अमूर्त:सरकोपेनिया, जो उम्र बढ़ने के दौरान होता है, कंकाल की मांसपेशी द्रव्यमान और कार्य के क्रमिक नुकसान की विशेषता है, जिसके परिणामस्वरूप शारीरिक क्षमताओं में कार्यात्मक गिरावट आती है। सार्कोपेनिया की शुरुआत में कई कारक योगदान करते हैं, जिनमें पुनर्योजी क्षमता में कमी, पुरानी निम्न-श्रेणी की सूजन, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि शामिल है, जिससे कैटोबोलिक मार्गों का सक्रियण होता है। शारीरिक गतिविधि और पर्याप्त प्रोटीन का सेवन उम्र बढ़ने के दौरान मांसपेशियों की एनाबॉलिक प्रतिक्रिया में सुधार करने में लाभकारी प्रभाव डालकर सरकोपेनिया की घटनाओं और गंभीरता को कम करने में सक्षम प्रभावी रणनीति मानी जाती है। टॉरिन एक गैर-आवश्यक अमीनो एसिड है जो स्तनधारी ऊतकों और विशेष रूप से कंकाल की मांसपेशियों में अत्यधिक व्यक्त होता है, जहां यह जैविक प्रक्रियाओं के नियमन में शामिल होता है और जहां यह एक एंटीऑक्सिडेंट और विरोधी भड़काऊ कारक के रूप में कार्य करता है। यहां, हमने मूल्यांकन किया कि क्या बूढ़े चूहों में टॉरिन प्रशासन कंकाल की मांसपेशियों में उम्र बढ़ने के फिजियोपैथोलॉजिकल प्रभावों का प्रतिकार करता है। हमने दिखाया कि, घायल मांसपेशियों में, टॉरिन सूजन प्रतिक्रिया को कम करके और मांसपेशी फाइबर अखंडता को संरक्षित करके पुनर्योजी प्रक्रिया को बढ़ाता है। इसके अलावा, टॉरिन एक एंटीऑक्सीडेंट अणु के रूप में कार्य करते हुए, उचित सेलुलर रेडॉक्स संतुलन बनाए रखकर वृद्ध मांसपेशियों में आरओएस उत्पादन को कम करता है। यद्यपि कंकाल की मांसपेशी होमियोस्टैसिस पर टॉरिन के लाभकारी प्रभाव के लिए जिम्मेदार आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से स्पष्ट करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है, लेकिन ये आंकड़े दर्शाते हैं कि टॉरिन प्रशासन एक कुशल पुनर्योजी प्रक्रिया और सरकोपेनिया की शुरुआत से संबंधित कैटोबोलिक मार्गों के क्षीणन की अनुमति देते हुए सूक्ष्म वातावरण में सुधार करता है।

सिस्टैंच का ग्लाइकोसाइड हृदय और यकृत के ऊतकों में एसओडी की गतिविधि को भी बढ़ा सकता है, और प्रत्येक ऊतक में लिपोफसिन और एमडीए की सामग्री को काफी कम कर सकता है, विभिन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन रेडिकल्स (ओएच-, एच₂ओ₂, आदि) को प्रभावी ढंग से हटा सकता है और डीएनए क्षति से बचा सकता है। ओएच-रेडिकल्स द्वारा। सिस्टैंच फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स में मुक्त कणों की एक मजबूत सफाई क्षमता होती है, विटामिन सी की तुलना में उच्च कम करने की क्षमता होती है, शुक्राणु निलंबन में एसओडी की गतिविधि में सुधार होता है, एमडीए की सामग्री कम होती है, और शुक्राणु झिल्ली समारोह पर एक निश्चित सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है। सिस्टैंच पॉलीसेकेराइड डी-गैलेक्टोज के कारण प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों के एरिथ्रोसाइट्स और फेफड़ों के ऊतकों में एसओडी और जीएसएच-पीएक्स की गतिविधि को बढ़ा सकते हैं, साथ ही फेफड़ों और प्लाज्मा में एमडीए और कोलेजन की सामग्री को कम कर सकते हैं और इलास्टिन की सामग्री को बढ़ा सकते हैं। डीपीपीएच पर एक अच्छा सफाई प्रभाव, वृद्ध चूहों में हाइपोक्सिया का समय बढ़ाना, सीरम में एसओडी की गतिविधि में सुधार करना, और प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों में फेफड़ों के शारीरिक अध: पतन में देरी करना, सेलुलर रूपात्मक अध: पतन के साथ, प्रयोगों से पता चला है कि सिस्टैंच में अच्छी एंटीऑक्सीडेंट क्षमता है और त्वचा की उम्र बढ़ने वाली बीमारियों को रोकने और उनका इलाज करने के लिए एक दवा बनने की क्षमता रखती है। साथ ही, सिस्टैंच में इचिनाकोसाइड में डीपीपीएच मुक्त कणों को साफ़ करने की एक महत्वपूर्ण क्षमता है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को साफ़ करने और मुक्त कट्टरपंथी-प्रेरित कोलेजन गिरावट को रोकने की क्षमता है, और थाइमिन मुक्त कट्टरपंथी आयन क्षति पर भी अच्छा मरम्मत प्रभाव पड़ता है।

