विट्रो में मानव प्राकृतिक खूनी कोशिकाओं पर कैल्सीट्रियोल एंटी-एजिंग प्रभावों का अध्ययन

अमूर्त

विटामिन डी को व्यापक रूप से प्रतिरक्षा प्रणाली पर एक नियामक प्रभाव माना जाता है। कुछ नैदानिक ​​जांच से पता चला है कि की मांगविटामिन डी उम्र के साथ बढ़ता है. कैल्सीट्रियोल का जैविक रूप से सक्रिय रूप हैविटामिन डी. हालाँकि, मानव प्राकृतिक हत्यारे (NK) कोशिकाओं पर इसका प्रभाव स्पष्ट नहीं है। इसलिए, इस अध्ययन में, हमने सहज प्रतिरक्षा में इसकी महत्वपूर्ण भूमिका का पता लगाने के लिए इम्यूनोलॉजिकल तरीकों की एक श्रृंखला का उपयोग करके एनके कोशिकाओं पर कैल्सिट्रिऑल के एंटी-एजिंग और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभावों की जांच की। हमने पाया कि कैल्सीट्रियोल ने एनके कोशिकाओं में उम्र बढ़ने से संबंधित बायोमार्कर की अभिव्यक्ति को उलट दिया और बिना किसी एपोप्टोसिस और थकावट के इन कोशिकाओं को जी1 चरण में बनाए रखते हुए उनके विस्तार को रोक दिया। कैल्सीट्रियोल ने सूजन-संबंधी साइटोकिन्स की रिहाई को दबा दिया, जैसे कि इंटरल्यूकिन -5 (आईएल -5), इंटरल्यूकिन -13 (आईएल -13), इंटरफेरॉन-गामा (आईएफएन-), और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (TNF-)। जब इन कोशिकाओं को K562 ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत किया गया था, तो NK कोशिकाओं के क्षरण को कैल्सीट्रियोल द्वारा डाउनग्रेड किया गया था। हमने यह भी पाया कि कैल्सिट्रिऑल ने उम्र बढ़ने से संबंधित सिर्टुइन 1- प्रोटीन/काइनेज आर-जैसे एंडोप्लाज़मिक रेटिकुलम किनेज (SIRT1/pERK) पाथवे और SIRT 1-deltaExon8 (SIRT1-∆Exon8) अभिव्यक्ति को अपग्रेड किया विटामिन डी रिसेप्टर (VDR) को सक्रिय करके। इसके अलावा, कैल्सीट्रियोल एनके सेल का एक संभावित नकारात्मक नियामक हो सकता हैएपोप्टोसिसऔरमाइटोकॉन्ड्रियल निष्क्रियताजिसके कारण होता हैऑक्सीडेटिव तनाव. इस प्रकार, कैल्सीट्रियोल प्रदर्शित करता हैबुढ़ापा विरोधी प्रभावSIRT 1-PERK अक्ष और को सक्रिय करके इन विट्रो में मानव NK कोशिकाओं परऑक्सीडेटिव जीर्णता का विरोध.

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1 परिचय

कई अध्ययनों में पाया गया है कि उम्र बढ़ने का कई बीमारियों पर सीधा प्रभाव पड़ता है, जैसे संक्रामक रोग, हृदय रोग, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, ऑटोइम्यून विकार और कैंसर। जीव की उम्र बढ़ने के साथ प्रतिरक्षाविहीनता होती है। उम्र बढ़ने की सामान्य विशेषताओं में मुख्य रूप से पुरानी कम सूजन [1], जीनोम अस्थिरता, प्रोटीन अभिव्यक्ति असंतुलन, माइटोकॉन्ड्रियल निष्क्रियता, सेलुलर जीर्णता, और अंतरकोशिकीय संचार में परिवर्तन [2] के साथ उम्र बढ़ने की सूजन शामिल है। सहज प्रतिरक्षा के मुख्य घटक के रूप में, एनके कोशिकाएं संक्रमण-रोधी और ट्यूमर-रोधी प्रभावों के साथ-साथ प्रतिरक्षा प्रणाली [3] के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। एनके कोशिकाएं किसी एंटीजन- या एंटीबॉडी-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं [4] को प्रदर्शित करने के बजाय सीधे या एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटोक्सिसिटी (एडीसीसी) के माध्यम से लक्ष्य कोशिकाओं को समाप्त कर सकती हैं। एनके कोशिकाएं अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं और ऑटोइम्यून बीमारियों [5] से भी जुड़ी हैं। जब प्रतिरक्षा प्रणाली वृद्ध हो रही है, सतह सक्रियण रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति जैसे प्राकृतिक हत्यारा समूह 2 सदस्य डी (एनकेजी2डी) [6], हत्यारा इम्यूनोग्लोबुलिन-जैसे रिसेप्टर (केआईआर), भेदभाव 57 (सीडी57) के सतह मार्कर क्लस्टर [7] , विभेदन 16 (CD16) [8] का एक समूह बढ़ा। यह अणु एनके कोशिकाओं के मारने के कार्य को सक्रिय कर सकता है, जिससे बुजुर्गों में सेलुलर असंतुलन और सूजन हो सकती है। इस बीच, प्राकृतिक हत्यारा समूह 2 सदस्य ए (एनकेजी2ए), प्राकृतिक हत्यारा समूह 2 सदस्य सी (एनकेजी2सी), और प्राकृतिक साइटोटोक्सिसिटी रिसेप्टर्स (एनसीआर) [6] जैसे एनके कोशिकाओं के निरोधात्मक अणु कम हो गए। एनके कोशिकाओं के अन्य उम्र बढ़ने से संबंधित मार्कर हैं टी सेल इम्युनोग्लोबुलिन और म्यूसिन डोमेन-युक्त प्रोटीन 3 (टीआईएम3) और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु -1 (पीडी -1) में वृद्धि हुई है। पीडी -1 और टीआईएम3 का प्रतिरक्षण के दौरान अपरेगुलेशन एनके कोशिकाओं के कार्यों को बाधित कर सकता है और एनके सेल की कमी [9] की ओर ले जाता है।

