प्रीकंडीशनिंग-एक्टिवेटेड AKT MDM2-p53 पाथवे के माध्यम से इस्किमिया के लिए न्यूरोनल टॉलरेंस को नियंत्रित करता हैⅡ

3. चर्चा

हमारे परिणामों से पता चलता है कि PI3K / AKT सिग्नलिंग पाथवे का IPC-मध्यस्थता सक्रियण प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में MDM2-p53 कॉम्प्लेक्स को नियंत्रित करके न्यूरोनल IT को ट्रिगर करता है। हमने सबसे पहले मान्य IPC प्रायोगिक मॉडल का उपयोग करके न्यूरोप्रोटेक्शन [33,39-41] के संदर्भ में पूर्व शर्त की दक्षता की पुष्टि की।

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हमने पाया कि एक छोटे (20 मिनट) ऑक्सीजन और ग्लूकोज की कमी (OGD) से प्रेरित प्रायोगिक IPC के बाद 2 घंटे के पुनर्संयोजन के परिणामस्वरूप न्यूरोप्रोटेक्शन हुआ, जैसा कि न्यूरोनल एपोप्टोसिस और कैसपेज़ -3 सक्रियण दोनों की रोकथाम द्वारा दिखाया गया है। ओजीडी (90 मिनट) के बाद 4 घंटे का पुनर्ऑक्सीकरण (ओजीडी/आर)। हम दिखाते हैं कि IPC कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में कस्पासे -3 सक्रियण को कम करता है, जो बाद के और अधिक गंभीर इस्केमिक अपमान के बाद कम एपोप्टोसिस के साथ संबंध रखता है।

इस्किमिया [3,33,38,42-44] के बाद न्यूरोनल उत्तरजीविता सुनिश्चित करने के लिए प्रो- और एंटीपैप्टोटिक संकेतों के बीच संतुलन मौलिक है। यद्यपि इस तरह की घटनाओं की प्रासंगिकता विवो स्ट्रोक मॉडल [43,45] में रक्तस्रावी और इस्केमिक दोनों में दिखाई गई है, लेकिन इन सिग्नलिंग मार्गों को विनियमित करने वाले तंत्र को अभी तक इस्केमिक सहिष्णुता के संदर्भ में पूरी तरह से समझा नहीं गया है। एंटीपैप्टोटिक AKT और इसके संबंधित मार्गों की भूमिका का व्यापक रूप से कैंसर कोशिकाओं [46,47] और मस्तिष्क के ऊतकों [38,48] में अध्ययन किया गया है; हालाँकि, अब तक, इस्केमिक चोट के खिलाफ IPC-मध्यस्थता वाले न्यूरोनल सहिष्णुता में AKT / MDM2-p53 सिग्नलिंग मार्ग की भूमिका मायावी बनी हुई है।

यहाँ, हमने पाया कि IPC की वजह से PI3K/AKT सिग्नलिंग पाथवे की सक्रियता Ser166 पर MDM2 के फॉस्फोराइलेशन को बढ़ावा देती है, जो इसके परमाणु अनुवाद और प्रोटीन स्थिरीकरण को ट्रिगर करती है, जिससे कस्पासे -3 सक्रियण के माध्यम से p 53-प्रेरित एपोप्टोसिस को रोका जा सकता है। इस्किमिया के बाद। फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से AKT की सक्रियता न्यूरोनल उत्तरजीविता [24,49] को बढ़ावा देती है और आईटी [25,50] को शामिल करने में योगदान कर सकती है। हमारे परिणाम बताते हैं कि AKT प्रोटीन की सापेक्ष प्रचुरता इस्कीमिक या पूर्व शर्त उत्तेजनाओं के तहत अपरिवर्तित है। दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया कि Ser473 पर AKT के शुरुआती PI3K-मध्यस्थता वाले फास्फोराइलेशन पूर्वनिर्मित न्यूरॉन्स में इस्किमिया-प्रेरित p53 स्थिरीकरण को रोकता है।

