भाग Ⅰ: लड़कों और पुरुषों में विकास और वयस्कता के दौरान घुलनशील ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन रिसेप्टर की संभावित प्रासंगिकता

सरल सारांश

प्रजनन हार्मोन ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच) और मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी), ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन रिसेप्टर (एलएचसीजीआर) के दोनों एगोनिस्ट, विकास और वयस्कता के दौरान पुरुष प्रजनन के लिए आवश्यक हैं। lHCGR व्यक्त किया जाता है और वृषण लेडिग कोशिकाओं द्वारा टेस्टोस्टेरोन उत्पादन को उत्तेजित करता है। इस अध्ययन में, हम प्रदर्शित करते हैं कि घुलनशील LHCGR स्वस्थ लड़कों और पुरुषों के रक्त, मूत्र और वीर्य में मौजूद होता है, साथ ही साथ सेक्स क्रोमोसोम विपथन वाले रोगियों में भी। हम दिखाते हैं कि कैसे sLHCGR का परिसंचारी स्तर युवावस्था के विकास, वृषण समारोह और वीर्य की गुणवत्ता के साथ सहसंबद्ध होता है, और प्रदर्शित करता है कि LHCGR भ्रूण मानव गैर-गोनाडल ऊतक से मुक्त होता है। एचसीजी को वृषण और अन्य अंगों के माध्यम से सीरम में जारी किया जाता है, जो लड़कों और पुरुषों में एलएच या एचसीजी के लिए संभावित अतिरिक्त भूमिका का सुझाव देता है।

अमूर्त

ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच) और ह्यूमन कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी) ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन रिसेप्टर (एलएचसीजीआर) के एगोनिस्ट हैं, जो पुरुष प्रजनन क्रिया को नियंत्रित करते हैं। lHCGR को शरीर के तरल पदार्थों में छोड़ा जा सकता है। हम यह निर्धारित करना चाहते थे कि क्या घुलनशील एलएचसीजीआर गोनैडल फ़ंक्शन का एक मार्कर है। 195 स्वस्थ लड़कों और पुरुषों और बांझपन, कमी, या क्लाइनफेल्टर सिंड्रोम (केएस) वाले 396 पुरुषों पर क्रॉस-सेक्शनल, अनुदैर्ध्य और इंटरवेंशनल अध्ययन किए गए थे, सीरम, वीर्य, ​​मूत्र, और यकृत/गुर्दे की धमनियों में मापी गई एलएचसीजीआर को गोनाडल फ़ंक्शन से जोड़ने के लिए। . lHCGR को इन विट्रो और मानव वृषण ऊतक और सेल लाइनों, xenograft माउस मॉडल, और मानव पश्चिमी धब्बा परिणामों के इन विवो मॉडल में मापा गया था कि LHCGR टुकड़े समान आकार के सीरम और गोनाडल ऊतकों में तीन अलग-अलग एंटीबॉडी का उपयोग करके पाए गए थे। मानव एक्सनोग्राफ़्ट के बाद भी, एलएचसीजीआर-एलिसा ने माउस सीरम में कोई प्रतिच्छेदन क्रॉस-रिएक्टिविटी या गैर-विशिष्ट प्रतिक्रिया नहीं दिखाई। इसके विपरीत, मानव भ्रूण के गुर्दे और अधिवृक्क ग्रंथि संस्कृति के बाद sLHCGR को संस्कृति माध्यम में जारी किया गया था। युवावस्था में स्वस्थ लड़कों में सीरम sLHCGR काफी कम था (p=0.0001)। स्वस्थ पुरुषों में, सीरम sLHCGR को निरोधात्मक B/FSH अनुपात (-0.004,p=0.027) के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध किया गया था। बांझ पुरुषों में, वीर्य sLHCGR को सीरम FSH (0.006, p=0.009), शुक्राणु एकाग्रता (-3.5, p=0.003), और कुल शुक्राणुओं की संख्या के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध किया गया था। ( -3.2, प=0.007)। स्वस्थ पुरुषों के सीरम और मूत्र में एचसीजी कम एसएलएचसीजीआर का इंजेक्शन (पी <0.01)। अंत में, sLHCGR को शरीर के तरल पदार्थों में छोड़ा जाता है और यौवन विकास और गोनाडल फ़ंक्शन से जुड़ा होता है। ऑर्किड पुरुषों में परिसंचारी sLHCGR से पता चलता है कि सीरम में sLHCGR गैर-गोनाडल ऊतकों में उत्पन्न हो सकता है और गैर-गोनाडल ऊतकों में कार्य कर सकता है। (नैदानिक ​​​​परीक्षण: NTC01411527, NCT01304927, NCT03418896)।

