SLC37A2, एक फॉस्फोरस-संबंधित अणु, कैल्सीफाइड एओर्मा में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में वृद्धि करता है

संवहनी कैल्सीफिकेशनका एक प्रमुख स्रोत हैहृदवाहिनी रोगक्रोनिक किडनी रोग के रोगियों में.हाइपरफोस्फेटेमियाइससे इंट्रासेल्युलर फॉस्फोरस का प्रवाह बढ़ जाता है, जिससे संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में ऑस्टियोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं में वृद्धि होती है। PiT-1 संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में फॉस्फेट को स्थानांतरित करता है। हालाँकि, संवहनी कैल्सीफिकेशन का तंत्र पूरी तरह से समझा नहीं गया है। इस अध्ययन में PiT के अलावा अन्य उम्मीदवार फॉस्फोरस-संबंधित अणुओं की जांच की गई। हमने अनुमान लगाया कि फॉस्फोरस से संबंधित अणु संबंधित हैंविलेय-वाहक(एसएलसी) सुपरफैमिली संवहनी कैल्सीफिकेशन में शामिल होगी। डीएनए माइक्रोएरे विश्लेषण के परिणामस्वरूप, हमने SLC37A2 पर ध्यान केंद्रित किया और दिखाया कि इन कोशिकाओं की mRNA अभिव्यक्ति कैल्सीफाइड महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (AoSMC) पर बढ़ गई। बताया गया है कि SLC37A2 ग्लूकोज़ -6-फॉस्फेट/फॉस्फेट और फॉस्फेट/फॉस्फेट विनिमय दोनों का परिवहन करता है। इन विट्रो विश्लेषण से पता चला कि SLC37A2expression AoSMC पर सूजन से प्रभावित नहीं था। कैल्सीफाइड AoSMC में SLC37A2 mRNA और प्रोटीन की अभिव्यक्ति बढ़ गई। विवो में, विश्लेषण से पता चला कि महाधमनी में SLC37A2 mRNA अभिव्यक्तिदीर्घकालिक वृक्क रोगचूहों का संबंध ओस्टोजेनिक मार्कर जीन से था। इसके अलावा, SLC37A2 को संवहनी कैल्सीफिकेशन क्षेत्र में व्यक्त किया गया थाक्रोनिक किडनी रोग चूहों. परिणामस्वरूप, हमने दिखाया कि SLC37A2 उन अणुओं में से एक है जो बढ़ते हैंसंवहनी कैल्सीफिकेशनइन विट्रो और विवो में।

मुख्य शब्द: SLC37A2,संवहनी कैल्सीफिकेशन, महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं,दीर्घकालिक वृक्क रोग, हाइपरफोस्फेटेमिया

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जितनी संख्या में मरीज हैंदीर्घकालिक वृक्क रोग(सीकेडी) बढ़ी, मरीजों की संख्याडायलिसिस की आवश्यकता हैभी बढ़ेगा. सबसे ज्यादा मौतें इलाजरत मरीजों की हो रही हैंडायलिसिसके कारणहृदय रोगजैसे किहृदय की विफलता, मस्तिष्कवाहिकीय विकार, या रोधगलन। (,2) का एक प्रमुख स्रोतहृदवाहिनी रोगएक्टोपिक कैल्सीफिकेशन (एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन) नरम ऊतकों में कैल्शियम फॉस्फेट क्रिस्टल के निर्माण और जमाव के कारण होने वाली एक असामान्यता है। (4 6) सूजन जैसे विभिन्न कारक। ऑक्सीडेटिव तनाव, और प्लाज्मा कैल्शियम (सीए) और फॉस्फोरस (पी) के स्तर में वृद्धि संवहनी कैल्सीफिकेशन की प्रगति में शामिल है। इन कारकों में, हाइपरफोस्फेटेमिया सबसे अधिक दृढ़ता से संवहनी कैल्सीफिकेशन से जुड़ा हुआ है। (7.8) हाइपरफोस्फेटेमिया गुर्दे की कार्यक्षमता में कमी की उपस्थिति में पी के अधिक सेवन के कारण होता है। इसलिए, डायलिसिस से गुजरने वाले रोगियों को पी का सेवन सीमित करने की आवश्यकता है। (79-12) हालांकि, यह बताया गया है किसंवहनी कैल्सीफिकेशनडायलिसिस शुरू होने पर पहले से ही प्रगति हो रही है; यह शुरुआती चरण के सीकेडी वाले रोगियों में भी देखा गया है जब हाइपरफोस्फेटेमिया स्पष्ट नहीं होता है। (3) परिणामस्वरूप, जीवन पूर्वानुमान को बेहतर बनाने के लिए प्रारंभिक चरण के सीकेडी वाले रोगियों में संवहनी कैल्सीफिकेशन को रोकना महत्वपूर्ण है।