प्रभाव p53 mRNA स्तर [33,34,44] में संशोधनों के कारण नहीं था, लेकिन OGD/R से पहले IPC के कारण p53 प्रोटीन स्तरों में कमी आई थी। चूँकि MDM2 p53 स्थिरीकरण का मुख्य नियामक है और AKT का प्रत्यक्ष लक्ष्य भी है, हमारे परिणाम ischemia के लिए न्यूरोनल सहिष्णुता में AKT / MDM2-p53 सिग्नलिंग मार्ग की भूमिका को इंगित करते हैं। MDM2 mRNA OGD [34] के बाद तेजी से बढ़ता है, लेकिन MDM2 गतिविधि मुख्य रूप से पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों, विशेष रूप से फॉस्फोराइलेशन [51] द्वारा नियंत्रित होती है। इसके साथ अच्छे समझौते में, हमने पाया कि एक बार IPC के बाद फॉस्फोराइलेशन द्वारा सक्रिय, AKT, बदले में, अवशेष Ser166 पर MDM2 को फॉस्फोराइलेट करता है, जो परमाणु स्थानीयकरण संकेत [52] के पास स्थित है, और यह प्रभाव OGD/R चोट के बाद भी बना रहता है।

हमारे परिणाम बताते हैं कि Ser166 पर MDM2 का फॉस्फोराइलेशन p53 अस्थिरता के माध्यम से IPC की मध्यस्थता वाले न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव को बढ़ाने के लिए पर्याप्त है। इस प्रकार, यहाँ, हमने इस्केमिक चोट के बाद AKT / MDM2-p53 मार्ग के समय-निर्भर सक्रियण की पहचान की और, वास्तव में, हम प्रदर्शित करते हैं कि IPC- सक्रिय AKT ने एक्टोपिक MDM2 के साथ-साथ अंतर्जात प्रोटीन स्थिरीकरण के परमाणु अनुवाद को ट्रिगर किया।

इसके अलावा, AKT नाभिक के भीतर सक्रिय रहता है, जहां PI3K भी ऑक्सीडेटिव तनाव के जवाब में माइग्रेट कर सकता है और फिर AKT फॉस्फोराइलेशन [53] के लिए जिम्मेदार हो सकता है। AKT या AKT नॉकडाउन के PI3K-मध्यस्थता वाले फॉस्फोराइलेशन का निषेध साइटोप्लाज्म में MDM2 प्रोटीन की अवधारण को बढ़ावा देता है, और यह MDM2 के Ser166 फॉस्फोराइलेशन को रोकता है, साथ ही इस्किमिया-प्रेरित न्यूरोनल एपोप्टोसिस के खिलाफ IPC-मध्यस्थता न्यूरोप्रोटेक्शन को रोकता है। इसके विपरीत, हमने दिखाया कि सक्रिय AKT परमाणु MDM2 प्रोटीन को बांधता है।

परिणामस्वरूप, सक्रिय AKT MDM2 के फॉस्फोराइलेशन और इसके परमाणु स्थिरीकरण दोनों को बढ़ावा देता है, जो IPC-मध्यस्थता वाले न्यूरोप्रोटेक्शन में योगदान करते हैं। हमारे परिणामों से पता चलता है कि IPC- प्रवर्तित न्यूरोप्रोटेक्शन PI3K-मध्यस्थता AKT सक्रियण पर निर्भर था, जो Ser166 में MDM2 को फॉस्फोराइलेट करता था, एक इस्कीमिक अपमान के बाद MDM2 परमाणु संचय को बढ़ावा देता था।

तदनुसार, Wortmannin द्वारा PI3K/AKT का निषेध या siRNA द्वारा AKT की कमी ने IPC-प्रवर्तित न्यूरोप्रोटेक्शन को समाप्त कर दिया, जिससे p53 स्थिरीकरण और बाद में इस्किमिया के बाद न्यूरोनल एपोप्टोसिस हो गया। इसलिए, हमारे परिणाम इस्केमिक चोट के खिलाफ न्यूरोनल उत्तरजीविता में AKT-MDM2 मार्ग के IPC-निर्भर सक्रियण की आवश्यक भूमिका को स्पष्ट करने में मदद करते हैं।

p53 प्रोटीन स्ट्रोक के रोगियों [34,42,54] के साथ-साथ TIA के रोगियों [3] में न्यूरोनल मृत्यु/जीवित रहने के पूर्वानुमान के नियंत्रण में शामिल है। P53 स्थिरीकरण ischemia/reperfusion चोट [33] के लिए पूर्व शर्त-मध्यस्थता न्यूरोप्रोटेक्शन से समझौता करता है। इसलिए, MDM2-p53 इंटरेक्शन इस संदर्भ में न्यूरोनल उत्तरजीविता के लिए महत्वपूर्ण होगा [34] और इस्केमिक चोट के खिलाफ IPC-मध्यस्थता सहिष्णुता के लिए [33]।