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1 परिचय

उम्र बढ़ने की विशेषता अंगों और ऊतकों के प्रमुख शारीरिक और जैव रासायनिक कार्यों की क्रमिक हानि है, और यह अक्सर कंकाल की मांसपेशियों और ताकत के प्रगतिशील नुकसान से जुड़ा होता है, एक स्थिति जिसे सरकोपेनिया के रूप में जाना जाता है [1]। सरकोपेनिया के लिए जिम्मेदार तंत्र को पूरी तरह से समझा नहीं गया है; फिर भी, यह संभवतः पुनर्योजी क्षमता [2,3], पुरानी सूजन [4,5], ऑक्सीडेटिव तनाव के बढ़े हुए स्तर [5,6] और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन [7] सहित बहुक्रियात्मक घटनाओं का परिणाम है।

मांसपेशी पुनर्जनन एक समन्वित प्रक्रिया है जिसमें उपग्रह कोशिकाएं, कंकाल की मांसपेशी के स्टेम सेल डिब्बे, क्षति पर ऊतक संरचना और कार्य को बनाए रखने और संरक्षित करने के लिए सक्रिय होते हैं [8]।

पुनर्योजी प्रक्रिया के पहले चरण में बाह्य कोशिकीय कैल्शियम के प्रवाह के कारण मायोफाइबर नेक्रोसिस की विशेषता होती है, जिससे मायोफाइब्रिल्स का प्रोटियोलिसिस होता है [9,10]। इस घटना के परिणामस्वरूप एक विशिष्ट सूजन प्रतिक्रिया सक्रिय हो जाती है जो विभिन्न सूजन कोशिका आबादी द्वारा मांसपेशियों पर क्रमिक आक्रमण की ओर ले जाती है [11]। भड़काऊ प्रतिक्रिया के बाद उपग्रह कोशिका सक्रियण और पुनर्जीवित फाइबर का निर्माण होता है, जो विशिष्ट केंद्रीकृत नाभिक [12,13] द्वारा रूपात्मक रूप से भिन्न होते हैं। हालाँकि, उम्र बढ़ने या रोग संबंधी स्थितियों के मामले में एक कुशल पुनर्योजी कार्यक्रम गंभीर रूप से प्रभावित हो सकता है, और विस्तारित फ़ाइब्रोटिक ऊतक का गठन कार्यात्मक हानि में योगदान कर सकता है [14,15]। इसके अलावा, वृद्ध कंकाल की मांसपेशियों के वातावरण में सूजन संबंधी साइटोकिन्स, वृद्धि कारकों और चयापचय संकेतों में परिवर्तन, मायोफाइबर चोट पर उपग्रह कोशिका प्रसार और/या सक्रियण को प्रभावित कर सकता है [16]। वास्तव में, यह ज्ञात है कि उम्र बढ़ना निम्न-श्रेणी की सूजन की स्थिति से जुड़ा होता है, एक ऐसी स्थिति जिसे "सूजन" के रूप में जाना जाता है, जिसमें प्रो-इंफ्लेमेटरी मध्यस्थों के प्लाज्मा स्तर में थोड़ी वृद्धि होती है, जैसे कि ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ) और इंटरल्यूकिन 6 ( आईएल-6), और परिणामस्वरूप एनएफ-κबी मार्ग का सक्रियण [13]। दिलचस्प बात यह है कि युवा लोगों की तुलना में बुजुर्ग मानव मांसपेशियों में एनएफ-κबी प्रोटीन सांद्रता चार गुना अधिक पाई गई; यह बढ़ी हुई सांद्रता एनाबॉलिक सिग्नलिंग की कमी के साथ होती है जिसके परिणामस्वरूप वृद्ध मांसपेशी बर्बाद हो जाती है [17]।

सूजन के बढ़े हुए स्तर का ऑक्सीडेटिव क्षति से गहरा संबंध है, और दोनों ही उम्र से संबंधित मांसपेशियों और ताकत में कमी में शामिल हैं। ऑक्सीडेटिव तनाव की विशेषता प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और/या प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों (आरएनएस) के उच्च स्तर से होती है। यह ख़राब एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम गतिविधि और/या आरओएस उत्पादन में वृद्धि के कारण एंटीऑक्सीडेंट क्षमता में कमी के कारण हो सकता है [18]। इसके अलावा, आरओएस और आरएनएस का ऊंचा स्तर भी उम्र से संबंधित माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए उत्परिवर्तन, विलोपन और क्षति के कारण माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता का परिणाम हो सकता है [19-21]। ऐसा प्रतीत होता है कि आरओएस कंकाल की मांसपेशी में टीएनएफ के लिए दूसरे दूत के रूप में कार्य करता है, जो प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से एनएफ-κबी को सक्रिय करता है [14]।