जिससे संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (वीएसएमसी) में पी का प्रवाह बढ़ जाता है। पी इनफ़्लक्स वीएसएमसी की कोशिका झिल्ली सतह पर एक ट्रांसपोर्टर PiT-1 के माध्यम से किया जाता है। PiT- विलेय-वाहक (SLC) सुपरफैमिली का एक सदस्य है, जिसमें SLC20A1.04 PiT द्वारा एन्कोड किया गया एक सोडियम फॉस्फेट ट्रांसपोर्टर शामिल है - Na-निर्भर कोशिका झिल्ली में फॉस्फेट का परिवहन करता है और बाद में ऊंचे पी स्तरों के कारण मैट्रिक्स खनिजकरण करता है) इंट्रासेल्युलर के रूप में पी स्तर बढ़ता है, वीएसएमसी ओस्टोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों को व्यक्त करना शुरू कर देता है, जैसे कि रंट-संबंधित ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 2 (रनएक्स 2) (16) इस प्रभाव के बाद ऑस्टियोब्लास्ट-विशिष्ट जीन, जैसे ऑस्टियोपोन्ट और ओस्टियोकैल्सिन की अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है। इसके अलावा, चिकनी मांसपेशी-विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति कम हो गई। जैसे कि चिकनी मांसपेशी प्रोटीन 22-0 (एसएम22-0), होता है। परिणामस्वरूप, वीएसएमसी ऑस्टियोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं में बदल जाता है। (1718)हाल के नैदानिक ​​अध्ययनों से पता चला है कि रक्त में कैल्शियम का स्तर। प्रोटीन कण (सीपीपी), जो कैल्शियम फॉस्फेट कोलाइडल कणों का प्रतिनिधित्व करते हैं, गुर्दे की कार्यक्षमता कम होने के साथ बढ़ते हैं। (19-21)इसके अलावा, रक्त सीपीपी और पी स्तरों के साथ सहसंबंध की सूचना दी गई है।2o2i) यह संभव है कि सीपीपी संवहनी कैल्सीफिकेशन की प्रगति को गति प्रदान कर सकता है।22-24)

हालाँकि, सामान्य प्लाज्मा पी स्तर वाले प्रारंभिक चरण के सीकेडी वाले रोगियों में संवहनी कैल्सीफिकेशन देखा गया है। (13) इसके अलावा.PiT-1 mRNA सभी ऊतकों में सर्वव्यापी रूप से व्यक्त होता है। इस प्रकार एक अन्य अणु मुख्य रूप से संवहनी कैल्सीफिकेशन के क्षेत्र में कार्य कर सकता है। ऐसी खबरें हैं किसूजनसंवहनी कैल्सीफिकेशन को बढ़ावा देता है। सूजन कारक जैसे कि इंटरल्यूकिन (IL) {{0} B, IL -6, और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (TNF-a) ने VSMC को ऑस्टियोब्लास्ट-जैसी कोशिकाओं (2s26) में विभेदित किया, TNF-a संवहनी कैल्सीफिकेशन को प्रेरित करता है सीएमपी मार्ग के माध्यम से, जो ऑस्टियोब्लास्ट भेदभाव में भूमिका निभाता है।2728) आईएल-6 वीएसएमसी के संवहनी कैल्सीफिकेशन के लिए अग्रणी विभिन्न मार्गों को नियंत्रित करता है2-31) इसके अलावा। IllB, IL-6, और TNF-a भी उच्च पी स्तरों से प्रेरित बढ़े हुए संवहनी कैल्सीफिकेशन से जुड़े कारक हैं।3233) हालाँकि। वर्तमान डेटा संवहनी तंत्र की पूरी तरह से व्याख्या नहीं करता है

इन कारकों से प्रेरित कैल्सीफिकेशन। हमने अनुमान लगाया कि एसएलसी सुपरफैमिली जैसे अन्य पी-संबंधित अणु भी हो सकते हैं, जो संवहनी कैल्सीफिकेशन में शामिल हैं। हमने एसएलसी सुपरफैमिली में झिल्ली प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित किया और संवहनी कैल्सीफिकेशन में भागीदारी के लिए पीआईटी -1 के अलावा संभावित उम्मीदवार पी-संबंधित अणुओं की जांच की। इसके अलावा, हमने वीडियो और विवो में उम्मीदवार अणुओं और संवहनी कैल्सीफिकेशन के बीच संबंध की जांच की।