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>MDM2 प्रमोटर में G MDM2 की अभिव्यक्ति को निर्धारित करता है और बदले में, स्ट्रोक [34] से पीड़ित रोगियों की वसूली को नियंत्रित करता है।

इसके अतिरिक्त, हमने देखा कि एक Tp53 जीन SNP (rs1042522) माइटोकॉन्ड्रियल p53 स्थिरीकरण और इस्किमिया के लिए न्यूरोनल सहिष्णुता को संशोधित करता है जबकि स्ट्रोक [3] से पहले TIA से पीड़ित रोगियों की कार्यात्मक वसूली की भविष्यवाणी करता है। इसलिए, IPC के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव को सुनिश्चित करने के लिए p53 एपोप्टोटिक मार्गों का नियंत्रण आवश्यक होगा।

ये परिणाम अध्ययन के लिए एक ट्रांसलेशनल दृष्टिकोण प्रदान करते हैं जो भविष्य में रोगियों के लाभ के लिए लागू किया जा सकता है, और वे इस्केमिक स्ट्रोक में पूर्व शर्त-प्रचारित आईटी रणनीतियों के लिए एक आवश्यक लक्ष्य के रूप में PI3K/AKT-MDM2-p53 सिग्नलिंग मार्ग को प्रस्तुत करते हैं। सारांश में, हम प्रदर्शित करते हैं कि IPC-वर्धित PI3K / AKT सिग्नलिंग मार्ग, Ser166 पर MDM2 के फॉस्फोराइलेशन को बढ़ावा देता है, जिससे MDM2 परमाणु अनुवाद और इसका स्थिरीकरण होता है, जो p53 अस्थिरता को बढ़ावा देकर न्यूरोनल IT को ट्रिगर करता है और इस्केमिक अपमान के बाद प्रेरित एपोप्टोटिक मृत्यु को निष्क्रिय करता है।

हमारे परिणाम IPC की मध्यस्थता वाले न्यूरोनल टॉलरेंस में AKT के शुरुआती सक्रियण के संभावित लाभों को उजागर करते हैं, जो इस्केमिक चोट के तहत MDM2-p53 एपोप्टोटिक मार्ग को नियंत्रित करता है। ये निष्कर्ष आईटी से संबंधित विकारों के लिए उपन्यास न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियों को विकसित करने के लिए न्यूरोनल AKT-MDM2-p53 सिग्नलिंग मार्ग को विनियमित करने वाले तंत्र को समझने के अवसर पर प्रकाश डालते हैं।

4. सामग्री और तरीके

4.1। कॉर्टिकल न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृतियां

न्यूरोनल कल्चर C57Bl/6J या p53-null (Tp53−/−, B6.129S2, जैक्सन प्रयोगशाला) माउस भ्रूण (14.5E) कॉर्टिस से तैयार किए गए थे। न्यूरॉन्स को 1.8 × 105 कोशिकाओं/सेमी2 पर 2 प्रतिशत बी27 और 2 एमएम ग्लूटामाइन (इंविट्रोजन, मैड्रिड, स्पेन) के साथ पूरक एक न्यूरोबेसल माध्यम में बीजित किया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र 5 प्रतिशत सीओ 2- युक्त वातावरण में ऊष्मायन किया गया था। 55]।

