया था। 3 प्रतिशत, 10 प्रतिशत और 23 प्रतिशत पेरकोल (पीएच 7.4)। 32,500ˆ जी (एक जेए 20.5 रोटर में 16,500 आरपीएम) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सिनैप्टोसम को 10 प्रतिशत और 23 प्रतिशत पेरकोल बैंड के बीच से बरामद किया गया था, और वे 30 एमएल की अंतिम मात्रा में पतला थे। HEPES बफर माध्यम (140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 5 मिमी NaHCO3, 1 मिमी MgCl2¨ 6H2O, 1.2 मिमी Na2HPO4, 10 मिमी ग्लूकोज, और 10 मिमी HEPES (पीएच 7.4))। 10 मिनट के लिए 27, 000 ˆ g (15,000 आरपीएम एक जेए 25.5 में) पर आगे सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सिनैप्टोसोम गोली को 3 एमएल एचईपीईएस बफर माध्यम में फिर से जोड़ा गया, और प्रोटीन सामग्री को ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया। अंत में, 0.5 मिलीग्राम सिनैप्टोसोम सस्पेंशन को 10 मिली HEPES बफर माध्यम में पतला किया गया और 10 मिनट के लिए 3000 g (JA 20.1 रोटर में 5000 rpm) पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला त्याग दिया गया था, और सिनैप्टोसोम युक्त छर्रों को बर्फ पर संग्रहीत किया गया था और 4-6 घंटे के भीतर उपयोग किया गया था।

4.4. ग्लूटामेट रिलीज

ग्लूटामेट रिलीज को ऑनलाइन फ्लोरीमेट्री द्वारा स्वीकार किया गया था जैसा कि पहले बताया गया था [45,46]। सिनैप्टोसोमल छर्रों को HEPES बफर माध्यम (0.5 मिलीग्राम / एमएल) में फिर से जोड़ा गया और प्रीइंक्यूबेशन के दौरान सिनैप्टोसोम से जारी किसी भी मुक्त फैटी एसिड को बांधने के लिए 16 माइक्रोन गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन की उपस्थिति में 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीइंक्यूबेट किया गया। सिनैप्टोसोम के एक 2-एमएल विभाज्य को 2 मिमी एनएडीपी प्लस, ग्लूटामेट डिहाइड्रोजनेज की 50 इकाइयों, और 1.2 मिमी सीएसीएल2 युक्त एक उत्तेजित क्युवेट में स्थानांतरित किया गया था, और एनएडीपीएच के एफएल प्रतिदीप्ति को पर्किन-एल्मर एलएस में मापा गया था {{ 14}} स्पेक्ट्रोफ्लोरिमीटर (पर्किनएल्मर लाइफ एंड एनालिटिकल साइंसेज, वाल्थम, एमए, यूएसए) क्रमशः 340 और 460 एनएम के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर। चूंकि सिनैप्टोसोम विद्युत उत्तेजना के लिए उत्तरदायी नहीं हैं, ग्लूटामेट रिलीज को प्रोत्साहित करने के लिए पोटेशियम चैनल अवरोधक 4-एमिनोपाइरीडीन का उपयोग किया गया था। 4-एमिनोपाइरीडीन झिल्ली क्षमता को अस्थिर कर देता है और माना जाता है कि यह दोहराए जाने वाले सहज ना प्लस चैनल-आश्रित विध्रुवण का कारण बनता है जो सिनैप्टिक टर्मिनल के विवो विध्रुवण में निकटता से होता है जो वोल्टेज-निर्भर सीए 2 प्लस चैनलों और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के सक्रियण की ओर जाता है [47] ]. डेटा 2 एस के अंतराल पर प्राप्त किए गए थे। प्रत्येक प्रयोग के अंत में बहिर्जात ग्लूटामेट (5 एनएमओएल) का एक मानक जोड़ा गया था। मानक जोड़ द्वारा उत्पादित FL प्रतिदीप्ति परिवर्तन के मूल्य का उपयोग सिनैप्टोसोमल प्रोटीन (nmol/mg) के प्रति मिलीग्राम ग्लूटामेट के नैनोमोल्स के रूप में जारी ग्लूटामेट की गणना के लिए किया गया था। पाठ में उद्धृत रिलीज मान विध्रुवण के 5 मिनट (एनमोल/मिलीग्राम/5 मिनट) के बाद स्थिर अवस्था में प्राप्त स्तर हैं। लोटस 1-2-3 स्प्रेडशीट (आईबीएम, व्हाइट प्लेन्स, एनवाई, यूएसए) और माइक्रोकल ओरिजिन (ओरिजिनलैब कॉर्पोरेशन, नॉर्थम्प्टन, एमए, यूएसए) का उपयोग करके संचयी डेटा का विश्लेषण किया गया था।