प्रतिरक्षाविहीनता के लिए अग्रणी एक अन्य कारक प्रतिरक्षा सूजन [10] है। एनके कोशिकाओं द्वारा जारी भड़काऊ साइटोकिन्स के उच्च स्तर को डीएनए क्षति, ऑक्सीडेटिव तनाव और सेल सेनेसेंस का कारण बताया गया है। इसके अलावा, एनके कोशिकाओं और सूजन की स्थिति के सेलुलर असंतुलन के परिणामस्वरूप ऑटोम्यून्यून बीमारी [11] हो सकती है। इंटरल्यूकिन -1 (IL-1), इंटरल्यूकिन -4 (IL-4), इंटरल्यूकिन -6 (IL-6), इंटरल्यूकिन के स्तर -10 (IL-10), और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (TNF-) बुजुर्ग लोगों में अधिक होते हैं [12]। हालांकि उम्र बढ़ने के साथ कुल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या में कमी आई, एनके सेल की आबादी में उल्लेखनीय वृद्धि हुई, जो भड़काऊ कोशिकाओं [13] की घुसपैठ के कारण हो सकती है।

विटामिन डी मानव शरीर में विटामिन डी2 (एर्गोकैल्सिफेरॉल) और विटामिन डी3 (कैल्सीट्रियोल) के रूप में दो सक्रिय रूपों में मौजूद होता है। विटामिन डी का प्राथमिक कार्य कैल्शियम और फास्फोरस के अवशोषण को बढ़ावा देना है। विटामिन डी प्रतिरक्षा कार्यों को भी नियंत्रित करता है [14]। हालांकि कई रिपोर्टों ने इसके संक्रमण-रोधी और ट्यूमर-रोधी कार्यों [15] पर ध्यान केंद्रित किया है, कैल्सीट्रियोल भी विरोधी भड़काऊ प्रभाव प्रदर्शित करता है [16]। विटामिन डी रिसेप्टर (वीडीआर) विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं [17] पर व्यक्त किया गया है। भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन में कमी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में कमी में योगदान करती है। Calcitriol को TNF-, इंटरल्यूकिन -1 (IL-1), इंटरल्यूकिन -2 (IL-2), इंटरफेरॉन-गामा (IFN-), और के उत्पादन को दबाने के लिए जाना जाता है। बी और टी कोशिकाओं में अन्य भड़काऊ साइटोकिन्स। यह आईएल -4 और आईएल -10 [18] जैसे विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स भी जारी कर सकता है और भड़काऊ सेल घुसपैठ [19] के खिलाफ स्वरभंग को नियंत्रित कर सकता है।

कैल्सिट्रियोल के एंटीऑक्सीडेंट गुण अवसाद, वसायुक्त यकृत रोग [20], हृदय रोग, और सूजन संबंधी अन्य बीमारियों में बताए गए हैं। उम्र बढ़ने के दौरान मुक्त कण और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) भी कोशिकाओं और ऊतकों में जमा हो जाती हैं। प्रकाशित आंकड़ों ने प्रदर्शित किया है कि ऑक्सीडेटिव तनाव कोशिकाओं [21] में विभिन्न प्रकार के सिग्नलिंग मार्गों को प्रभावित करता है, जिसमें SIRT1, माइटोजेन-एक्टिवेटेड प्रोटीन किनेज (MAPK), और परमाणु कारक-κB (NF-κB) मार्ग शामिल हैं। SIRT1 जीन को एक दीर्घायु जीन माना जाता है और इस जीन के दमन के परिणामस्वरूप प्रोटीन अभिव्यक्ति, कोशिका चक्र और चयापचय [22] से संबंधित विकार होते हैं। SIRT 1- ΔExon8 SIRT1 का एक नया आइसोफॉर्म है, जो स्तनधारियों में वैकल्पिक रूप से जुड़कर मौजूद है। SIRT 1- ΔExon8 को पूर्ण-लंबाई वाले SIRT1 [23] का सह-नियामक कारक भी माना जाता था।