कंकाल की मांसपेशी में, ट्रांसक्रिप्शनल कोएक्टीवेटर पेरोक्सीसोम प्रोलिफ़रेटर-सक्रिय रिसेप्टर-गामा कोएक्टीवेटर -1 (पीजीसी -1) माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस की उत्तेजना, सेलुलर ऑक्सीडेंट-एंटीऑक्सीडेंट होमोस्टैसिस के विनियमन में शामिल सबसे महत्वपूर्ण अणुओं में से एक है। , पुरानी सूजन का दमन, और मांसपेशी अपचय [22]। पीजीसी-1 अपने लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को सक्रिय करने के लिए परमाणु रिसेप्टर्स और प्रतिलेखन कारकों के साथ बातचीत करता है, और इसकी गतिविधि कैल्शियम आयनों, आरओएस, इंसुलिन, थायराइड और एस्ट्रोजेन हार्मोन, हाइपोक्सिया, एटीपी मांग और साइटोकिन्स सहित कई उत्तेजनाओं के प्रति उत्तरदायी है। 23]. विशेष रूप से, माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस के पीजीसी -1 विनियमन में कई परमाणु प्रतिलेखन कारकों के साथ इसकी बातचीत शामिल है, जिसमें पीपीएआर परिवार के सदस्य, परमाणु श्वसन कारक (एनआरएफ) -1 और एनआरएफ -2, मायोसाइट बढ़ाने वाला कारक शामिल है। {10}} (एमईएफ2), और फोर्कहेड बॉक्स प्रोटीन ओ (फॉक्सो) 1 [24,25]। एनआरएफ -1, 2 का पीजीसी -1 सक्रियण कई परमाणु-एनकोडेड माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है, जो सीधे माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए प्रतिकृति और प्रतिलेखन को उत्तेजित करता है [23,26,27]। इसके अलावा, पीजीसी -1, एमईएफ2सी प्रतिलेखन कारक के सहयोग से, उम्र बढ़ने के दौरान तेज एमएचसी से अधिक प्रतिरोधी धीमी एमएचसी की ओर बदलाव के पक्ष में मायोफाइबर फेनोटाइपिक प्रोफाइल को भी प्रभावित कर सकता है [28,29]।

पिछले दशक में, उम्र बढ़ने के दौरान कंकाल की मांसपेशियों की गिरावट को संभावित रूप से कम करने के लिए शारीरिक गतिविधि और पोषण जैसी कई रणनीतियों का प्रस्ताव किया गया है। वास्तव में, शारीरिक व्यायाम से सरकोपेनिया को कम करने और शरीर में वसा संचय और सूजन को रोकने में मदद मिली है [30-32]। इसके अलावा, प्रोटीन या एंटीऑक्सिडेंट सेवन को लक्षित करने वाले आहार संबंधी हस्तक्षेप से मांसपेशियों और ताकत में वृद्धि पर सकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है [33]। यह ज्ञात है कि बुजुर्गों में होने वाली मांसपेशी द्रव्यमान और कार्य की हानि में भोजन का कम सेवन शामिल होता है, जिसके परिणामस्वरूप युवा लोगों की तुलना में मांसपेशी प्रोटीन संश्लेषण में क्षीणन होता है [34]। नतीजतन, पोषण, विशेष रूप से अमीनो एसिड अनुपूरण, उम्र बढ़ने के दौरान मांसपेशियों की एनाबॉलिक प्रतिक्रिया में सुधार करने के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व कर सकता है [35-39]।

टॉरिन एक सिस्टीन-व्युत्पन्न अर्ध-आवश्यक अमीनो एसिड है जो स्तनधारी ऊतकों में अत्यधिक अभिव्यक्त होता है। कंकाल की मांसपेशियों में, जहां उम्र बढ़ने के दौरान इसका स्तर कम हो जाता है, यह एंटीऑक्सीडेंट और सूजन-रोधी अणु के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है [40,41]। चूंकि टॉरिन-क्षीण कंकाल की मांसपेशी अपने आकारिकी और कार्य में कई असामान्यताएं प्रदर्शित करती है, जो उम्र बढ़ने के दौरान होने वाली असामान्यताओं से मिलती जुलती है [42], टॉरिन अनुपूरण कंकाल की मांसपेशी में उम्र बढ़ने के नकारात्मक प्रभावों का प्रतिकार करने के लिए एक आशाजनक रणनीति का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि इंट्रापेरिटोनियल टॉरिन प्रशासन सूजन को कम करके कंकाल की मांसपेशियों के पुनर्जनन में उम्र बढ़ने से संबंधित अवरोध का प्रतिकार करता है। इसके अलावा, हमारे परिणाम एक एंटी-ऑक्सीडेंट अणु के रूप में टॉरिन की भूमिका का समर्थन करते हैं जो मांसपेशियों के सूक्ष्म वातावरण को बेहतर बनाने, अपक्षयी प्रक्रियाओं का प्रतिकार करने और उम्र बढ़ने के दौरान ऊतक होमियोस्टेसिस का पक्ष लेने में सक्षम है।