4.2। ऑक्सीजन ग्लूकोज की कमी और प्रीकंडीशनिंग मॉडल

इन विट्रो (DIV) में 9-1 {{1 0}} दिनों के बाद, एक इनक्यूबेटर में 90 मिनट के लिए 37 ◦C पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करके न्यूरॉन्स को ऑक्सीजन और ग्लूकोज की कमी (OGD) के संपर्क में लाया गया। एक एयरलॉक से लैस है और लगातार 95 प्रतिशत N2/5 प्रतिशत CO2 से गैसस किया जाता है। ऊष्मायन माध्यम (ग्लूकोज के बिना बफ़र हैंक्स का समाधान: 5.26 मिमी KCl, 0.43 मिमी KH2PO4, 132.4 मिमी NaCl, 4.09 मिमी NaHCO3, 0.33 मिमी Na2HPO4, 2 मिमी CaCl2, और 20 मिमी HEPES, पीएच 7.4) पहले 95 प्रतिशत N2 के साथ गेस किया गया था /5 प्रतिशत CO2 30 मिनट के लिए। इन शर्तों के तहत, इनक्यूबेशन माध्यम में ऑक्सीजन सांद्रता 6.7 ± 0.5 माइक्रोएम थी जैसा कि क्लार्क-प्रकार ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड [56,57] के साथ मापा गया था।

संकेत दिए जाने पर, बाद के लंबे समय तक इस्किमिया (OGD, 90 मिनट) और 4 घंटे पुनः ऑक्सीकरण (IPC प्लस OGD/R) (चित्र S1B) से पहले न्यूरॉन्स को इस्केमिक प्रीकंडीशनिंग (IPC; 20 मिनट के लिए लघु OGD के बाद 2 h पुनर्संयोजन के बाद) से अवगत कराया गया था। ). समानांतर में, न्यूरॉन्स को नॉर्मोक्सिया (Nx) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 95 प्रतिशत हवा/5 प्रतिशत CO2 या इस्केमिक प्रीकंडीशनिंग (IPC) के आर्द्र वातावरण में ऊष्मायन किया गया था। संकेत दिए जाने पर, वोर्टमैनिन (100 एनएमओएल/एल) की अनुपस्थिति या उपस्थिति में बफर्ड हैंक्स सॉल्यूशन (पीएच 7.4) में आईपीसी से 30 मिनट पहले न्यूरॉन्स को इनक्यूबेट किया गया था, जैसा कि पहले बताया गया है [19]।

4.3। सेल संक्रमण

न्यूरॉन्स (8 DIV) या HEK -293 T कोशिकाओं को MDM2 मानव प्रमोटर से YFP-टैग किए गए MDM2 को व्यक्त करने वाले प्लाज्मिड वेक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। MDM2p/MDM2-YFP Uri Alon & Galit Lahav (Addgene प्लाज्मिड # 53962, वाटरटाउन, MA, USA) [58] की ओर से एक उपहार था। जब आवश्यक हो, एक खाली वेक्टर (pYFP) का उपयोग समान स्थितियों में नियंत्रण के रूप में किया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, प्लास्मिड अभिकर्मक को लिपोफ़ेक्टामाइन® एलटीएक्स (इंविट्रोजन, कार्ल्सबैड, एमए, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था। कोशिकाओं को प्लाज्मिड वैक्टर के 1.5 μg/μL के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और 24 घंटे के बाद उपयोग किया गया।

6 DIV न्यूरॉन्स में AKT नॉकडाउन को छोटे दखल देने वाले डबल-स्ट्रैंडेड राइबोन्यूक्लियोटाइड्स (siRNA) के साथ ट्रांसफ़ेक्शन द्वारा प्राप्त किया गया था। लक्षित अनुक्रम इस प्रकार थे: 50-CUCAAGUACUCAUUCCAGAt–30, एंटीसेन्स: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (माउस, s62216, न्यूक्लियोटाइड 1006-1025 के अनुरूप, जेनबैंक परिग्रहण संख्या NM_009652) [59]। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हमने साइलेंसर ™ सेलेक्ट नेगेटिव कंट्रोल नंबर 1 siRNA (siControl) का उपयोग किया। सभी siRNAs को Ambion®, Invitrogen®, और Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Germany) से खरीदा गया था। प्रोटीन नॉकडाउन की डिग्री के अनुसार, ट्रांसफ़ेक्शन के 3 दिनों के बाद siRNA के ट्रांसफ़ेक्शन की दक्षता 70-80 प्रतिशत होने का अनुमान लगाया गया था। साइलेंसिंग प्रयोगों के लिए, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, न्यूरॉन्स को Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen) का उपयोग करके siRNA (10 nM) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। न्यूरॉन्स को उनके उपयोग से पहले 72 घंटे के लिए एक न्यूरोबेसल माध्यम में ऊष्मायन किया गया था।