अब तक, बहुत कम अध्ययन एनके कोशिकाओं पर उम्र बढ़ने और ऑक्सीडेटिव जीर्णता के प्रभावों पर ध्यान केंद्रित करते हैं। SIRT1-ΔExon8 पर कैल्सिट्रियोल के प्रभावों की रिपोर्ट भी नहीं की गई है। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य एनके कोशिकाओं की उम्र बढ़ने और ऑक्सीडेटिव जीर्णता पर कैल्सीट्रियोल के प्रभावों की जांच करना है, क्योंकि ये कोशिकाएं मानव जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली में एक केंद्रीय स्थान पर कब्जा कर लेती हैं।

2। सामग्री और विधि

2.1 सेल संस्कृति और अभिकर्मकों

तीन मानव परिधीय रक्त के नमूने दाताओं से प्राप्त किए गए थे जिनके पास कोई सक्रिय ऑटोइम्यून बीमारी, तीव्र या पुरानी सूजन की बीमारी, कैंसर या अन्य प्रतिरक्षा संबंधी बीमारियां नहीं थीं। दानदाताओं की उम्र 48 से 65 साल के बीच थी। परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (PBMCs) को लिम्फोप्रेप फिकोल का उपयोग करके अलग किया गया था। 37 डिग्री /5 प्रतिशत CO2 पर NK सेल कल्चर किट (MoreCell, शेन्ज़ेन, चीन) का उपयोग करके NK कोशिकाओं का विस्तार और रखरखाव किया गया।

2.2 फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण

72 घंटे के लिए कैल्सीट्रियोल के साथ इलाज के बाद, एनके कोशिकाओं को मानव-विरोधी FITC-CD3, PerCp-CD56, APC-CD16, PE-NKG2A, PE-TIM3, PE-PD1, और PE-KIR (बायोलेजेंड, कैलिफ़ोर्निया) के साथ दाग दिया गया। अमेरीका)। DxFLEX फ्लो साइटोमीटर (बेकमैन, कैलिफ़ोर्निया, यूएसए) का उपयोग करके सभी FACS assays का प्रदर्शन किया गया।

2.3 सेल विस्तार माप, साइटोकिन-रिलीज़िंग और सेल चक्र परख

सेल विस्तार एक सेल काउंटिंग किट -8 [24] (CCK8; बायोटाइम, शंघाई, चीन) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। एनके कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए कैल्सीट्रियोल के साथ इलाज किया गया था और साइटोकाइन-रिलीज़िंग परख के लिए सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था। लीजेंड प्लेक्स ह्यूमन इन्फ्लेमेशन पैनल (बायोलेजेंड, कैलिफोर्निया, यूएसए) का उपयोग करके साइटोकिन स्तरों की जांच की गई। सबसे पहले, साइटोकिन कैप्चर बीड्स को मानकों या नमूनों के साथ इनक्यूबेट किया गया और फिर बायोटिनाइलेटेड डिटेक्शन एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया। बायोटिनाइलेटेड डिटेक्शन एंटीबॉडी-बाइंडिंग सॉल्यूशन, स्ट्रेप्टाविडिन (एसए) -पीई, बाद में फ्लोरोसेंट सिग्नल [25] प्रदान करने के लिए जोड़ा गया था। इन संकेतों का तब FACS परख का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।

सेल चक्र को सेल साइकिल डिटेक्शन किट (बायोटाइम, शंघाई, चीन) का उपयोग करके मापा गया था। एनके कोशिकाओं को 72 घंटे के लिए कैल्सीट्रियोल के साथ इलाज किया गया। इन कोशिकाओं को 70 प्रतिशत बर्फ-ठंडे इथेनॉल में तय किया गया था और फिर राइबोन्यूक्लिज़ ए (आरनेज़ ए) और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) (बायोटाइम, शंघाई, चीन) [26] से रंगा गया था।