कीवर्ड

एलएच रिसेप्टर; तरुणाई; विकास; बांझपन;धनिया लाभ; अतिरिक्त गोनाडल प्रभाव; गोनैडोट्रोपिन; भ्रूण की किडनी; भ्रूण अधिवृक्क ग्रंथि; टीसीएएम2; NTera2

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परिचय

ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच) और मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी) दोनों ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन रिसेप्टर (एलएचसीजीआर) के एगोनिस्ट हैं, जो विकास और वयस्कता के दौरान पुरुष प्रजनन के लिए आवश्यक है [1]। एचसीजी एक जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर है जिसे लेडिग, दानेदार ल्यूटिन और झिल्ली कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है और यह सेक्स स्टेरॉयड उत्पादन [1] का एक शक्तिशाली नियामक है। एचसीजी एक शक्तिशाली और लगातार एगोनिस्ट है लेकिन भ्रूण के विकास [2] के दौरान केवल शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण है। कुछ जर्म सेल कैंसर और अग्नाशय के कैंसर को छोड़कर, वयस्कता में एचसीजी का उत्पादन नहीं होता है, हालांकि पहले के एक अध्ययन में वयस्क पुरुषों और महिलाओं में पिट्यूटरी-एचसीजी का कम पल्सेटाइल स्राव पाया गया। एचसीजी का उपयोग फर्टिलिटी उपचार के दौरान महिलाओं के ओव्यूलेशन को प्रेरित करने के लिए किया जाता है, पुरुषों के लिए हाइपोगोनैडल पुरुषों में टेस्टोस्टेरोन संश्लेषण और संभावित शुक्राणुजनन को प्रोत्साहित करने के लिए, या अंतर्जात टेस्टोस्टेरोन उत्पादन के लिए नैदानिक ​​​​परीक्षण के रूप में [4]। माउस एलएच रिसेप्टर (एलएचसीजीआर) के उन्मूलन से टेस्टोस्टेरोन और वीर्य की गुणवत्ता [5] में नाटकीय कमी आती है, और कई शोध समूहों ने एलएचसीजीआर में उत्परिवर्तन और एसएनपी की पहचान की है, जो मानव प्रजनन कार्य [6-8] के लिए इसके महत्व को प्रदर्शित करता है।

