भाग Ⅰ: भड़काऊ प्रक्रिया पोडोसाइट्स में WT1 की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण को नियंत्रित करती है जिससे किडनी खराब हो जाती है

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मारीएला एरेलानो-रोड्रिग्ज, पाब्लो ज़ापाटा-बेनाविड्स और एट अल।

परिचय

विल्म का ट्यूमर-1 जीन(WTI) पॉडोसाइट्स के अस्तित्व और अक्षम वृक्क निस्पंदन में शामिल मुख्य जीनों में से एक है। भड़काऊ प्रक्रियाएं होती हैंगुर्दाअसफलताऔर यह संभवतः WT1 के मॉडुलन के माध्यम से हो सकता है (विल्म का ट्यूमर-1 जीन) डब्ल्यूटी1(विल्म का ट्यूमर-1 जीन) एक ट्रांसक्रिप्शन कारक, एक जिंक फिंगर प्रोटीन को एन्कोड करता है जिसमें एक्सॉन 5 (17AA±) और एक्सॉन 9 (केटीएस ±) (1) में वैकल्पिक स्प्लिसिंग द्वारा चार प्रमुख आइसोफॉर्म होते हैं। KTS-isoform में डीएनए के लिए एक उच्च आत्मीयता है, KTS प्लस साइटोप्लाज्म (2, 3) में स्प्लिसोसोम प्रोटीन के साथ सह-स्थानीयकृत होता है। WT1(विल्म का ट्यूमर-1 जीन) भ्रूणजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, मुख्य रूप से गोनाडल में औरगुर्दाविकास; वयस्कों में, इसकी अभिव्यक्ति विशिष्ट आंत कोशिकाओं तक सीमित हैगुर्दा(पॉडोसाइट्स) और कई जीनों के रखरखाव और मॉड्यूलेशन के लिए आवश्यक है, जैसे कि पॉडोकैलेक्सिन, नेफ्रिन (एनपीएचएस 1), और पेयर-बॉक्स ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (4-6)। उत्परिवर्तन या डब्ल्यूटीएल अभिव्यक्ति में कमी से नेफ्रिन और पॉडोकैलेक्सिन की अभिव्यक्ति कम हो सकती है और यह ग्लोमेरुलोस्केलेरोसिस (5, 7-10) जैसे नेफ्रोपैथी से जुड़ा है।

नेफ्रोटिक सिंड्रोम बचपन में सबसे अधिक बार होने वाला रीनल सिंड्रोम है, इसका हिस्टोलॉजिकल वर्गीकरण मिनिमल नेफ्रोटिक चेंज, फोकल सेग्मल ग्लोमेरुलोस्केलेरोसिस, और डिफ्यूज मेसेंजियल स्क्लेरोसिस है, और स्टेरॉयड की प्रतिक्रिया की इसकी सीमा के अनुसार एक संवेदनशील और प्रतिरोधी नेफ्रोटिक सिंड्रोम (11) के रूप में वर्गीकृत किया गया है। .

सिस्टैंच के प्रभाव: सूजन-रोधी

WT1 का उत्परिवर्तन (विल्म का ट्यूमर-1 जीन) आमतौर पर स्टेरॉयड-प्रतिरोधी नेफ्रोटिक सिंड्रोम वाले बच्चों में रिपोर्ट किया जाता है, एक दुर्लभ बीमारी जो नेफ्रोटिक सिंड्रोम (12,13) ​​के रोगियों के 10-15 प्रतिशत को प्रभावित करती है। छिटपुट नेफ्रोटिक सिंड्रोम वाले सभी बच्चों में से लगभग 80 प्रतिशत स्टेरॉयड उपचार का जवाब देते हैं, हालांकि, WT1 में कोई उत्परिवर्तन नहीं पाया गया।विल्म का ट्यूमर-1 जीन) एक बड़े समूह अध्ययन (14) में। स्टेरॉयड-प्रतिरोधी नेफ्रोटिक सिंड्रोम की अभिव्यक्ति में कमी और स्टेरॉयड-संवेदनशील नेफ्रोटिक सिंड्रोम (15) के रोगियों में कुछ हद तक। लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) द्वारा प्रेरित प्रणालीगत सूजन के एक murine मॉडल में, एलपीएस प्रशासन के बाद 24 घंटे, डब्ल्यूटी1 (विल्म का ट्यूमर-1 जीन) को साइटोप्लाज्म में बदल दिया गया था और नेफ्रिन की अभिव्यक्ति में कमी के साथ जुड़ा था, पॉडोसाइट्स में स्लिट डायाफ्राम को बनाए रखने के लिए एक प्रमुख घटक और सही ग्लोमेरुलर निस्पंदन के लिए आवश्यक है, जिससे WT1 (विल्म का ट्यूमर-1 जीन) नेफ्रिन जीन (16) को विनियमित करने के लिए एक ट्रांसक्रिप्शनल कारक के रूप में कार्य करता है।