2। सामग्री और विधि

2.1. पशु और उपचार

युवा (8-10 सप्ताह) और वृद्ध (18-20 महीने) नर C57BL6J चूहों को स्थिर तापमान और आर्द्रता पर 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र के साथ एक सुविधा में रखा गया था। चूहों को एड लिबिटम खिलाने और पीने की अनुमति दी गई। इस्तेमाल किए गए जानवरों की सुरक्षा पर राष्ट्रीय नियमों के अनुपालन में चूहों का इलाज कैथोलिक यूनिवर्सिटी ऑफ सेक्रेड हार्ट-रोम (प्राधिकरण संख्या 150/2017-पीआर इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय) की आचार समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था। वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए (इतालवी डिक्री संख्या 26 दिनांक 4 मार्च 2014, यूरोपीय निर्देश 2010/63/ईयू को स्वीकार करते हुए)। टॉरिन को खारे घोल में तैयार किया गया था और लगातार पांच हफ्तों तक 100 मिलीग्राम/किग्रा/दिन की खुराक पर इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित किया गया था [43-45] (स्कीम 1)। यह खुराक विवो माउस मॉडल [46,47] में एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव दिखाने वाले प्रकाशित आंकड़ों के आधार पर चुनी गई थी। नियंत्रण चूहों को केवल खारा प्राप्त हुआ। कार्डियोटॉक्सिन (सीटीएक्स) इंजेक्शन के साथ टीए क्षति को शामिल करने से पहले, जानवरों को शारीरिक समाधान में पतला केटामाइन 70 मिलीग्राम/किग्रा और मेडेटोमिडाइन 1 मिलीग्राम/किग्रा के मिश्रण के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से संवेदनाहारी किया गया था। नियंत्रण और टॉरिन-उपचारित चूहों की बायीं ओर की टिबिअलिस पूर्वकाल (टीए) मांसपेशियों पर चोट चार सीटीएक्स इंजेक्शन (प्रति साइट 10 μM सीटीएक्स के 5 μL) के साथ मांसपेशियों की पूरी लंबाई के साथ की गई थी [48,49]। दाईं ओर के टीए का उपयोग नियंत्रण समकक्ष के रूप में किया गया था। जैसा कि ऊपर वर्णित है, संज्ञाहरण के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से जानवरों की बलि दी गई थी। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए, टीए मांसपेशियों को ओसीटी यौगिक (माइल्स, एल्खार्ट, आईएन, यूएसए) में एम्बेडेड किया गया था और -80 डिग्री पर आइसोपेंटेन में तुरंत जमे हुए थे।

2.2. हिस्टोलॉजिकल और हिस्टोकेमिकल विश्लेषण

बूढ़े चूहों की टीए मांसपेशियों को लेईका क्रायोस्टेट द्वारा 10 माइक्रोन की मोटाई में विभाजित किया गया था। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए, मानक तरीकों [50] का उपयोग करके अनुभागों को हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) से रंग दिया गया था। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एस्टरेज़ स्टेनिंग एक गैर-विशिष्ट एस्टरेज़ स्टेन किट (बायो-ऑप्टिका, मिलान, इटली) का उपयोग करके किया गया था।

2.3. मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण

टीए नमूनों के अनुभागों पर हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन और एस्टरेज़ धुंधलापन का प्रदर्शन किया गया। फाइबर आकार के मॉर्फोमेट्रिक मूल्यांकन के लिए, विश्लेषण प्रत्येक स्थिति के लिए संपूर्ण मांसपेशी क्रॉस-सेक्शन की उच्च-आवर्धन छवियों के 4 यादृच्छिक रूप से चुने गए क्षेत्रों पर किया गया था। प्रत्येक उपचार के लिए जांचे गए जानवरों की संख्या 3-4 थी। फाइबर के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र का मूल्यांकन करने के लिए इमेजजे, स्कोन इमेज सॉफ्टवेयर (संस्करण बीटा 4. 0.2; स्कोन कॉर्पोरेशन, फ्रेडरिक, एमडी, यूएसए, 2 मई 2022 को एक्सेस किया गया) का उपयोग करके फाइबर के फोटोमाइक्रोग्राफ का विश्लेषण किया गया था। . पुनर्जीवित होने वाले तंतुओं को केंद्रीय नाभिक की उपस्थिति से उजागर किया गया था।