सामग्री और तरीके

कोश पालन। सामान्य ह्यूमनऑर्टिक्समूथमसल सेल (एओएसएमसी) लोन्ज़ा (बेसल, स्विट्जरलैंड) से प्राप्त किए गए थे, एओएसएमसी को निर्माता के निर्देशों के अनुसार संवर्धित किया गया था। AoSMC को एक विकास माध्यम (5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), एपिडर्मल वृद्धि कारक, इंसुलिन, फ़ाइब्रोब्लास्ट वृद्धि कारक-बी, और जेंटामाइसिन/एम्फोटेरिसिन-बी के साथ पूरक चिकनी मांसपेशी कोशिका बेसल माध्यम) में बनाए रखा गया था। हर दूसरे दिन मीडिया बदल दिया जाता था. AoSMC को 37 डिग्री पर आर्द्रीकृत 5% CO इनक्यूबेटर में उगाया गया और संगम तक पहुंचने तक बनाए रखा गया और फिर प्रयोगों में उपयोग किया गया।

जैसा कि पहले वर्णित है, एओएसएमसी का कैल्सीफिकेशन प्रेरित किया गया था। 435) एओएसएमसी को डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम में 15% एफबीएस और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ संवर्धित किया गया और 3, 6, 9, 12 और 14 दिनों के लिए 2.6 एमएम पी के साथ संवर्धित किया गया। P सांद्रता को P बफरNaH, PO/Na, और HPO द्वारा समायोजित किया गया था। पीएच 7.2). अन्य AoSMCs को 2.6 mM P के साथ सुसंस्कृत नहीं किया गया।

डीएनए माइक्रोएरे. 2.6 एमएम पी के साथ संवर्धित और असंवर्धित एओएसएमसी नमूनों के कुल आरएनए का उपयोग किया गया। डीएनए माइक्रोएरे (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, टोक्यो। जापान) का उपयोग करके कुल आरएनए 5. 0 यूजी का विश्लेषण किया गया था। SurePrint G3 ह्यूमन GE 8 x 60k ver। 2 माइक्रोएरे का उपयोग लगभग 26,{9}} जीनों की जांच के लिए किया गया था। अनुपात की गणना 12 दिनों के लिए 2.6 एमएम के साथ संवर्धित एओएसएमसी के अभिव्यक्ति स्तर को 2.6 एमएम पी के साथ गैर-संवर्धित एओएसएमसी के अभिव्यक्ति स्तर से विभाजित करके की गई थी।

डीएनए माइक्रोएरे

2.6 एमएम पी के साथ संवर्धित और असंवर्धित एओएसएमसी नमूनों के कुल आरएनए का उपयोग किया गया। डीएनए माइक्रोएरे (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, टोक्यो। जापान) का उपयोग करके कुल आरएनए 5. 0 यूजी का विश्लेषण किया गया था। SurePrint G3 ह्यूमन GE 8 x 60k ver। 2 माइक्रोएरे का उपयोग लगभग 26,{9}} जीनों की जांच के लिए किया गया था। अनुपात की गणना 12 दिनों के लिए 2.6 एमएम के साथ संवर्धित एओएसएमसी पर अभिव्यक्ति स्तर को 2.6 एमएम पी के साथ गैर-सुसंस्कृत एओएसएमसी पर अभिव्यक्ति स्तर से विभाजित करके की गई थी। संवहनी सूजन में एसएलसी37ए2 की अभिव्यक्ति। एओएसएमसी में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए, कोशिकाओं को विकास माध्यम के साथ संवर्धित किया गया जब तक कि वे संगम तक नहीं पहुंच गए और फिर 24 और 72 के लिए 1 यूजीएमएल लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) (एस्चेरिचिया कोली ओ 111: बी 4; सिग्मा, सेंट लुइस, एमओ से एलपीएस) के साथ इलाज किया गया। 2.6 एमएम पी. अन्य एओएसएमसी को वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) विश्लेषण के साथ सुसंस्कृत नहीं किया गया था। 24 और 72 घंटों के लिए एलपीएस से उपचारित एओएसएमसी से कुल आरएनए निकाला गया और एलपीएस से उपचारित नहीं की गई कोशिकाओं से। एसवाईबीआर ग्रीन-आधारित मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर को एस्टेपवनप्लस वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, फोस्टरसिटी, सीए) के साथ प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए संश्लेषित सीडीएनए और एक उपयुक्त प्राइमर सेट का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया था। प्राइमर अनुक्रम इस प्रकार थे: मानव IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' और 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; मानव SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' और 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- और 5-CTTCTGGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 और SLC37A2 mRNA अभिव्यक्ति स्तर की गणना GAPDH के साथ सामान्यीकरण के बाद की गई। कैल्सीफाइड में SLC37A2 की अभिव्यक्ति एओएसएमसी। 2.6 एमएम पी के साथ संवर्धित नहीं किए गए एओएसएमसी से कुल निकाले गए और 3, 6, 9, 12 और 14 दिनों के लिए 2.6 एमएम पी के साथ संवर्धित एओएसएमसी कोशिकाएं। संश्लेषित सीडीएनए का उपयोग करके वास्तविक समय पीसीआर का प्रदर्शन किया गया। प्राइमर अनुक्रम इस प्रकार थे इस प्रकार है: मानव Runx2, {{64}TGAGAGCCGCTTCCAACCC-3', और 5-CTCTGGCTTTGGAAGAGCCG-3। APPH के साथ सामान्यीकरण के बाद Runx2 और SLC37A2 mRNA अभिव्यक्ति स्तर की गणना की गई।