A459 फेफड़े के कैंसर कोशिकाओं में ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (TNFa) के साथ इलाज किया जाता है, WT1 का अनुवाद (विल्म का ट्यूमर-1 जीन) प्रोटीन टू साइटोप्लाज्म देखा गया है, यह सुझाव देता है कि एक भड़काऊ उत्तेजना इसके इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण और ट्रांसक्रिप्शनल फ़ंक्शन (17) को बदल सकती है। फास्फोराइलेशन WT1 की ट्रांसक्रिप्शनल नियामक गतिविधि को संशोधित करने में भूमिका निभा सकता है (विल्म का ट्यूमर-1 जीन) परमाणु स्थानान्तरण के साथ-साथ WT1 के निषेध के माध्यम से हस्तक्षेप के माध्यम से (विल्म का ट्यूमर-1 जीन) जिंक फिंगर डोमेन (19) में सीएमपी-आश्रित प्रोटीन किनसे-मध्यस्थता वाले फॉस्फोराइलेशन ऑफ सेर -365 और सेर -393 द्वारा डीएनए-बाइंडिंग (18)।

सेप्सिस प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया का एक परिणाम है और संक्रमण से प्रेरित समर्थक और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई की विशेषता है। गंभीर रूप से बीमार रोगियों में तीव्र सूजन की उपस्थिति में तीव्र गुर्दे की चोट आम है और पुरानी गुर्दे की क्षति (20,21) की प्रगति के लिए एक मजबूत लिंक है। इस बात के प्रमाण हैं कि सूजन विभिन्न अंगों को नुकसान पहुंचाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जिनमें शामिल हैंगुर्दे(22)। इस काम में, हमने WT1 के मॉड्यूलेशन पर प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के प्रभाव का मूल्यांकन किया।विल्म का ट्यूमर-1 जीन) साइटोप्लाज्म में अभिव्यक्ति और उसका स्थानान्तरण।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा लाभ: एंटी-कैंसर और एंटी-फोडा

सामग्री और तरीके

पशु मॉडल। मादा BALB/c चूहे (8-10 सप्ताह पुराने) हारलैंड मेक्सिको (मेक्सिको सिटी, मैक्सिको) से प्राप्त किए गए थे। चूहों को नियंत्रित कमरे के तापमान, आर्द्रता और प्रकाश (12/12h प्रकाश-अंधेरे चक्र) के तहत पानी और भोजन के विज्ञापन के साथ बंद कर दिया गया था। एस्चेरिचिया कोलाई O111 का LPS: B4 (सिग्मा एल्ड्रिच, टोलुका, मैक्सिको सिटी, मैक्सिको) और एक एकल एलपीएस का इंजेक्शन 8 मिलीग्राम/किलोग्राम इंट्रापेरिटोनियल (16) की खुराक पर प्रशासित किया गया था; खारा समाधान का उपयोग नियंत्रण, अनुपचारित चूहों के लिए किया गया था। चूहों को प्रत्येक समय बिंदु पर n =5 के साथ, 12,24,36,48 और 72 घंटे में 200 मिलीग्राम / किग्रा सोडियम पेंटोबार्बिटल समाधान के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ बलिदान किया गया था, और फिरगुर्दाऊतक और रक्त एकत्र किया गया। जानवरों की बलि देने से पहले मूत्र एकत्र किया जाता था।