2.4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण

जमे हुए खंडों को कमरे के तापमान पर 1 {5 }} मिनट के लिए 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया, पीबीएस से धोया गया, और 1 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) युक्त घोल से पारगम्य बनाया गया। , #ए9418), कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए फॉस्फेट-बफर सलाइन (पीबीएस) में 0.2 प्रतिशत ट्राइटन-एक्स, और 1 के लिए 10 प्रतिशत गधा सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए, #डी9663) के साथ अवरुद्ध किया गया h कमरे के तापमान पर. उचित तनुकरण पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अनुभागों को रात भर 4 ◦C पर ऊष्मायन किया गया। निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग किया गया: धीमी एमएचसी (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए, #एम8421, 1:500) और 4-एचएनई (अल्फा डायग्नोस्टिक्स इंटरनेशनल, सैन एंटोनियो, टीएक्स, #एचएनई{{20) }}एस, 1:500)। पीबीएस में तीन बार धोने के बाद, वर्गों को विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया। विशेष रूप से, निम्नलिखित का उपयोग किया गया: AlexaFluor594-संयुग्मित एंटी-माउस 1:1000 (आणविक जांच, यूजीन, OR, यूएसए, #A21203) और AlexaFluor488-संयुग्मित विरोधी-खरगोश 1:1000 (आणविक) प्रोब्स, यूजीन, ओआर, यूएसए, #ए21206) पीबीएस में 1.5 प्रतिशत गधा सीरम युक्त। अनुभागों को डीएपीआई (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए, #पी36935) के साथ प्रोलॉन्ग™ गोल्ड एंटीफेड माउंटेंट के साथ लगाया गया था और लीका एसपी5 लेजर कन्फोकल के साथ जांच की गई थी। प्रायोगिक समूहों में 4-एचएनई सिग्नल में परिवर्तनों की मात्रा का निर्धारण डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा किया गया था। पृष्ठभूमि घटाव के बाद, एचएनई फाइबर से जुड़े संकेतों को व्यक्तिगत फाइबर को मैन्युअल रूप से रेखांकित करके और इमेजजे सॉफ्टवेयर के साथ फाइबर से जुड़े प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापकर निर्धारित किया गया था। एफ/ए अनुपात कुल फाइबर क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र (ए) के लिए सामान्यीकृत व्यक्तिगत फाइबर (एफ) के औसत प्रतिदीप्ति को परिभाषित करता है। परिमाणीकरण प्रति समूह 50 फ़ाइबर (n=3 चूहों प्रति समूह) पर किया गया था।

2.5. प्रोटीन निष्कर्षण और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण

चूहों से प्राप्त टीए मांसपेशियों को विच्छेदित किया गया, छोटा किया गया, और लिसीस बफर (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए, यूएसए, #9803) युक्त फिनाइलमिथाइलसल्फोनील फ्लोराइड (पीएमएसएफ) (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर) के साथ समरूप बनाया गया। एमए, यूएसए, #8553) और एक पूर्ण प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए, यूएसए, #5872)। माइक्रोप्लेट रीडर्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए, सॉफ्टवेयर संस्करण 4.1) के लिए ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख (बायो-रेड लेबोरेटरीज इंक., हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) और थर्मो साइंटिफिक™ स्कैनइट™ द्वारा नियंत्रित वैरियोस्कैन™ लक्स का उपयोग किया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटीन की समान मात्रा निर्धारित करने के लिए। प्रोटीन को एसडीएस/पेज (मिनी-प्रोटीन® टीजीएक्स™ प्रीकास्ट प्रोटीन जैल या मिनी-प्रोटीन टीजीएक्स स्टेन-फ्री प्रीकास्ट पेज जैल; बायो-रेड लेबोरेटरीज इंक., हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) द्वारा अलग किया गया और एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित किया गया ( ट्रांस-ब्लॉट® टर्बो™ मिनी नाइट्रोसेल्यूलोज ट्रांसफर पैक #1704158; बायो-रेड लेबोरेटरीज इंक., हरक्यूलिस, सीए, यूएसए)। ट्रिस-बफ़र्ड सलाइन (टीबीएस) (बायो-रेड लेबोरेटरीज इंक., हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) में 0.1 प्रतिशत ट्वीन -20 के साथ पूरक और 5 प्रतिशत नॉनफैट सूखा दूध (बायो-रेड लेबोरेटरीज इंक) में गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को अवरुद्ध किया गया था। , हरक्यूलिस, सीए, यूएसए #1706404) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए। उपयोग किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी थे: माउस मोनोक्लोनल एंटी-एसओडी -1 (1:500, सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी डलास, टेक्सास 75220 यूएसए, एससी -17767); रैबिट मोनोक्लोनल एंटी-फॉस्फो-एमटीओआर (1:1000, #2971, सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए, यूएसए); रैबिट मोनोक्लोनल एंटी-एमटीओआर (1:1000, #2972, सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए, यूएसए); माउस मोनोक्लोनल एंटी-स्लो-एमएचसी (1:500, सिग्मा-एल्ड्रिच, #एम8421); माउस मोनोक्लोनल एंटी-मायोसिन (कंकाल, तेज़) (1:500, सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए, #एम4276); रैबिट मोनोक्लोनल एंटी-फॉस्फो-एनएफ-κB p65 (Ser468) (1:1000, #3039, सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए, यूएसए); रैबिट मोनोक्लोनल एंटी-एनएफ-κबी पी65 (1:250, #3034, सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए, यूएसए); माउस मोनोक्लोनल एंटी-जी6पीडी (1:300, सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी डलास, टेक्सास 75220 यूएसए, एससी-373887), और माउस मोनोक्लोनल एंटी-जीपी91[फॉक्स]। फिर धब्बों को बायो-रेड प्रयोगशालाओं से निम्नलिखित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया: बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (1: 3000, एचआरपी कॉन्जुगेट, बायो-रेड प्रयोगशाला इंक, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए, # 1706515) और बकरी विरोधी माउस आईजीजी (1:3000, एचआरपी कॉन्जुगेट, बायो-रेड लेबोरेटरीज इंक., हरक्यूलिस, सीए, यूएसए, #1706516) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए। सिग्नलों को केमीडॉक™ इमेजिंग सिस्टम (बायो-रेड लेबोरेटरीज, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) द्वारा एक उन्नत केमिलुमिनेसेंस सिस्टम (सुपरसिग्नल केमोल्यूमिनसेंट सबस्ट्रेट, थर्मो फिशर साइंटिफिक इंक. वाल्थम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके कैप्चर किया गया था। डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण इमेज लैब™ टच, सॉफ्टवेयर संस्करण 5.2.1 (बायो-रेड लेबोरेटरीज इंक., हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था।