2.4 एनके सेल-किलिंग परख

मानव एरिथ्रोल्यूकेमिक कोशिकाएं, K562 कोशिकाएं (ATCC, वर्जीनिया, यूएसए), 15 मिनट के लिए 10 uM 3, 3 - डाइऑक्टाडेसिल-ऑक्साकार्बोसायनिन (DIOBeyotime, शंघाई, चीन) के साथ ऊष्मायन की गईं और फिर कैल्सीट्रियोल-उपचारित NK कोशिकाओं में जोड़ा गया। अलग-अलग अनुपात में (ई/टी'=1:1, 5:1 और 10:1) क्रमशः 4 घंटे के लिए (27]।

2.5 ऑक्सीडेटिव सेनेसेंस इंडक्शन और एक्स-गैल स्टेनिंग विश्लेषण

हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) का उपयोग कर इन विट्रो एनके सेल एजिंग मॉडल। कैल्सीट्रियोल के एंटी-ऑक्सीडेशन प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, एनके कोशिकाओं को पहले कैल्सीट्रियोल के साथ इलाज किया गया और फिर 24 घंटे के लिए 100 μM H2O2 के संपर्क में लाया गया। -galactosidase की गतिविधि को 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactopyranoside (X-gal) धुंधला का उपयोग करके मापा गया था। इलाज की गई कोशिकाओं को 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया और 37 डिग्री [28] पर रातोंरात -गैलेक्टोसिडेस धुंधला समाधान (बायोटाइम, शंघाई, चीन) के साथ दाग दिया गया। दाग वाली कोशिकाओं को तब पीबीएस में निलंबित कर दिया गया था और इन कोशिकाओं की छवियों को लीका प्रतिदीप्ति उलटा माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। प्रत्येक समूह के लिए 40 × आवर्धन पर विभिन्न स्थितियों से तीन सूक्ष्म चित्र बेतरतीब ढंग से एकत्र किए गए थे। X-gal-stained कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना की गई और ImageJ सॉफ्टवेयर V.1.45S का उपयोग करके कोशिकाओं की उम्र बढ़ने का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया।

2.6 माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का धुंधला और विश्लेषण

माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का आकलन करने के लिए क्लोरोमेथिल-एक्स-रोसामाइन (CMXRos) और होचस्ट (बायोटाइम, शंघाई, चीन) का उपयोग किया गया था। सेल नाभिक (नीला) Hoechst धुंधला द्वारा स्थित थे, जबकि माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता फ्लोरोसेंट डाई, CMXRos को दर्शाते हुए माइटोकॉन्ड्रियल विशिष्टता द्वारा निर्धारित की गई थी। Hoechst प्लस CMXRos- कोशिकाओं (सफेद तीरों द्वारा चिह्नित) ने कम गतिविधि दिखाई। CMXRos-पॉजिटिव कोशिकाओं [29] द्वारा Hoechst पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके सापेक्ष प्रतिदीप्ति स्तर की गणना की गई थी। कोशिकाओं को 200 एनएम CMXRos और Hoechst (30 मिनट, 37 डिग्री) के साथ ऊष्मायन किया गया और 579 एनएम और 350 एनएम के उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर लीका उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पता लगाया गया। Hoechst plus CMXRos plus cells के प्रतिशत की गणना धारा 2.5 में वर्णित अनुसार की गई थी।

2.7 वेस्टर्न ब्लॉटिंग

कोशिकाओं को रेडियोइम्युनोप्रेवेरेशन परख (RIPA) लिसीज़ बफर (बायोटाइम, शंघाई, चीन) के साथ फ़ॉस्फ़ेटेज़ इनहिबिटर फ़ॉस्स्टॉप (रोचे, बेसल, स्विटज़रलैंड) और 1 μM फेनिलमिथाइलसल्फ़ोनील फ्लोराइड (PMSF) (बायोटाइम, शंघाई, चीन) का उपयोग करके lysed किया गया था। ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख किट (TAKARA, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके कुल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की गई थी। प्रोटीन के नमूनों को सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) द्वारा अलग किया गया और 0 .22 माइक्रोन पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली (इमोबिलोन-पी झिल्ली; मिलिपोर, मैसाचुसेट्स, यूएसए) में स्थानांतरित कर दिया गया। अवरुद्ध करने के बाद, झिल्लियों को प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जांचा गया और द्वितीयक एंटीबॉडी [30] के साथ ऊष्मायन किया गया। ओडिसी सिस्टम (LI-COR, नेब्रास्का, यूएसए) का उपयोग करके झिल्ली का पता लगाया गया।

2.8 सांख्यिकीय विश्लेषण

डेटा का विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म का उपयोग करके विचरण (ANOVA) के एक तरफ़ा विश्लेषण द्वारा किया गया था और इसे ± मानक विचलन (SD) के रूप में प्रस्तुत किया गया था। 6846 W. LI ET AL. अंतर को P <0.05 पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया। ग्राफपैड सॉफ्टवेयर का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण भी किया गया।

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