दो चूहों के लिएगुर्दाक्रोनिक को प्रेरित करने के लिए हर 2 दिनों में 1 मिलीग्राम / किग्रा एलपीएस के साथ अन्वेषकों को इंजेक्ट किया गया थागुर्दा चोटसकारात्मक नियंत्रण (21) के रूप में। सभी प्रयोग जैविक विज्ञान संकाय (सीईआईबीए -2016-034) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति से पूर्व अनुमोदन के अनुसार किए गए थे।

गुर्दाअन्वेषक। सेगुर्दाBALB/c चूहों की, ऊतक स्लाइस 250-300 उम मोटी एक क्रुमडीक ऊतक स्लाइसर (अलबामा अनुसंधान और विकास, मुनफोर्ड, एएल, यूएसए) के साथ 4 डिग्री पर क्रेब्स हेंसेलिट बाइकार्बोनेट (केबी) के बफर के निरंतर प्रवाह के साथ तैयार किए गए थे। जो 5 प्रतिशत CO2 के साथ वातित था। स्लाइस को KB बफर में 4 डिग्री डिग्री पर काटा गया था।गुर्दाएक्सप्लांट्स को 12-वेल प्लेट्स में डल्बेको के संशोधित ईगल के माध्यम/F12 माध्यम के साथ 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम और 5 प्रतिशत एंटीबायोटिक-एंटीफंगल एजेंट के साथ पूरक किया गया था, और 5% सीओ के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था, और 25 पर सरगर्मी आरपीएम। अन्वेषकों को TNFa (R&D सिस्टम्स, मिनियापोलिस, MN, USA) के 10 एनजी/एमएल, इंटरल्यूकिन 1 के 20 एनजी/एमएल (आईएल1; आर एंड डी सिस्टम्स) और 100 एनजी/एमएल एलपीएस के साथ उपचारित किया गया और 6,12 पर विश्लेषण किया गया। और 24 घंटे बाद।

मूत्र प्रोटीन। उपरोक्त प्रत्येक समय बिंदु पर मूत्र के नमूने एकत्र किए गए थे। प्रोटीन सांद्रता को डीसी प्रोटीन परख किट (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया था और एल्ब्यूमिन्यूरिया का मूल्यांकन सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके और गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (16) के बैंड आकार के आधार पर किया गया था।

प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स। सैंडविच एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख किट (पेप्रोटेक, मैक्सिको सिटी, मैक्सिको) का उपयोग करके IL6, IL1 और TNFa के स्तर को मापा गया।

मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR)। निर्माता के निर्देशों के अनुसार Trizolw Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) का उपयोग करके कुल RNA को गुर्दे के ऊतकों से अलग किया गया था। एकल-फंसे सीडीएनए को निर्माता के निर्देशों के अनुसार उच्च क्षमता सीडीएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, फोस्टर सिटी, सीए, यूएसए) का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा संश्लेषित किया गया था। टैक्मैन जीन एक्सप्रेशन एसेज़ के साथ 7500 रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) का उपयोग करके रीयल-टाइम पीसीआर का प्रदर्शन किया गया। तीन प्रतियों में प्रत्येक नमूने के लिए तुलनात्मक वास्तविक समय पीसीआर assays का प्रदर्शन किया गया। WT1 के लिए प्राइमर (विल्म का ट्यूमर-1 जीन) आगे थे:5-TCTGCGG AGCCCAATACAG-3'; रिवर्स:5-CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA-3';और जांच FAM:5-CACCGTGCGTGTGTATT-3'NFQ; प्रोटोकॉल 95 डिग्री के लिए 10 मिनट और 40 चक्रों के लिए 94 डिग्री पर किया गया था 30 एस के लिए और 30 के लिए 64 डिग्री सेल्सियस। WT1 की सापेक्ष अभिव्यक्ति (विल्म का ट्यूमर-1 जीन) जीन की गणना समीकरण 2-AACT(23) के साथ ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) जीन (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) को सामान्य करने के लिए किया जा रहा है।