2.6. वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण

चूहों से प्राप्त टीए मांसपेशियों को विच्छेदित किया गया था, और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ट्राईएजेंट (इनविट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) में एक ऊतक लाइज़र (क्यूआईएजीईएन) के साथ कुल आरएनए निष्कर्षण किया गया था। डबल-स्ट्रैंडेड सीडीएनए को क्वांटिटेक्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट (क्यूआईएजीएन एसआरएल, मिलान, इटली) के साथ संश्लेषित किया गया था। मैसेंजर-आरएनए विश्लेषण विशिष्ट टैकमैन एसेज़ (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, वॉलथम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके एबीआई प्रिज्म 7500 एसडीएस (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, वाल्थम, एमए, यूएसए) पर किया गया था। विशेष रूप से, निम्नलिखित परीक्षणों का उपयोग किया गया: GPX1: mm_00656767_g1; MEF2C: मिमी_00600423_m1; पीजीसी1- : मिमी_01280835_एम1; SOD1: मिमी_01344233_m1; और सीएटी: मिमी_00437992_एम1. अंतर्जात नियंत्रण Hprt1 (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, वाल्थम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके सापेक्ष मात्रा का ठहराव किया गया था। आंकड़ों में निर्दिष्ट अनुसार प्रत्येक समूह के लिए तीन से पांच अलग-अलग जानवरों की आरएनए तैयारियों का उपयोग करके वास्तविक समय पीसीआर का प्रदर्शन किया गया था। सापेक्ष अभिव्यक्ति की गणना 2−∆∆Ct विधि का उपयोग करके की गई थी।

2.7. सांख्यिकीय विश्लेषण

समूहों के बीच कई सांख्यिकीय तुलनाएँ एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा की गईं। जहां किंवदंतियों में संकेत दिया गया है, वहां मैन-व्हिटनी रैंक-सम परीक्षण या अनपेयर्ड स्टूडेंट टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। प्रत्येक बार माध्य ± SEM (माध्य की मानक त्रुटि) का प्रतिनिधित्व करता है।

3। परिणाम

3.1. टॉरिन प्रशासन कंकाल की मांसपेशियों के पुनर्जनन में उम्र बढ़ने से जुड़े प्रभाव का प्रतिकार करता है

कंकाल की मांसपेशी पुनर्जनन पर टॉरिन प्रशासन के प्रभाव की जांच करने के लिए, हमने नियंत्रण (वाहन) और टॉरिन-उपचारित पुराने चूहों की टीए मांसपेशियों में सीटीएक्स इंजेक्शन का उपयोग करके क्षति को प्रेरित किया। रूपात्मक और रूपमिति विश्लेषण से पता चला कि चोट की अनुपस्थिति में (चित्र 1ए, बी: पैनल ए, बी, और चित्र 1सी), टॉरिन-उपचारित चूहों के मांसपेशी फाइबर ने नियंत्रण की तुलना में थोड़ा बढ़ा हुआ क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र प्रदर्शित किया। चूंकि कंकाल की मांसपेशी में प्रोटीन होमियोस्टैसिस प्रोटीन संश्लेषण और प्रोटीन क्षरण के बीच संतुलन पर निर्भर करता है, इसलिए हमने प्रोटीन संश्लेषण के मुख्य नियामक के रूप में फॉस्फो-एमटीओआर और प्रमुख नियामकों में से एक एट्रोगिन -1 दोनों के स्तर का विश्लेषण किया। यूबिकिटिन-प्रोटियासोम प्रणाली [40] के माध्यम से प्रोटीन अपचय में शामिल। हमारे परिणामों से पता चला कि टॉरिन-उपचारित चूहों की मांसपेशियों के अर्क में फॉस्फो-एमटीओआर का स्तर काफी बढ़ गया था, जबकि इस स्थिति में एट्रोजिन -1 (एफबीएक्सओ 32) का कोई महत्वपूर्ण मॉड्यूलेशन सामने नहीं आया था (चित्र 1डी-एफ)। ये डेटा कंकाल मांसपेशी फाइबर सीएसए में देखी गई वृद्धि पर टॉरिन के प्रभाव में एमटीओआर-निर्भर मार्ग की भागीदारी को प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, मांसपेशियों की क्षति के 1 सप्ताह के बाद, वाहन-उपचारित चूहों (सीटीएक्स) में तंतुओं के क्रॉस-सेक्शन में सहवर्ती तीव्र सूजन और परिगलन के साथ अध: पतन का पता चला, साथ ही केंद्रीय नाभिक द्वारा पहचाने गए छोटे पुनर्जीवित तंतुओं की उपस्थिति भी हुई ( चित्र 1जी, एच: पैनल सी)। दूसरी ओर, बड़े पुनर्जीवित मायोफाइबर और कम नेक्रोटिक फाइबर (चित्र 1जी, एच: पैनल डी) टॉरिन-उपचारित पुराने चूहों की घायल मांसपेशियों में कम घुसपैठ के साथ दिखाई दिए। चित्र 1I में आरेखों में दिखाए गए इन परिणामों के विश्लेषण से पता चला कि टॉरिन प्रशासन ने नियंत्रित घायल मांसपेशियों की तुलना में बड़े पुनर्जीवित फाइबर के संचय को बढ़ावा देकर फाइबर आकार वितरण को प्रभावित किया। निष्कर्ष में, इन परिणामों से पता चलता है कि टॉरिन कंकाल की मांसपेशी फाइबर की अखंडता के रखरखाव में एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाकर और नए मायोफाइबर के गठन के त्वरण को बढ़ावा देकर पुनर्योजी प्रक्रिया को उत्तेजित कर सकता है।