वेस्टर्न ब्लॉटिंग विश्लेषण.

वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली समान परिस्थितियों में सुसंस्कृत एओएसएमसी नमूनों से कुल प्रोटीन एकत्र किया गया था। इन नमूनों को 5% एनपी -40 और 1% प्रोटीज़ इनहिबिटर कॉकटेल के साथ पूरक ट्रिस-बफ़र्ड सेलाइन (पीएच 75) का उपयोग करके लाइज़ किया गया था। प्रोटीन सांद्रता के नमूनों को बीसीए प्रोटीन परख किट (थर्मो फिशरसाइंटिफिक.वालथम, एमए) का उपयोग करके मापा गया था। और सांद्रता को वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा समायोजित किया गया था, सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके 10% पॉलीएक्रिलामाइड जेल में 10 ग्राम प्रोटीन को अलग किया गया था। झिल्ली को प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में SLC37A2एंटीबॉडी (नोवस बायोलॉजिकल, सेंटेनियल, CO) या GAPDH एंटीबॉडी (GeneTex, Irvine, CA) के साथ इलाज किया गया था, और द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में Rabbit lgG हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित एंटीबॉडी (R&D सिस्टम, मिनियापोलिस, MN) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। और एमर्सहैम ईसीएल सेलेक्ट (जीई हेल्थकेयर, बकिंघमशायर, इंग्लैंड) और ल्यूमिनसेंट इमेज एनालाइजर (एलएएस -1000 प्लस, फनीफिल्म, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके कल्पना की गई। बैंड को एलमैजेल का उपयोग करके परिमाणित किया गया था।

प्रयोगात्मक

सभी अध्ययन प्रोटोकॉल को ह्योगो विश्वविद्यालय, मानव विज्ञान और पर्यावरण स्कूल की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। बारह सप्ताह के नर, स्प्रैग-डावले चूहों को जापान एसएलसी (शिज़ुओका, जापान) से खरीदा गया था। चूहों को {{3}प्रकाश, 12-घंटा अंधेरे चक्र (09:00-21:00) पर रखा गया और उन्हें भोजन और अतिरिक्त-शुद्ध पानी तक मुफ्त पहुंच की अनुमति दी गई।