गुर्दे की बीमारी का इलाज करें सिस्टैंच का अर्क

नेफ्रिन mRNA की अभिव्यक्ति 3 कुरूप सीडीएनए और निम्नलिखित प्राइमरों के साथ निर्धारित की गई थी: फॉरवर्ड: 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT-3'और रिवर्स: 5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3'30 सेकंड के लिए 94 डिग्री पर,60 30 चक्रों के लिए डिग्री डिग्री और 30 चक्रों के लिए 72 डिग्री डिग्री (372 बीपी)(16)। GAPDH की अभिव्यक्ति के लिए, इस्तेमाल किए गए प्राइमर थे: फॉरवर्ड: 5'-एसीसीसीएजीटीसीएटीजीसीसीएटीसीएसी -3', रिवर्स: 5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA -3', निम्नलिखित प्रतिक्रिया स्थितियों के साथ: 40 के लिए 94 डिग्री, 30 के लिए 60 डिग्री और 35 चक्रों के लिए 40 के लिए 72 डिग्री (452 ​​बीपी)। WT1 की अभिव्यक्ति (विल्म का ट्यूमर-1 जीन): फॉरवर्ड 5'-CACATGAGAGAAACGCCCCTTCATGTG-3', रिवर्स 5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA-3' 94 डिग्री डिग्री पर 40 सेकंड, 30 डिग्री के लिए 64 डिग्री और 35 चक्र (160 बीपी) के लिए 30 डिग्री के लिए 72 डिग्री। WT1 की अभिव्यक्ति (विल्म का ट्यूमर-1 जीन) isoforms KTS ± और 17 AA ± (F 2- R2 प्राइमर 17 AA प्लस / - और F 3- R3 का पता लगाने के लिए KTS प्लस / -स्प्लिसिंग आइसोफॉर्म का पता लगाने के लिए) Oji et के अनुसार पारंपरिक PCR द्वारा किया गया था। अल (24)। -एक्टिन की अभिव्यक्ति का निर्धारण लक्सेट अल के अनुसार किया गया था। (25)। उत्पादों को केटीएस ± आइसोफॉर्म के लिए 10 प्रतिशत पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन और 17AA ± आइसोफॉर्म के लिए 2 प्रतिशत agarose जेल का उपयोग करके देखा गया था।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस।गुर्देएलपीएस-उपचारित चूहों और नियंत्रणों को 10 प्रतिशत फॉर्मेलिन में तय किया गया था और हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन धुंधला, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए संसाधित किया गया था।

WT1 का स्थान निर्धारित करने के लिए (विल्म का ट्यूमर-1 जीन) एलपीएस के साथ इलाज किए गए चूहों में, माइक्रोस्कोप स्लाइड पर लगाए गए वृक्क ऊतक के उम-मोटी वर्गों का उपयोग किया गया था। नमूनों को डीवैक्स किया गया था, ट्राइटन एक्स -100 [0.1 प्रतिशत ट्राइटन के साथ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 1 प्रतिशत सोडियम साइट्रेट के साथ पारगम्य किया गया था, और पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया था। ऊतकों को 30 मिनट के लिए पीबीएस में 20 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ अवरुद्ध किया गया था और WT1 के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ रातोंरात 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था।विल्म का ट्यूमर-1 जीन) sc{0}}(F-6)(सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, सांता क्रूज़, सीए, यूएसए) पीबीएस में 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम में 1:100 पतला। पीबीएस के साथ धोने के बाद, बकरी विरोधी माउस आईजीजी टेक्सास रेड एससी -2979 (सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी) के साथ धुंधला होकर बाध्य एंटीबॉडी की उपस्थिति की पहचान की गई। स्लाइड्स को 4',6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोल से उलट दिया गया था। अंत में, स्लाइड्स को माउंट किया गया और 40 × पानी के विसर्जन उद्देश्य और फ्लुव्यू 4.0a सॉफ्टवेयर (ओलिंप, टोक्यो, जापान) के साथ एक ओलिंप BX61W1 कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गुणात्मक रूप से जांच की गई।