3.2. टॉरिन अनुपूरण वृद्ध मांसपेशियों में सूजन प्रतिक्रिया को नियंत्रित करता है

उम्र बढ़ने के साथ-साथ पुरानी निम्न-श्रेणी प्रणालीगत सूजन की स्थिति भी होती है [51] जो कंकाल की मांसपेशियों की क्षीण पुनर्योजी क्षमता के लिए जिम्मेदार हो सकती है [52]। यह सत्यापित करने के लिए कि क्या टॉरिन-उपचारित चूहों की घायल मांसपेशियों में देखी गई बढ़ी हुई पुनर्योजी प्रतिक्रिया सूजन प्रक्रिया के मॉड्यूलेशन से जुड़ी थी, हमने एस्टरेज़ धुंधला द्वारा मैक्रोफेज की उपस्थिति की जांच की। चित्र 2ए, बी दिखाता है कि, सीटीएक्स इंजेक्शन के परिणामस्वरूप, सभी मांसपेशी वर्गों ने असंक्रमित समकक्षों की तुलना में मोनोन्यूक्लिएटेड सूजन कोशिकाओं की बढ़ी हुई संख्या प्रदर्शित की; हालाँकि, पुरानी घायल मांसपेशी (चित्रा 2ए: पैनल सी और चित्रा 2बी) में मौजूद एस्टरेज़-पॉजिटिव मैक्रोफेज की उच्च संख्या टॉरिन अनुपूरण (चित्रा 2ए: पैनल डी और चित्रा 2बी) की उपस्थिति में काफी कम हो गई थी। पुनर्योजी प्रक्रिया के दौरान सूजन की सीमा को कम करने पर टॉरिन के प्रभाव का मूल्यांकन प्रतिलेखन कारक एनएफ-केबी के फॉस्फोराइलेटेड आइसोफॉर्म के स्तर का विश्लेषण करके भी किया गया था क्योंकि यह ज्ञात है कि कंकाल की मांसपेशी में इसकी सक्रियता विशिष्ट मांसपेशी प्रोटीन के क्षरण की ओर ले जाती है। , सूजन और फाइब्रोसिस को प्रेरित करता है, और चोट के बाद मायोफाइबर के पुनर्जनन को अवरुद्ध करता है [53-55]। जैसा कि चित्र 2सी, डी में दिखाया गया है, फॉस्फो-एनएफ-केबी नियंत्रण और टॉरिन-उपचारित गैर-घायल मांसपेशियों दोनों में बहुत कम स्तर पर पता लगाने योग्य था, जबकि सीटीएक्स घायल मांसपेशियों में पाए गए फॉस्फो-एनएफ-केबी के उच्च स्तर में नाटकीय रूप से कमी आई थी। टॉरिन-उपचारित बूढ़े चूहों की मांसपेशियाँ। कुल एनएफ-केबी स्तर और फॉस्फो-एनएफ-केबी और एनएफ-केबी के बीच के अनुपात का विश्लेषण किया गया और यह साबित हुआ कि सीटीएक्स-प्रेरित क्षति के साथ, हालांकि उल्लेखनीय रूप से नहीं, वृद्धि हुई है, जबकि टॉरिन ने इस प्रभाव को रोका (चित्रा 2 सी, ई, एफ) . ये परिणाम दर्शाते हैं कि टॉरिन कुल एनएफ-केबी और फॉस्फो-एनएफ-केबी दोनों के स्तर को कम करके घायल मांसपेशियों में सूजन की स्थिति को कम करता है।

3.3. टॉरिन वृद्ध चूहों की टीए मांसपेशियों में पीजीसी1- और एमईएफ2सी अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है