LHCGR जीन क्रोमोसोम 2 पर स्थित है और इसमें 11 एक्सॉन होते हैं, जिनमें से एक्सॉन 1-10 एक्स्ट्रासेलुलर स्ट्रक्चरल डोमेन को एनकोड करते हैं और एक्सॉन 11 एन्कोड 7 ट्रांसमेम्ब्रेन और इंट्रासेल्युलर स्ट्रक्चरल डोमेन [9] को एनकोड करते हैं। एलएचसीजीआर के कई आइसोफोर्म हैं, जिनमें से एक को स्रावित माना जाता है क्योंकि इसमें एक ट्रांसमेम्ब्रेन एंकर [10] की कमी होती है। एक अन्य संभावना यह है कि शरीर के तरल पदार्थों में एलएचसीजीआर की रिहाई कोशिका झिल्ली पर प्रोटीन के एंजाइमेटिक क्लीवेज पर निर्भर होती है, जैसे एडीएएम, एमएमपी और अन्य ज्ञात ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन। दरअसल, एचसीजी को एमएमपी -2 और एमएमपी -9 [11,12] को विशेष रूप से अपग्रेड करने के लिए दिखाया गया है, और कई अध्ययनों ने एलएचसीजीआर [13,14] के पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन को दिखाया है। घुलनशील एलएचसीजीआर (एलएचसी) को एलिसा प्लेटफॉर्म [15,16] द्वारा महिला सीरम और कूपिक द्रव में मापा गया है। एलिसा परख में प्रयुक्त एंटीबॉडी की विशिष्टता को एपिटोप स्थानीयकरण के लिए सीएचओ कोशिकाओं में विभिन्न एलएचसीजीआर अंशों को व्यक्त करके और मानव प्लेसेंटा [15-17] में अभिव्यक्ति का पता लगाने के द्वारा मान्य किया गया था। LC-MS/MS [18] द्वारा सीरम में sLHCGR का पता लगाया गया। महिलाओं में sLHCGR की सीरम सांद्रता प्रजनन उपचार, प्रीक्लेम्पसिया, समय से पहले जन्म, और डाउन सिंड्रोम आरोपण दर वाले बच्चों में गर्भावस्था से जुड़ी थी [15,16], लेकिन आज तक अन्य शोध समूहों द्वारा मान्य नहीं किया गया है। हमारी जानकारी के अनुसार, sLHCGR को कभी भी स्वस्थ पुरुषों, विकासशील किशोर लड़कों, या सेक्स क्रोमोसोम विपथन वाले पुरुषों के शरीर के तरल पदार्थों में वर्णित नहीं किया गया है। sLHCGR पुरुष परिसंचरण में उच्च-आत्मीयता बाध्यकारी परिवहन या एलएच या एचसीजी गतिविधि के परिवर्तन के माध्यम से गोनाडल फ़ंक्शन के एक मार्कर के रूप में कार्य कर सकता है।

सामग्री और तरीके

1. सहगण

सामान्य जनसंख्या से युवा पुरुष

डेनमार्क में, 18 वर्ष से अधिक आयु के सभी स्वस्थ युवकों को सैन्य सेवा के लिए उपयुक्तता निर्धारित करने के लिए एक शारीरिक परीक्षा से गुजरना होगा। 1996 के बाद से, सामान्य आबादी का प्रतिनिधित्व करने वाले लगभग 300 खेपों की हर साल वीर्य की गुणवत्ता के लिए जांच की गई है। उन सभी ने वीर्य के नमूने प्रदान किए, एक प्रश्नावली पूरी की, उनके अंडकोष की अल्ट्रासाउंड परीक्षाएँ हुईं, और रक्त के नमूने लिए गए। बायोबैंक से सीरम और वीर्य के नमूने, साथ ही 2013 और 2014 में सर्वेक्षण किए गए 148 पुरुषों से बीएमआई और उम्र पर अल्ट्रासाउंड आकलन और जानकारी को वर्तमान अध्ययन में शामिल किया गया था (नैतिकता समिति की मंजूरी: एच-केएफ -289428)।

प्री- और पोस्ट-पबर्टल स्वस्थ लड़के

कोपेनहेगन किशोरावस्था अध्ययन स्वस्थ डेनिश बच्चों [20] का एक संयुक्त पार-अनुभागीय और अनुदैर्ध्य अध्ययन है। यादृच्छिक रूप से चुने गए पब्लिक स्कूलों से, 6203 बच्चों को भाग लेने के लिए आमंत्रित किया गया था। प्रतिभागियों की कुल संख्या 2020 बच्चे थे। 209 बच्चों (101 लड़कों) का अनुदैर्ध्य अनुवर्ती हर 6 महीने में आयोजित किया गया था और इसमें शारीरिक परीक्षण, यौवन चरणों का टान्नर मूल्यांकन और रक्त और मूत्र के नमूने शामिल थे। यौवन (नैदानिक ​​​​परीक्षण: NTC01411527) के दौरान sLHCGR का आकलन करने के लिए अनुदैर्ध्य अनुवर्ती के साथ छत्तीस लड़कों को इस अध्ययन में शामिल किया गया था।