4.4। एपोप्टोटिक सेल डेथ का फ्लो साइटोमेट्रिक डिटेक्शन

पीबीएस (पीएच 7.4) में 1 मिमी ईडीटीए टेट्रासोडियम नमक का उपयोग करके प्लेटों से न्यूरॉन्स को सावधानी से अलग किया गया था और एनेक्सिन वी / एपीसी और 7- एएडी के साथ दाग दिया गया था, जैसा कि पहले वर्णित [55] किया गया था।

4.5। कस्पासे -3 गतिविधि परख

Caspase -3 गतिविधि का मूल्यांकन सेल lysates [33] में किया गया था और निर्माता के निर्देशों के अनुसार SIGMA से फ्लोरोमेट्रिक परख किट CASP3F का उपयोग किया गया था और 405 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर उत्सर्जन पर पढ़ा गया था। विधि फ्लोरोसेंट 7-एमिनो4-मिथाइल कूमेरिन (एएमसी) अंश की रिहाई पर आधारित है। एएमसी एकाग्रता की गणना एएमसी मानक का उपयोग करके की जाती है।

4.6। इम्युनोब्लॉट्स और सह-इम्युनोप्रेवेरेशन परख

न्यूरॉन्स 1 प्रतिशत एसडीएस, 2 एमएम ईडीटीए, 150 एमएम NaCl, 12.5 एमएम Na2HPO4, और 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 (एनपी 40: 1 प्रतिशत एनपी 40, ईडीटीए डीके प्लस 5 एमएम, ट्रिस पीएच {{13) वाले बफर में लिसेड थे। }} मिमी, NaCl 135 मिमी, और 10 प्रतिशत ग्लिसरॉल) फॉस्फेट अवरोधकों (1 मिमी Na3VO4 और 50 मिमी NaF) और प्रोटीज अवरोधकों (100 मिमी फेनिलमिथाइलसल्फोनील फ्लोराइड, 50 µg/mL एंटी-पेपैन, 50 µg/mL पेप्सटिन, 50 के साथ पूरक µg/mL अमास्टैटिन, 50 µg/एमएल ल्यूपेप्टिन, 50 µg/एमएल बेस्टैटिन, और 50 µg/एमएल सोयाबीन ट्रिप्सिन अवरोधक), 30 मिनट के लिए बर्फ पर संग्रहीत और 5 मिनट के लिए उबला हुआ । लाइस्ड अर्क के एलिकोट्स को एसडीएस पॉलीएक्रिलामाइड जेल (मिनीप्रोटियन®, बायो-रेड) के अधीन किया गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एंटीबॉडी के साथ ब्लॉट किया गया। एंटी-एकेटी (9272), एंटी-पी (सेर473) एकेटी (9271), एंटी-क्लीवेड कास्पेज़ -3 (Asp175, 9661) (सेल सिग्नलिंग, डेनवर, एमए, यूएसए), एंटी-पी53 ( 554157, BD Biosciences), एंटी-MDM2 (2A10, ab -16895), एंटी (Ser166) MDM2 (ab131355), एंटी-GFP (ab290; YFP का भी पता लगाता है) (Abcam, Cambridge, UK), एंटी-LAMIN बी (एससी -374015, सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, हीडलबर्ग, जर्मनी), और एंटीजीएपीडीएच (एम्बियन, कैम्ब्रिज, यूके) रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर। हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (पियर्स, थर्मो साइंटिफिक) या बकरी विरोधी माउस आईजीजी (बायो-रेड) के साथ ऊष्मायन के बाद, झिल्लियों को तुरंत कोडक के संपर्क में आने से पहले 5 मिनट के लिए बढ़ाया रसायन विज्ञान सुपरसिग्नल वेस्ट ड्यूरा (पियर्स) के साथ ऊष्मायन किया गया था। XAR -5 फिल्म 1 से 5 मिनट के लिए और ऑटोरेडियोग्राम स्कैन किए गए। ImageJ 1.48v सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके बैंड की तीव्रता की मात्रा निर्धारित की गई थी, जैसा कि पहले बताया गया है [60]।