कंकाल की मांसपेशी होमियोस्टैसिस पर टॉरिन के सकारात्मक प्रभाव में शामिल आणविक तंत्र की बेहतर जांच करने के लिए, हमने ट्रांसक्रिप्शनल सह-सक्रियकर्ता पीजीसी -1 की भूमिका का मूल्यांकन किया। मांसपेशियों में सूजनरोधी वातावरण को बढ़ावा देने में पीजीसी-1 एक महत्वपूर्ण कारक है। इसके अलावा, यह बताया गया है कि पीजीसी -1 न केवल मांसपेशियों के कार्य में सुधार कर सकता है, बल्कि मायोफाइबर आकृति विज्ञान और अखंडता में भी सुधार कर सकता है, जो फाइबर की मरम्मत और पुनर्जनन में पीजीसी -1 की संभावित भूमिका को दर्शाता है। MEF2C प्रतिलेखन कारक के सहयोग से, PGC -1 को कंकाल मांसपेशी फाइबर-प्रकार के निर्धारण को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है, जो ग्लाइकोलाइटिक फाइबर से अधिक प्रतिरोधी ऑक्सीडेटिव फाइबर में स्विच को बढ़ावा देता है [56,57]।

इस प्रकार, आरटी-पीसीआर विश्लेषण का उपयोग करते हुए, हमने यह निर्धारित करने के लिए युवा, बूढ़े और पुराने टॉरिन-उपचारित चूहों के टीए अर्क में पीजीसी -1 और एमईएफ 2 सी के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तर का मूल्यांकन किया कि क्या टॉरिन प्रशासन ने उपर्युक्त के ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों को प्रेरित किया है। इसकी अनुपस्थिति में जो देखा गया उसकी तुलना में कारक। इन कारकों की अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करने के लिए स्वस्थ परिस्थितियों में युवा चूहों का उपयोग किया गया। जैसा कि चित्र 3ए, बी में दिखाया गया है, टॉरिन की अनुपस्थिति में, युवा चूहों की तुलना में बूढ़े चूहों के अर्क में पीजीसी-1 स्तरों में कोई बदलाव नहीं हुआ और एमईएफ2सी स्तरों में केवल मामूली कमी देखी गई, जबकि एमआरएनए स्तर इंट्रापेरिटोनियल टॉरिन इंजेक्शन के अधीन पुराने चूहों में दोनों अणुओं को महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किया गया था। यह प्रदर्शित किया गया है कि टाइप I स्लो-ट्विच ऑक्सीडेटिव फाइबर (मायोसिन भारी श्रृंखला की धीमी आइसोफॉर्म, धीमी एमएचसी को व्यक्त करते हुए) टाइप IIb फास्ट-ट्विच ग्लाइकोलाइटिक फाइबर की तुलना में क्षति और विभिन्न प्रकार की एट्रोफिक स्थितियों के प्रति अधिक प्रतिरोधी है [29]। सरकोपेनिया समेत कई मांसपेशी विकृतियों में, धीमी-चिकोटी मांसपेशियों की तुलना में सबसे तेज़ मांसपेशी फेनोटाइप अधिक गंभीर रूप से समझौता किया जाता है, और प्रकार IIb फाइबर की अधिक संवेदनशीलता उनकी तुलना में पीजीसी की कम सामग्री के कारण हो सकती है -1 ऑक्सीडेटिव फाइबर का [58,59]। यहां, हमने वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण द्वारा दिखाया कि बूढ़े चूहों की टीए मांसपेशियों ने युवा-व्युत्पन्न मांसपेशियों के अर्क की तुलना में धीमी-एमएचसी आइसोफॉर्म के बहुत कम स्तर को व्यक्त किया; हालाँकि, टॉरिन-उपचारित चूहों की मांसपेशियों के अर्क में धीमी-एमएचसी अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई (चित्रा 3सी, डी)। इसके अलावा, फास्ट-एमएचसी आइसोफॉर्म के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि, टॉरिन की उपस्थिति में, पुराने चूहों से प्राप्त टीए अर्क में जो देखा गया था, उसकी तुलना में इसकी अभिव्यक्ति काफी हद तक अपग्रेड की गई थी, जिन्हें टॉरिन प्रशासन नहीं मिला था (चित्रा 3एफ) . लगातार, युवा चूहों की तुलना में बूढ़े चूहों की मांसपेशियों के अर्क में पाए गए एमएचसी (एमएफ20) के कम स्तर को टॉरिन प्रशासन के साथ बढ़ाया गया था। इन परिणामों से पता चलता है कि वृद्ध चूहों के कंकाल की मांसपेशी होमियोस्टैसिस पर टॉरिन के सकारात्मक प्रभाव को पीजीसी 1- / MEF2C मार्ग की उत्तेजना द्वारा मध्यस्थ किया जा सकता है, जो ऑक्सीडेटिव फेनोटाइप की ओर मायोफाइबर के संभावित चयापचय बदलाव को बढ़ावा देता है और अधिक को संरक्षित करता है। अतिसंवेदनशील ग्लाइकोलाइटिक फाइबर।

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