गंभीर कॉमरेडिटी के बिना बांझ पुरुष

कोपेनहेगन-बोन-गोनाड स्टडी 307 बांझ पुरुषों का एक समूह अध्ययन है, जिनमें गंभीर सह-रुग्णता नहीं है, जिन्होंने 2011 से 2015 तक हमारे पुरुष क्लिनिक में भाग लिया, जिसमें कुल 1427 पुरुष [21,22] शामिल हैं। कम वीर्य की गुणवत्ता और पितृत्व की इच्छा के कारण सभी पुरुषों को हमारे क्लिनिक में भेजा गया था। सभी का टेस्टिकुलर अल्ट्रासाउंड सहित एक शारीरिक परीक्षण किया गया, रक्त के नमूने लिए गए, और वीर्य के नमूने प्रदान किए गए। एक विशेषज्ञ ने उनका विस्तृत चिकित्सा इतिहास प्राप्त किया। शोधकर्ताओं द्वारा 150 दिनों तक पुरुषों का पालन किया गया और पहले बताए अनुसार विटामिन डी या प्लेसबो लिया। इस अध्ययन में प्रदान किए गए सभी डेटा प्रारंभिक पूर्व-हस्तक्षेप यात्रा से थे और सभी शामिल चर पूर्वनिर्धारित थे (नैदानिक ​​​​परीक्षण: NCT01304927)।

मानकीकृत सिस्टंच

क्लाइनफेल्टर सिंड्रोम वाले पुरुष और लड़के और एनोर्चिया के रोगी

हमने अपने पुरुष क्लिनिक से 64 लड़कों और पुरुषों की क्लाइनफेल्टर सिंड्रोम (केएस), 47 पोस्ट-पबर्टल और 16 प्री-प्यूबर्टल के साथ पहचान की, जो टान्नर स्टेजिंग के अनुसार परिभाषित हैं। हमारे पास सटीक क्रोमोसोमल विपथन, चिकित्सा इतिहास, यौवन की शुरुआत की स्थिति और सीरम की जानकारी सभी के लिए उपलब्ध थी। यौवन की शुरुआत से पहले और उसके दौरान 7 लड़कों ने नियमित नैदानिक ​​​​मूल्यांकन और रक्त के नमूने के साथ अनुदैर्ध्य अनुवर्ती कार्रवाई की।

हमने सामान्य क्रोमोसोम काउंट वाले 8 पुरुषों को भी शामिल किया था, जिनके द्विपक्षीय वृषण पिछली स्थितियों के लिए हटा दिए गए थे: वृषण जर्म सेल कार्सिनोमा (n=4), फैलाना प्रोस्टेट कैंसर (n=1), द्विपक्षीय क्रिप्टोर्चिडिज़्म, और बाल चिकित्सा orchiectomy ( n=1), बाइलेटरल जर्म सेल नियोप्लासिया इन सीटू (n=1), और ट्रॉमा (n=1) के कारण शेष वृषण को हटाने के बाद उन्नत वृषण कैंसर।

वयस्क स्प्लेनक्निकस प्रवाह मापन से गुजर रहे हैं

हमने सामान्य जिगर समारोह के साथ तीन पुरुषों और तीन पोस्टमेनोपॉज़ल महिलाओं को शामिल किया, जिन्हें संदिग्ध मेसेन्टेरिक इस्किमिया के लिए भर्ती कराया गया था और आंत के रक्त प्रवाह के माप के लिए संदर्भित किया गया था, लेकिन मेसेन्टेरिक इस्किमिया नहीं दिखाया गया था। लिवर, किडनी, ऊरु शिरा और संबंधित धमनी से एक साथ रक्त के नमूने एकत्र किए गए (नैतिकता समिति की मंजूरी: H.18048245)