4.5. प्लाज्मा झिल्ली क्षमता

प्लाज्मा झिल्ली क्षमता एक झिल्ली-संभावित-संवेदनशील डाई, DiSC3(5) [48] के साथ निर्धारित की गई थी। Synaptosomes को HEPES बफर माध्यम में फिर से जोड़ा गया था, और 2 मिलीलीटर aliquots को एक पर्किन-एल्मर LS -55 स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham) में 37 C पर 5 µM DiSC3(5) युक्त एक हलचल वाले क्युवेट में स्थानांतरित किया गया था। एमए, यूएसए)। मिश्रण को 3 मिनट के लिए संतुलित करने की अनुमति देने के बाद, FL प्रतिदीप्ति को क्रमशः 646 और 674 एनएम के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर निर्धारित किया गया था। डेटा 2 एस के अंतराल पर एकत्र किए गए थे। MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) का उपयोग करके संचयी डेटा का विश्लेषण किया गया और FL प्रतिदीप्ति इकाइयों में व्यक्त किया गया।

4.6. साइटोसोलिक सीए 2 प्लस एकाग्रता ([सीए 2 प्लस] सी)

[Ca2 plus ]C को Ca2 प्लस इंडिकेटर फ्यूरा-2 से मापा गया। Synaptosomes (0.5 mg/mL) को HEPES बफर माध्यम में प्रीइंक्यूबेट किया गया जिसमें 5 µM फरा -2 और 0 .1 mM CaCl2, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हलचल परीक्षण में शामिल थे। ट्यूब। फरा -2 लोड होने के बाद, सिनैप्टोसोम को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 3000 g (5000 आरपीएम) पर 30 एस के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। सिनैप्टोसोमल छर्रों को एक HEPES बफर माध्यम में फिर से जोड़ा गया था, और सिनैप्टोसोमल निलंबन को एक थर्मोस्टेट क्युवेट में एक पर्किन-एल्मर एलएस -55 स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर (पर्किनएल्मर लाइफ एंड एनालिटिकल साइंसेज, वॉलथम, एमए, यूएसए) में उभारा गया था। CaCl2 (1 मिमी) को 3 मिनट के बाद जोड़ा गया और अतिरिक्त 10 मिनट के बाद और जोड़ दिए गए। प्रतिदीप्ति डेटा 340 और 380 एनएम (उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 505 एनएम) के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर 2 एस अंतराल पर जमा किए गए थे। [सीए 2 प्लस] सी (एनएम) की गणना अंशांकन प्रक्रियाओं [49] और पहले वर्णित समीकरणों [50] का उपयोग करके की गई थी। MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) का उपयोग करके संचयी डेटा का विश्लेषण किया गया।