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। फॉस्फोराइलेटेड (p)-WT1(विल्म का ट्यूमर-1 जीनएलपीएस-उपचारित चूहों से पोडोसाइट्स में, पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी से पी-डब्ल्यूटी1 (विल्म का ट्यूमर-1 जीन) सेरीन 393, sc-12933 और 363, sc-12934-R(सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, डलास, TX, USA） का उपयोग किया गया। वृक्क ऊतक के 4- μm वर्गों वाली स्लाइड्स को डीवैक्स किया गया और पारगम्य किया गया। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार यूनिवर्सल क्विक किट (वेक्टर लेबोरेटरीज, बर्लिंगम, सीए, यूएसए) का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का प्रदर्शन किया गया था। स्लाइड्स की जांच 100 × तेल विसर्जन उद्देश्य (प्राइमो स्टार, कार्ल ज़ीस, जीएमबीएच, जर्मनी) के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके की गई थी। .

पश्चिमी धब्बा। कुल प्रोटीन को 200 उल लसीका बफर (1 प्रतिशत ट्राइटन, 150 मिमी NaCl, 25 मिमी ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.6) के साथ अलग किया गया था, और एकाग्रता को डीसी प्रोटीन परख किट (बायो-रेड) का उपयोग करके मापा गया था। प्रोटीन (50 कुरूप) को 12 प्रतिशत सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके अलग किया गया था और WT1 के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया था।विल्म का ट्यूमर-1 जीन) [F6] एंटीबॉडी sc-7585(सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी)। GAPDH (AB2302; सिग्मा, सैन लुइस, एमओ, यूएसए) का उपयोग करके नमूनों को सामान्य किया गया। लुमी-लाइट वेस्टर्न ब्लॉटिंग सिस्टम sc -2048 (सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी) का उपयोग करके प्रोटीन की कल्पना की गई थी।

सिस्टैंच का लाभ: किडनी की रक्षा करें

परिणाम

का प्रेरणगुर्दाक्षतिएलपीएस द्वारा बीएएलबी/सी चूहों में। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि पॉडोसाइट चोट बढ़ी हुई प्रोटीनूरिया से जुड़ी है। मूत्र में एल्ब्यूमिन और कुल प्रोटीन सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन और डीसी प्रोटीन परख किट (बायो-रेड) द्वारा निर्धारित किया गया था। एलपीएस उपचार के बाद मूत्र एल्ब्यूमिन की एक उल्लेखनीय वृद्धि (पी =0। 0 01) देखी गई, जिसमें अधिकतम 24 घंटे (215.87 ± 1.41 यूजी / एमएल-नियंत्रण की तुलना में) 15.53 ±5.0 ug/ml (चित्र 1A) कुल मूत्र प्रोटीन की सांद्रता 36 घंटे (26.02 ± 2.43 मिलीग्राम/एमएल) पर चरम पर देखी गई और नियंत्रण (पी =0 .01) की तुलना में काफी अधिक थी। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। एलपीएस द्वारा प्रेरित गुर्दे की क्षति का विश्लेषण ऊतक विज्ञान द्वारा किया गया था। उपचार के बाद 24 घंटे में, गुर्दे के ऊतकों में फोकल ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस देखा गया था, जिसमें 36 घंटे में सबसे बड़ी क्षति पाई गई थी, ग्लोमेरुलस के आकार में वृद्धि, मेसेंजियल के साथ कोशिका प्रसार 48 घंटे के बाद, ग्लोमेरुलस की एक क्रमिक वसूली 72 घंटे तक देखी गई, जैसा कि चित्र 1गमें दिखाया गया है।

चित्रा 1. गुर्दे पर प्रणालीगत सूजन का प्रभाव।लिपोपॉलेसेकेराइड के साथ इलाज किए गए चूहों में गुर्दे की क्षति के मार्कर के रूप में मूत्र एल्ब्यूमिन (ए) और मूत्र प्रोटीन (बी) की सांद्रता। सी: पुरानी सूजन के एक मॉडल की तुलना के साथ, लिपोपॉलेसेकेराइड इंजेक्शन के बाद अलग-अलग समय (12,24,36,48, और 72 घंटे) पर माउस (हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन धुंधला) के गुर्दे के ऊतक विज्ञान की एक प्रतिनिधि छवि, आवर्धन 100 ×। महत्वपूर्ण रूप से भिन्न: *n<><0,0]><0.00>