इंटरवेंशन स्टडी: स्वस्थ पुरुष मानव कोरियोन गोनाडोट्रोपिन के संपर्क में

नैदानिक ​​​​हस्तक्षेप में भाग लेने के लिए ग्यारह स्वस्थ पुरुषों को डेनिश रिग्सहॉस्पिटलेट घोषणा के माध्यम से भर्ती किया गया था। स्वयंसेवकों का 5000 IU मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन के साथ इलाज किया गया था और एचसीजी इंजेक्शन (नैदानिक ​​​​परीक्षण: NCT03418896) के 8, 24 और 72 घंटे बाद एकत्र किए गए अनुवर्ती नमूनों के साथ बेसलाइन रक्त और मूत्र के नमूनों की तुलना करके अंतर्जात टेस्टोस्टेरोन का अधिकतम उत्पादन मापा गया था।

2. चूहे, मानव ऊतक और कोशिका रेखाएँ

मानव वृषण कैंसर कोशिकाओं के दो उपभेदों NTera -2 और TCam -2, क्रमशः भ्रूण कार्सिनोमा और सेमिनोमा का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिनका उपयोग और संवर्धन पहले वर्णित [23] के रूप में किया गया था।

सेरा ट्यूमर मुक्त नग्न चूहों (डब्ल्यूटी) और टीकैम -2 xenograft नग्न चूहों से क्रमशः वेक्टर, एलएच, या एचसीजी के साथ इलाज किया गया था (पशु प्रयोग निरीक्षणालय, कोपेनहेगन, डेनमार्क, लाइसेंस संख्या: 2012-15-2934-00051) .

नियोजित गर्भपात के बाद पहली तिमाही में मानव भ्रूण के ऊतकों को दान की गई महिलाओं के ऊतकों से एकत्र किया गया था। भ्रूण के गुर्दे और भ्रूण के अधिवृक्क ऊतक निलंबन ड्रॉप मॉडल में सुसंस्कृत थे जैसा कि पहले बताया गया था और विश्लेषण के लिए माध्यम एकत्र किया गया था [24,25] (नैतिकता समिति की मंजूरी: एच -1-2012-007)।

वृषण कैंसर (नैतिकता समिति अनुमोदन: एच {{0}}) के साथ ओवरीएक्टोमाइज्ड पुरुषों से वयस्क वृषण नमूने प्राप्त किए गए थे। गैर-घातक क्षेत्रों वाले पेरिटुमोरल ऊतक को - 80◦ C पर संग्रहीत किया गया था या रात भर 4◦ C पर फॉर्मेलिन या संशोधित स्टिव-फिक्सेटिव (200 एमएल 37 प्रतिशत फॉर्मलाडेहाइड, 1 एल 0.05 एम फॉस्फेट में 40 एमएल एसिटिक एसिड) में जमा किया गया था। बफर, पीएच 7.4)।

3. जैव रासायनिक विश्लेषण

सीरम, वीर्य, ​​मूत्र और विभिन्न कल्चर मीडिया में कुल sLHCGR का पता लगाने के लिए न्यू डच बायोमार्कर कैटेलिस्ट लेबोरेटरी (NBCL) से एलिसा किट का उपयोग करके एक सत्यापन प्रक्रिया में मानव LHCGR के खिलाफ एंटीबॉडी LHR 029 का उपयोग करके और सभी को मापने के लिए प्रदर्शन किया गया था। इनमें से बार-बार। एलिसा परख की पहचान सीमा 0.01 pmol/mL थी और अधिकतम स्तर 15.55 था। सामान्य आबादी के छह पुरुषों, जिनका पता लगाने की ऊपरी सीमा से ऊपर sLHCGR का स्तर था, उनके नमूनों को पतला और फिर से मापा गया था, जो 30 pmol/mL तक का स्तर दिखाते हैं। एलिसा प्लेटफॉर्म के प्रदर्शन का पहले [15-17] विस्तार से वर्णन किया गया है।