4.7. पश्चिमी सोख्ता

Synaptosomes एक lysis बफर (10 मिमी HEPES बफर, पीएच 7.4), 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100, और प्रोटीज अवरोधक मिश्रण में समरूप थे। सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा Lysates को स्पष्ट किया गया था, और प्रोटीन एकाग्रता एक प्रोटीन परख किट (बायो-रेड लेबोरेटरीज, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। प्रोटीन की समान मात्रा को सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) द्वारा अलग किया गया और नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया। झिल्लियों को ट्रिस-बफर खारा के साथ अवरुद्ध किया गया था जिसमें 5 प्रतिशत कम वसा वाला दूध था और उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी (फॉस्फो-प्रोटीन किनसे सी (पैन), 1:30, नोवस बायोलॉजिकल इंक, बेवर्ली, एमए, यूएसए) के साथ रातोंरात ऊष्मायन किया गया था। 4 डिग्री सेल्सियस ट्रिस-बफर खारा में तीन washes के बाद, झिल्ली को तब कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित एंटीबॉडी (1: 3000) के साथ इलाज किया गया था। झिल्लियों को तब ट्रिस-बफर खारा से कम से कम तीन बार धोया गया था और संवर्धित रसायनयुक्त प्रणाली (एमर्शम, बकिंघमशायर, यूके) का उपयोग करके कल्पना की गई थी। लोडिंग नियंत्रण के रूप में पीकेसी का पता लगाने के लिए नमूनों का एक विभाज्य लोड किया गया था और एक एंटी-पीकेसी एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी। अभिव्यक्ति के स्तर या फॉस्फोराइलेशन का मूल्यांकन बैंड घनत्व द्वारा किया गया था, जिसे डेंसिटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया था। सिनजीन सॉफ्टवेयर (सिनॉप्टिक्स, कैम्ब्रिज, यूके) का उपयोग करके बैंड के डेंसिटोमेट्रिक क्वांटिफिकेशन का विश्लेषण किया गया था।

4.8. सांख्यिकीय विश्लेषण

डेटा एकल सिनैप्टोसोमल तैयारी से प्राप्त किए गए थे और एक दूसरे से स्वतंत्र नहीं थे। दवा बनाम नियंत्रण के प्रभाव के महत्व का परीक्षण करने के लिए, दो-पूंछ वाले छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग किया गया था। जब एक अतिरिक्त तुलना की आवश्यकता थी (जैसे कि क्या एक दूसरे उपचार ने इचिनाकोसाइड की कार्रवाई को प्रभावित किया), तो एकतरफा एनोवा और उसके बाद तुकी के परीक्षण का उपयोग किया गया था। विश्लेषण सॉफ्टवेयर SPSS (17.0; SPSS Inc., शिकागो, IL, USA) के माध्यम से पूरा किया गया। डेटा को माध्य SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है; महत्व का मूल्यांकन सभी सांख्यिकीय उपायों के लिए p < 0.05="" पर="" किया="" गया="">

5। निष्कर्ष

यह पहला अध्ययन है जो दर्शाता है किइचिनाकोसाइडसीएवी 2.2 और सीएवी 2.1 चैनलों के माध्यम से सीए 2 प्लस प्रवाह को कम करके चूहे सेरेब्रोकोर्टिकल सिनैप्टोसोम से ग्लूटामेट रिलीज को रोकता है, और यह रिलीज अवरोध कम से कम भाग में प्रोटीन किनेज सी मार्ग के दमन पर निर्भर है। वर्तमान खोज मूल्यवान है क्योंकि यह मस्तिष्क में इचिनाकोसाइड की क्रिया के तंत्र में एक उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।

पावती:इस कार्य को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MOST 103-2320-B-030-001 MY3) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

लेखक योगदान:त्ज़ू यू लिन और सु जेन वांग ने प्रयोगों की कल्पना की और उन्हें डिजाइन किया; चेंग वेई लू ने प्रयोग किए; चेंग वेई लू और शु कुई हुआंग ने डेटा का विश्लेषण किया; सु जेन वांग ने पेपर लिखा था।

हितों का टकराव:लेखक किसी प्रकार के हित संघर्ष की घोषणा नहीं करते।

हितों के टकराव: लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

संदर्भ

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