एलपीएस-उपचारित चूहों से सीरम में प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स टीएनएफए और आईएल1 का उत्पादन। एलपीएस द्वारा गुर्दे की क्षति की पुष्टि करने के लिए, प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स के स्तर को एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख द्वारा मापा गया था। TNFa और I1 की वृद्धि 12 घंटे (3.6 ± 0.9 एनजी / एमएल, 11.9 ± 5 एनजी / एमएल) और 36 घंटे (4.44 ± 0 .1 एनजी / एमएल, 18 के बाद देखी गई थी। ±0.9 एनजी/एमएल क्रमशः) एलपीएस के साथ उपचार, उसके बाद गिरावट शुरू (चित्रा 2ए और बी)। IL6 की अभिव्यक्ति 12 घंटे (49.5 एनजी/एमएल) और 36 घंटे (23.5 एनजी/एमएल) के उपचार के बाद बढ़ाई गई, जो नियंत्रण (चित्रा 2सी) से काफी अधिक है।

चित्रा 2. प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफए) के स्तरों का समय पाठ्यक्रम।(ए), इंटरल्यूकिन 1 (एलएल1) (बी), और आईएल6 (सी) सीरम में लिपोपॉलेसेकेराइड के इंट्रापेरिटोनियल प्रशासन के बाद चूहों से। यहां महत्वपूर्ण रूप से भिन्न: *p 0 से कम या बराबर।05,**p 0.01 से कम या बराबर और ***p 0.001 से कम या उसके बराबर .

LPS- उपचारित चूहों से गुर्दे के ऊतकों में WTI जीन अभिव्यक्ति। हमारे केंद्रीय प्रश्न का उत्तर देने के लिए कि क्या WT1(विल्म का ट्यूमर-1 जीन) को भड़काऊ प्रक्रिया द्वारा संशोधित किया गया था, और इसका गुर्दे पर प्रभाव था, WT1 की कुल अभिव्यक्ति (विल्म का ट्यूमर-1 जीन) जीन सूजन के दौरान अलग-अलग समय पर प्रणालीगत सूजन वाले चूहों से गुर्दे के नमूनों में निर्धारित किया गया था। डब्ल्यूटी1(विल्म का ट्यूमर-1 जीन) एमआरएनए हर समय नियंत्रण के संबंध में विश्लेषण किया गया था, 36 एच पर सबसे कम सापेक्ष अभिव्यक्ति के साथ और 12 घंटे में उच्चतम प्रणालीगत सूजन के शामिल होने के बाद जैसा कि चित्र 3ए में दिखाया गया है। इसके अलावा, यह निर्धारित किया गया था कि क्या एल.पी. पीसीआर द्वारा आइसोफॉर्म के एक्सॉन 5 (17 एए ±) और डब्ल्यूटीआई के केटीएस ± की अभिव्यक्ति का प्रेरित संशोधन। डेटा से पता चला है कि इन आइसोफोर्मों की अभिव्यक्ति का कोई विनियमन नहीं था क्योंकि एलपीएस (चित्रा 3 बी) द्वारा प्रेरित प्रणालीगत भड़काऊ प्रक्रिया के दौरान उपचार के बिना नियंत्रण समूह के समान व्यवहार देखा गया था। WT1 प्रोटीन को पूरे भड़काऊ प्रक्रिया में कमी करने के लिए पश्चिमी सोख्ता द्वारा दिखाया गया था, उपचार के बाद 36 घंटे में मामूली वसूली के साथ, हालांकि, WT1 की मात्रा अनुपचारित नियंत्रण (चित्रा 3सी और डी) की तुलना में कम थी।