सह-इम्युनोप्रेवेरेशन परख के लिए, ऊपर वर्णित फॉस्फेट अवरोधकों के साथ पूरक 50 मिमी ट्रिस (पीएच 7.5), 150 मिमी NaCl, 2 मिमी EDTA, 1 प्रतिशत एनपी -40) ​​युक्त बर्फ-ठंडे बफर में न्यूरॉन्स को लिस किया गया था। अपकेंद्रित्र द्वारा मलबे को साफ करने के बाद, न्यूरोनल लाइसेट्स (100 मिलीग्राम) को 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 1 मिलीग्राम एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया, इसके बाद 4 घंटे में 2 घंटे के लिए 10 एमएल प्रोटीन ए-एग्रोस (जीई हेल्थकेयर लाइफ साइंसेज) जोड़ा गया। ◦सी। Immunoprecipitates को बड़े पैमाने पर lysis बफर से धोया गया और SDS-PAGE द्वारा हल किया गया और संकेतित एंटीबॉडी [61] के साथ इम्युनोब्लॉट किया गया। रिश्तेदार प्रोटीन बहुतायत चित्र S1 में दिखाए गए हैं। पूर्ण धब्बा और जेल स्कैन चित्र S3 में शामिल हैं।

4.7। इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और छवि विश्लेषण

न्यूरॉन्स को ग्लास कवरस्लिप्स पर उगाया गया और 30 मिनट के लिए 4 प्रतिशत (w/v, पीबीएस में) पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया और खरगोश विरोधी फॉस्फोएकेटी (सेर 473; 9271; सेल सिग्नलिंग, एमए, यूएसए), माउस एंटी-एमडीएम 2 (2ए10) के साथ प्रतिरक्षित किया गया। एबी -16895), माउस एंटी-एमएपी2 (1:500; एम#1406, सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) [55], माउस एंटी-पी53 (1:200; 554157, बीडी फार्मिंगन , सैन डिएगो, सीए, यूएसए), और एंटी-जीएफपी (1:1000; ab290; वाईएफपी का पता लगाने के लिए भी मान्य)। इम्यूनोलेबलिंग का पता माध्यमिक एंटीबॉडी एंटी-खरगोश आईजीजी-साइ3 ​​या एंटी-माउस आईजीजी-साइ2 (1: 500; जैक्सन इम्यूनो रिसर्च। कैम्ब्रिज, यूके) का उपयोग करके लगाया गया था।

नाभिक 40, 6- डायमिडीनो -2 फेनिलिंडोल (डीएपीआई; डी 9542, सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ दागदार थे। Coverslips को धोया गया, ग्लास स्लाइड्स पर SlowFade लाइट एंटीफेड रिएजेंट (Invitrogen) में लगाया गया, और एक माइक्रोस्कोप (Nikon इनवर्टेड माइक्रोस्कोप एक्लिप्स Ti-E, (NY, USA) का उपयोग करके जांच की गई, जो 40× ऑब्जेक्टिव, एक प्री-सेंटर्ड फाइबर इलुमिनेटर Nikon Intensilight से लैस है। C-HGFI, और एक ब्लैक-एंड-व्हाइट चार्ज-युग्मित डिवाइस डिजिटल कैमरा Hamamatsu ORCAER या एक स्कैनिंग लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोप ("स्पिनिंग डिस्क" रोपर साइंटिफिक ओलंपस IX81, टोक्यो, जापान) तीन लेजर 405, 491, और 561 एनएम के साथ, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग और डिवाइस डिजिटल कैमरा इवॉल्व फोटोमेट्रिक्स के लिए 40×, 63×, और 100× PL Apo तेल-विसर्जन उद्देश्य से सुसज्जित है।