Cistanche की खुराक

हमने अपने प्रयोगशाला तकनीशियनों द्वारा स्थापित दो अलग-अलग इन-हाउस एलिसा भी स्थापित किए, और आगे के सभी अभिकर्मक उनके सुझाए गए सेटअप [26] के अनुसार ओरिजिनल बायोमार्कर्स लिमिटेड, यूके द्वारा प्रदान किए गए। सबसे पहले, 5A10C9 (ProMab) और am0{{20}}904pun ( OriGene) क्रमशः एलएचसीजीआर और एचसीजी के खिलाफ निर्देशित। दूसरे, हमने छह वयस्कों sLHCGR से कुल लीवर, किडनी, और निचले अंगों की धमनी और शिरापरक नमूनों को निर्धारित करने के लिए इन-हाउस एलिसा का उपयोग किया, जहां हमने sLHCGR के खिलाफ समान एंटीबॉडी LHR 0 29 (NBCL हॉलैंड) का उपयोग किया। दो अलग-अलग प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया। ऊपर वर्णित अंगों से hCG-sLHCGR कॉम्प्लेक्स और धमनी/शिरापरक नमूनों को छोड़कर, इस पत्र में वर्णित सभी sLHCGR माप NBCL एलिसा का उपयोग करके किए गए थे। स्वस्थ लड़कों में, डीपीसी-कोटेड- एक काउंट आरआईए किट (डायग्नोस्टिक प्रोडक्ट्स, लॉस एंजिल्स, सीए) का उपयोग करके टेस्टोस्टेरोन का विश्लेषण किया गया था, जिसमें 0.23 एनएमओएल / एल की पहचान (एलओडी) की सीमा और समय-संकल्पित इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके 8.6 प्रतिशत का सीवी था। (डेल्फ़िया; वालेक, टुर्कु, फ़िनलैंड), पता लगाने की सीमा 0.20 एनएमओएल/एल थी जिसमें सीवी 6.4 प्रतिशत था। वयस्कों में, टेस्टोस्टेरोन और सेक्स हार्मोन बाइंडिंग ग्लोब्युलिन (SHBG) का विश्लेषण क्रमशः 0.35 nmol / L और 0.33 nmol / L के LODs के साथ रासायनिक संदीप्ति इम्यूनोसे (एक्सेस, बेकमैन कूल्टर, यूएसए) द्वारा किया गया था। सीरम और मूत्र FSH और LH स्तरों को क्रमशः 0.06 और 0.05 IU/L, और CV और lt की पता लगाने की सीमा के साथ समय-संकल्पित इम्यूनोफ्लोरेसेंस (डेल्फ़िया; वैलैक, तुर्कू, फ़िनलैंड) का उपयोग करके मापा गया; दोनों 5 प्रतिशत पर। इनहिबिन बी परख एक विशिष्ट द्विपक्षीय एंजाइम इम्यूनोएसे (इनहिबिन बी जेनआईआई, बेकमैन कूल्टर, यूएसए) सीवी <11 प्रतिशत का उपयोग करके किया गया था। एएमएच के लिए, हमने बेकमैन कूल्टर एंजाइम इम्यूनोएसे (इम्यूनोटेक, बेकमैन कूल्टर, मार्सिले, फ्रांस) और सीवी <8 प्रतिशत का इस्तेमाल किया। अंत में, IGF1 और IGF-BP3 क्रमशः 10 प्रतिशत और 9 प्रतिशत सीवी के साथ IDS-iSYS इम्यूनोडायग्नोस्टिक सिस्टम के केमिलुमिनेसेंस परख का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे। फ्री एस्ट्राडियोल की गणना मेज़र के स्थिरांक का उपयोग करके की गई थी और फ्री टेस्टोस्टेरोन (एफटी) की गणना वर्म्यूलेन के सूत्र [27,28] का उपयोग करके की गई थी।