चित्रा 3. प्रणालीगत सूजन के साथ चूहों से गुर्दे के ऊतकों में विल्म्स'ट्यूमर I (WT1) जीन अभिव्यक्ति पर लिपोपॉलीसेकेराइड (LPS) का प्रभाव।ए: डब्ल्यूटीआई एमआरएनए की सापेक्ष अभिव्यक्ति। बी: आइसोफोर्म्स की सापेक्ष अभिव्यक्ति केटीएस ± और डब्ल्यूटी1.सी के 17आईएए ±: एलपीएस उपचार के बाद इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा डब्ल्यूटीआई प्रोटीन का स्तर और डी: डब्ल्यूटी1 के लिए इम्युनोब्लॉटिंग का घनत्व। महत्वपूर्ण रूप से अलग: ** पी कम 0 से या उसके बराबर।01 और ***p 0.001 से कम या उसके बराबर,

एलपीएस-उपचारित चूहों की किडनी बायोप्सी में डब्ल्यूटीआई का फास्फोराइलेशन और स्थानीयकरण। WTI प्रोटीन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल मॉड्यूलेशन में एक महत्वपूर्ण घटना अमीनो एसिड 393 का फॉस्फोराइलेशन है, जो प्रोटीन के साइटोप्लाज्म में विस्थापन को प्रेरित करता है। LPS से उपचारित चूहों से गुर्दे के नमूनों में WT1 का फॉस्फोराइलेशन और स्थानीयकरण निर्धारित किया गया था। WT1 के फॉस्फोराइलेशन का विश्लेषण हिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा किया गया था, जो प्रणालीगत सूजन के शामिल होने के बाद 12 घंटे से शुरू होने वाले गुर्दे के ऊतकों के वर्गों में कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में फॉस्फोराइलेटेड WT1 की उपस्थिति को दर्शाता है और 72 घंटे तक बनाए रखा जाता है। WT1 को अमीनो एसिड 393 और 363 में फॉस्फोराइलेट किया गया था। जैसा कि चित्र 4क में दिखाया गया है। WT1 प्रोटीन के स्थान का विश्लेषण इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया गया था। एलपीएस-उपचारित चूहों से गुर्दे के नमूनों में पोडोसाइट्स में डब्ल्यूटी1 का स्थान मुख्य रूप से साइटोप्लाज्मिक था, जबकि नियंत्रण नमूनों से पोडोसाइट्स में, स्थान स्पष्ट नहीं था (चित्र 4बी)।

चित्रा 4. फॉस्फोराइलेशन और लिपोपॉलेसेकेराइड-उपचारित चूहों से गुर्दे के नमूनों में विल्म्स'ट्यूमर I (WTI) का स्थानीयकरण।ए: फॉस्फोराइलेटेड (पी) -डब्ल्यूटीआई के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला हो जाना, एलपीएस प्रशासन (प्रकाश माइक्रोस्कोप पर आवर्धन 100 ×) के बाद सेरीन 393 और 363 में फॉस्फोराइलेटेड में वृद्धि दिखा रहा है। बी: गुर्दे में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा डब्ल्यूटीआई का स्थानीयकरण; लिपोपॉलीसेकेराइड के प्रशासन के बाद WT1 (वर्गों) 36 घंटे के मामूली परमाणु स्थानीयकरण को दर्शाने वाले उदाहरण (कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर आवर्धन 40 ×)। DAP1: 4, 6- डायमिडीनो -2- फेनिलइंडोल।

एलपीएस-उपचारित चूहों से गुर्दे में डब्ल्यूटीआई और नेफ्रिन की अभिव्यक्ति का मॉड्यूलेशन। सेल में WT1 स्थान इसकी जैविक गतिविधि को प्रभावित करता है। यह बताया गया है कि साइटोप्लाज्मिक WT1 ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि नहीं करता है; इस कारण से, डब्ल्यूटी1 और नेफ्रिन एमआरएनए की अभिव्यक्ति का विश्लेषण पीसीआर द्वारा एलपीएस (चित्रा 5ए) के साथ इलाज किए गए चूहों से गुर्दे के नमूनों में किया गया था। पीसीआर ने नेफ्रिन एमआरएनए में 24 से 48 घंटे की कमी का संकेत दिया, 72 घंटे (चित्रा 5 बी) की वृद्धि के साथ। ), जबकि डब्ल्यूटीआई एमआरएनए की अभिव्यक्ति 12 घंटे में बढ़ी और उसके बाद सूजन और गुर्दे की क्षति (24 और 36 घंटे) और (चित्रा 5बी) के महत्वपूर्ण घंटों के दौरान गिरावट आई।