सभी माइक्रोस्कोप सेटिंग्स को संतृप्ति के नीचे फ्लोरोसेंट छवियों को इकट्ठा करने के लिए सेट किया गया था और प्रयोग में ली गई सभी छवियों के लिए स्थिर रखा गया था। छवियों का विश्लेषण ImageJ 1.48v सॉफ़्टवेयर (राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान) के साथ किया गया था। P(Ser473) AKT प्लस और p53 प्लस न्यूरॉन्स का प्रतिशत और p(Ser473) AKT और p53 की अधिकतम प्रोटीन प्रतिदीप्ति तीव्रता का परिमाण चित्र S2A में दिखाया गया है। एमडीएम 2- जीएफपी-ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स में, एमडीएम 2- जीएफपी के न्यूक्लियोसाइटोप्लास्मिक वितरण की गणना अंतर्जात एमडीएम2 के साइटोप्लास्मिक माध्य प्रतिदीप्ति के लिए परमाणु माध्य प्रतिदीप्ति के अनुपात के रूप में की गई थी, जिसे 24 न्यूरॉन्स (प्रति छह न्यूरॉन्स) में मापा गया था। चार अलग-अलग न्यूरोनल संस्कृतियों में स्थिति) (चित्र S2B) [62]।

अंतर्जात MDM2 धुंधला और pSer473AKT की अधिकतम परमाणु प्रतिदीप्ति तीव्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 40 न्यूरॉन्स (चार अलग-अलग संस्कृतियों में प्रति स्थिति 10 न्यूरॉन्स) मापा गया (चित्र S2C), जैसा कि पहले वर्णित है [44]। चित्रा 5बी में दिखाए गए प्रतिनिधि क्रॉस-सेक्शनल इंटेंसिटी प्रोफाइल में, प्रत्येक स्थिति के नीचे दर्शाए गए p(Ser473)AKT और MDM2 का प्रतिशत परमाणु माध्य प्रतिदीप्ति के रूप में निर्धारित किया गया था। सभी मामलों में, डीएपीआई धुंधला द्वारा नाभिक की पहचान की गई थी। Wortmannin या siAkt के साथ इलाज किए गए न्यूरॉन्स में अधिकतम परमाणु MDM2 प्रतिदीप्ति तीव्रता चित्र S2D में दिखाई गई है।

4.8। सांख्यिकीय विश्लेषण

प्रायोगिक परिणामों का मूल्यांकन विचरण के एकतरफा विश्लेषण द्वारा किया गया, इसके बाद बोन्फेरोनी पोस्ट हॉक टेस्ट किया गया, जिसका उपयोग कई समूहों के बीच मूल्यों की तुलना करने के लिए किया गया। परिणाम ± SEM के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। छात्रों के टी-टेस्ट का उपयोग मूल्यों के दो समूहों के बीच तुलना के लिए किया गया था। सभी मामलों में, p <0.05 को महत्वपूर्ण माना गया (* p <0.05 बनाम Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

कैसे Cistanche न्यूरॉन्स की रक्षा करता है?

यह सुझाव देने के लिए कुछ सबूत हैं कि Cistanche एपोप्टोसिस (क्रमादेशित कोशिका मृत्यु) को कम करके और न्यूरोनल उत्तरजीविता को बढ़ावा देकर न्यूरॉन्स की रक्षा कर सकता है। एपोप्टोसिस एक प्राकृतिक प्रक्रिया है जो शरीर में क्षतिग्रस्त या अवांछित कोशिकाओं को हटाने के लिए होती है, लेकिन यह अत्यधिक या अनुपयुक्त होने पर हानिकारक हो सकती है। प्रयोगशाला अध्ययनों में सिस्टैंच को एपोप्टोसिस को रोकने के लिए पाया गया है, और यह प्रभाव न्यूरॉन्स को नुकसान से बचाने में मदद कर सकता है।

इसके अलावा, Cistanche में कई बायोएक्टिव यौगिक होते हैं जिन्हें न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, इसमें इचिनेकोसाइड होता है, जो न्यूरॉन्स को ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन से बचाने के लिए दिखाया गया है। इसमें एक्टियोसाइड भी होता है, जिसमें एंटी-इंफ्लेमेटरी और एंटीऑक्सीडेंट गुण पाए जाते हैं।

संदर्भ

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