वीर्य विश्लेषण

स्वस्थ युवा पुरुषों और बांझ वयस्क प्रतिभागियों ने वीर्य के नमूने प्रदान किए और स्खलन संयम की अवधि के बारे में स्वयं रिपोर्ट की गई जानकारी प्राप्त की। वीर्य विश्लेषण प्रशिक्षित तकनीशियनों द्वारा किया गया था जैसा कि पहले बताया गया था [19]। वजन करके वीर्य की मात्रा का अनुमान लगाया गया था। शुक्राणु व्यवहार्यता मूल्यांकन के लिए, 1 0 μ एल अच्छी तरह से मिश्रित वीर्य प्रतिकृति को स्लाइड पर रखा गया और × 4 0 0x माइक्रोस्कोप के तहत 37◦ सी के एक गर्म खंड में जांच की गई। शुक्राणु को या तो वर्गीकृत किया गया था उन्नत व्यवहार्य (डब्ल्यूएचओ वर्ग ए प्लस बी), गैर-प्रगतिशील व्यवहार्य (वर्ग सी) या निष्क्रिय (कक्षा डी)। दो व्यवहार्यता आकलन के औसत का उपयोग किया गया था। शुक्राणु की सघनता का आकलन करने के लिए, नमूनों को 0.6 moL/L NaHCO3 और 0.4 प्रतिशत (v/v) फॉर्मेल्डिहाइड के आसुत जल के घोल में पतला किया गया और फिर एक बुर्कर-तुर्क हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया और औसत आकलन का उपयोग किया गया। केवल पूंछ वाले शुक्राणुओं की गिनती की गई। अंत में, स्मीयर तैयार किए गए, और पैप दाग के साथ दाग दिया गया, और [29] के मानदंडों के अनुसार शुक्राणु आकृति विज्ञान का कड़ाई से मूल्यांकन किया गया।

पश्चिमी सोख्ता

मानव वृषण ऊतक को लसीका बफर में समरूप किया गया था, एसडीएस लोडिंग बफर में पतला किया गया था, और फिर 5 मिनट के लिए 95◦ सी पर गरम किया गया था। नमूने 4-20 प्रतिशत प्रीकास्ट पॉलीएक्रिलामाइड जैल (बायोरैड, कैट# 456-8096) पर लोड किए गए थे और प्रोटीन को अलग करने के लिए 1 घंटे के लिए 100 वी पर चलाए गए थे। सीरम में एसएलएचसीजीआर का पता लगाने के लिए, जेल पर नमूने लोड करने से पहले पियर्स एल्ब्यूमिन / आईजीजी रिमूवल किट (थर्मो साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए, कैट # 89875) का उपयोग करके एल्ब्यूमिन और आईजीजी को हटा दिया गया था। जेल वैद्युतकणसंचलन के बाद, गीले ब्लोटर (बायोरैड) का उपयोग करके प्रोटीन को पॉलीविनाइलिडिन डिफ़्लुओराइड झिल्ली में स्थानांतरित किया गया। झिल्लियों को 1 घंटे के लिए ट्राइस-बफर खारा और 5 प्रतिशत स्किम्ड सूखे दूध में बंद कर दिया गया, फिर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4◦ सी पर रातोंरात ऊष्मायन किया गया और द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। झिल्लियों को उन्नत रसायनयुक्तता (थर्मो साइंटिफिक सुपर सिग्नल वेस्ट फेम्टो मैक्सिमम सेंसिटिव सबस्ट्रेट, कैट # 34095) और एक केमीडॉक एमपी इमेजिंग सिस्टम (बायोरैड, कैट # 17001402) के साथ फोटोडेटेक्टर से धोया गया। ऊतक और सीरम में LHCGR का पता लगाने के लिए तीन अलग-अलग एंटीबॉडी का उपयोग किया गया: अवीवा सिस्टम बायोलॉजी (OASG04237); NBCL हॉलैंड, वही एंटीबॉडी जो सीरम एलिसा किट (LHR029) और सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (डलास, TX, USA, SC - 26341) में है। -2 माइक्रोग्लोबुलिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था।

इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री

पहले वर्णित [25] के रूप में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का प्रदर्शन किया गया था। संक्षेप में, वर्गों को संशोधित कठोर निर्धारण, डीवैक्सड और रीहाइड्रेटेड के साथ तय किया गया था। साइट्रेट निष्कर्षण बफर (1 0 मिमी, पीएच 6. 0) ​​वाले आटोक्लेव में प्रतिजन निष्कर्षण किया गया था। अंतर्जात पेरोक्सीडेज को 30 मिनट के लिए मेथनॉल में 3 प्रतिशत (v/v) H2O2 के साथ अवरुद्ध कर दिया गया था। प्रत्येक चरण के बीच, वर्गों को टीबीएस में धोया गया। वर्गों को 30 मिनट के लिए 0.5 प्रतिशत बीएसए हॉर्स सीरम के साथ ऊष्मायन किया गया, इसके बाद कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए दो अलग-अलग प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर ऊष्मायन किया गया (WB/ELISA, सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी SC - 25828 के लिए LHR029)। 30 मिनट के लिए वर्गों को द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ जोड़ा गया। छवियों की कल्पना एमिनोएथिल कार्बाज़ोल (एईसी, इंविट्रोजन, लाइफ टेक्नोलॉजीज / थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) के साथ की गई थी। प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना नकारात्मक नियंत्रण थे। कोई भी नकारात्मक नियंत्रण दागदार नहीं था। मेयर के हेमटॉक्सिलिन के साथ काउंटरस्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया और एक्वाटेक्स के साथ माउंटिंग का प्रदर्शन किया गया। एक Nikon Microphoto-FXA माइक्रोस्कोप (Nikon Corporation, Melville, NY, USA) पर अनुभागों का मूल्यांकन किया गया। अंतिम विश्लेषण सॉफ्टवेयर NDPview संस्करण 1.2.36 (Hamamatsu Photonics, Iwata City, Japan) का उपयोग करके किया गया था।

किडनी के लिए सिस्टैंच एक्सट्रैक्ट के फायदे

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ली जुएल मोर्टेंसन¹, मेटे लोरेंजेन¹, ऐनी जोर्गेनसन², जैकब अलब्रेथसेन², नील्स जोर्गेनसन²सोरेन मोलर^3,4, अन्ना-मारिया एंडरसन², एंडर्स जूल^2,4और मार्टिन ब्लॉमबर्ग जेन्सेन^1,5

1. ग्रुप ऑफ स्केलेटल, मिनरल एंड गोनैडल एंडोक्रिनोलॉजी, यूनिवर्सिटी डिपार्टमेंट ऑफ ग्रोथ एंड रिप्रोडक्शन, रिगशोपिलेट, 2100 कोपेनहेगन, डेनमार्क; li.juel.mortensen@regionh.dk (एलजेएम); mette.lorenzen.01@regionh.dk (एमएल)

2. विकास और प्रजनन विभाग और पुरुष प्रजनन और बाल स्वास्थ्य (EDMaRC) के अंतःस्रावी व्यवधान में अनुसंधान और अनुसंधान प्रशिक्षण के लिए अंतर्राष्ट्रीय केंद्र, रिगशोपिलेट, कोपेनहेगन विश्वविद्यालय, Blegdamsvej 9, 2100 कोपेनहेगन, डेनमार्क; ऐनी.जोर्जेंसन.02@regionh.dk (एजे); Jakob.Christian.Albrethsen@regionh.dk (जेए); Niels.Joergensen@regionh.dk (एनजे); अन्ना-Maria.Andersson@regionh.dk (ए.-एमए); Anders.Juul@regionh.dk (एजे)

3. सेंटर फॉर फंक्शनल एंड डायग्नोस्टिक इमेजिंग एंड रिसर्च, डिपार्टमेंट ऑफ क्लिनिकल फिजियोलॉजी एंड न्यूक्लियर मेडिसिन 260, हिविडोव्रे हॉस्पिटल, 2650 कोपेनहेगन, डेनमार्क; Soeren.Moeller@regionh.dk

4. क्लिनिकल मेडिसिन विभाग, स्वास्थ्य विज्ञान संकाय, कोपेनहेगन विश्वविद्यालय, 2200 कोपेनहेगन, डेनमार्क

5. डिविजन ऑफ बोन एंड मिनरल रिसर्च, हार्वर्ड स्कूल ऑफ डेंटल मेडिसिन/हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, एमए 02115, यूएसए