चित्रा 5. नेफ्रिन (एनपीएचएस 1) और विल्म्स'ट्यूमर 1 (डब्ल्यूटी1) एमआरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण।ए: एमआरएनए अभिव्यक्ति के विश्लेषण में, लिपोपॉलेसेकेराइड का उपयोग करके प्रणालीगत सूजन के शामिल होने के बाद एनपीएचएसआई और डब्ल्यूटीआई 24,36 और 48 घंटे में कम हो गए। बी: डेंसिटोमेट्री द्वारा ए में दिखाए गए बैंड की मात्रा और ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज के लिए अभिव्यक्ति द्वारा सामान्यीकृत।

TNFa और IL1 के साथ इलाज किए गए किडनी एक्सप्लांट्स WTI और नेफ्रिन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करते हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या साइटोकिन्स WT1 की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करते हैं, गुर्दे के अन्वेषकों को सुसंस्कृत किया गया और साइटोकिन्स TNFa और IL1 के साथ 6,12, और 24 घंटे के लिए PCR द्वारा WT1 और नेफ्रिन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए इलाज किया गया। नेफ्रिन mRNA की अभिव्यक्ति में कमी आई और TNFa और ILlb (चित्र 6) के साथ इलाज किए गए गुर्दे की खोज में WTI mRNA की अभिव्यक्ति 24 घंटे तक बढ़ गई।

चित्रा 6. गुर्दे की खोज में नेफ्रिन (एनपीएचएस 1) और विल्म्स'ट्यूमर 1 (डब्ल्यूटी1) एमआरएनए की अभिव्यक्ति का विश्लेषण।ए: ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ) के 10 एनजी / एमएल, और इंटरल्यूकिन 16 (आईएल 16) बी के 20 एनजीएलएमएल के संपर्क में गुर्दे की खोज में अलग-अलग समय पर एनपीएचएसआई और डब्ल्यूटीआई के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तर: डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग करके प्राप्त सापेक्ष अभिव्यक्ति संकेत उत्पाद। बैंड को ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज के सामान्यीकरण द्वारा निर्धारित किया गया था।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा गुर्दे की खोज में डब्ल्यूटीआई का स्थानीयकरण। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या टीएनएफए और आईएल डब्ल्यूटी 1 प्रोटीन के स्थानीयकरण में बदलाव के लिए जिम्मेदार थे, माउस किडनी खोजकर्ताओं को टीएनएफए और एल 1 और एलपीएस के साथ 24 घंटे के लिए इलाज किया गया था। ILlb और LPS के साथ इलाज किए गए अन्वेषकों में, WTl प्रोटीन का एक नाभिक / साइटोप्लाज्मिक स्थानीयकरण स्पष्ट था, और TNFa के साथ इलाज किए गए अन्वेषकों में, WT1 प्रोटीन का साइटोप्लाज्मिक स्थानीयकरण देखा गया था; इस बीच, अनुपचारित नियंत्रणों में, मुख्य रूप से WT1 का परमाणु स्थानीयकरण देखा गया (चित्र 7)।

चित्र 7. रेड TX (WT1) और 4',6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोल (DAPI)(नाभिक) का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा विल्म्स'ट्यूमर 1 (WTI) प्रोटीन का किडनी एक्सप्लांट्स से इलाज किए गए पोडोसाइट्स में स्थानीयकरण एल 0 ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (TNFa) के एनजी / एमएल, इंटरल्यूकिन 16 (एल 1 बी) के 20 एनजी / एमएल, और लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) के साथ।IL1 और LPS उपचार के तहत WTI के परमाणु / साइटोप्लाज्मिक स्थानीयकरण की तुलना में TNFa के साथ इलाज किए गए खोजकर्ताओं में दिखाए गए WTas के कम परमाणु स्थानीयकरण। आवर्धन, 40×.

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