प्रयोगात्मक आहार में एक नियंत्रण पी आहार (1.0% पी, 0.6सीए, 20% प्रोटीन), एक एडेनिन आहार ({{8%).75% एडेनिन शामिल है , 1। .6% Ca, 10%प्रोटीन), और एक उच्च-P (HP) आहार (1.0% P, 0.6% Ca, 10% प्रोटीन) जो AIN93-G आहार (ओरिएंटल) पर आधारित है यीस्ट, टोक्यो, जापान) प्रोटीन स्रोत के रूप में कैसिइन के साथ। 3637) एडेनिन-प्रेरित गुर्दे की विफलता वाले चूहों में संवहनी कैल्सीफिकेशन को बढ़ावा देने के लिए कम प्रोटीन आहार की सूचना दी गई है, इसलिए प्रोटीन प्रतिबंध लगाया गया था। 3738) समूह बनाने से पहले, सभी चूहों (एन)=23) को अनुकूलन के लिए एक सप्ताह तक मानक एमएफ आहार (ओरिएंटल यीस्ट) खिलाया गया। 13 सप्ताह की उम्र में, चूहों को 2 समूहों में विभाजित किया गया था: नियंत्रण समूह (एन=5) और एडेनिन-प्रेरित सीकेडी समूह (एन=18)। नियंत्रण समूह को 6 सप्ताह के लिए नियंत्रण पी आहार प्राप्त हुआ . एडेनिन-प्रेरित सीकेडी समूह को लगभग 3 सप्ताह तक एडेनिन आहार प्राप्त हुआ और फिर इसे 2 उपसमूहों में विभाजित किया गया: सीकेडी-एलपी समूह (एन=8) या सीकेडीएचपी समूह (एन=10)। सीकेडी-एलपी समूह और सीकेडी-एचपी समूह के चूहों को प्रयोगात्मक अवधि के दौरान क्रमशः 3 सप्ताह के लिए एलपी आहार और एचपी आहार प्राप्त हुआ, भोजन का सेवन दैनिक दर्ज किया गया। एडेनिन आहार के दौरान, दूसरे सप्ताह तक सप्ताह में एक बार सुबह 10:46 बजे से सुबह 11:48 बजे के बीच पूंछ की नस से रक्त के नमूने एकत्र किए गए, और उसके बाद प्लाज्मा स्तर की निगरानी के लिए हर 2 दिन में एक बार। एलपी आहार या एचपी आहार के दौरान, सप्ताह में एक बार रक्त के नमूने एकत्र किए जाते थे। मूत्र के नमूने एकत्र किए गए और हर सप्ताह एक बार मूत्र की मात्रा दर्ज की गई। आइसोफ्लुरेन (वाको प्योर केमिकल इंडस्ट्रीज। ओसाका जापान) और लैपरोटॉमी का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटिक देकर बलि दी गई। विश्लेषण के लिए अवर वेना कावा और थोरैकोएब्डॉमिनल महाधमनी से लिए गए रक्त के नमूने एकत्र किए गए।

महाधमनी पर SLC37A2 अभिव्यक्ति.

एकत्र किए गए थोरैकोएब्डॉमिनल महाधमनी का लगभग एक-तिहाई हिस्सा कैल्सीफिकेशन की कल्पना करने और इम्यूनोस्टेनिंग करने के लिए उपयोग किया गया था। महाधमनी को पैराफिन में एम्बेडेड किया गया था और um अनुभागों को काट दिया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार कैल्शियम किट (पॉलीसाइंसेज। वॉरिंगटन, पीए) के लिए वॉन कोसा विधि का उपयोग करके अनुभागों को दाग दिया गया था। इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण धारावाहिक अनुभागों के साथ किया गया था। अनुभागों को रात भर 4 डिग्री पर SLC37A2 एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया और फिर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए हिस्टोफाइन सिंपल स्टेन रैट MAX-POMULTI) (निचिरेई बायोसाइंसेज, टोक्यो, जापान) के साथ इलाज किया गया। इसके बाद, अनुभागों को डीएबी सब्सट्रेट किट (निचिरेई) के साथ इलाज किया गया।

जमे हुए थोरैकोपेट महाधमनी के बाकी हिस्सों से कुल आरएनए निकाला गया। संश्लेषित सीडीएनए का उपयोग करके वास्तविक समय पीसीआर का प्रदर्शन किया गया। प्राइमर अनुक्रम इस प्रकार थे: चूहा ऑस्टियो-पोंटिन,5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' और 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' और; चूहा SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' और 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3। GAPDH के साथ सामान्यीकरण के बाद ऑस्टियोपॉन्टिन mRNA और SLC37A2 mRNA अभिव्यक्ति स्तर की गणना की गई

सांख्यिकीय विश्लेषण।

डेटा को माध्य + एसई के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। टी-टेस्ट का उपयोग करके समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण किया गया। फॉस्फेट-प्रेरित कैल्सीफाइड एओएसएमसी प्रयोगों में, डननेट की विधि के बाद भिन्नता के एक-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग करके मतभेदों का विश्लेषण किया गया। सीकेडी मॉडल प्रयोगों में, स्टील-डवास विधि के बाद के रस्कल-वालिस परीक्षण का उपयोग करके मतभेदों का विश्लेषण किया गया। स्पीयरमैन के सहसंबंध गुणांक रैंक परीक्षण का उपयोग करके सहसंबंध गुणांक (आरएस) निर्धारित किए गए थे। सभी परीक्षणों के लिए. दो-पूंछ वाले पी मान<0.05 were considered statistically significant.