उच्च दक्षता के साथ किडनी द्वारा कई प्रोटीन-बद्ध विलेय को साफ किया जाता है

किडनी प्लाज्मा से कई विलेय को साफ करती है; हालाँकि, इन विलेय के प्रतिधारण से किडनी फेल होने पर यूरेमिक बीमारी हो जाती है। हम उल्लेखनीय रूप से बहुत कम जानते हैं कि कौन से विलेय विषाक्त हैं, डायलिसिस उपचारों में सुधार करने की हमारी क्षमता को सीमित करते हैं।

इसका पता लगाने के लिए, हमने गुर्दे द्वारा कुशलता से साफ किए गए विलेय की पहचान करने के लिए अलक्षित मास स्पेक्ट्रोमेट्री को नियोजित किया। उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री ने सामान्य गुर्दे समारोह वाले 5 व्यक्तियों के मूत्र और प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट में 1808 विशेषताओं का पता लगाया। 1082 चोटियों की अनुमानित निकासी दर क्रिएटिनिन निकासी से अधिक थी जो ट्यूबलर स्राव का संकेत देती है।

आगे के विश्लेषण ने गुर्दे के प्लाज्मा प्रवाह की तुलना में अनुमानित निकासी दरों के साथ विलेय का प्रतिनिधित्व करने वाली 90 विशेषताओं की पहचान की। स्थिर आइसोटोप कमजोर पड़ने के साथ मात्रात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री ने पुष्टि की कि प्लाज्मा प्रोटीन और ट्यूबलर स्राव के बंधन के संयोजन से इन विलेय की कुशल निकासी संभव है। टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री ने हिप्पुरिक एसिड, इंडोक्सिल सल्फेट और पी-क्रेसोल सल्फेट सहित 13 विलेय की रासायनिक पहचान स्थापित की। ये 13 कुशलता से साफ किए गए विलेय हेमोडायलिसिस रोगियों के प्लाज्मा में जमा होते पाए गए, जिनमें से दो को छोड़कर सभी के लिए मुक्त स्तर 20-सामान्य से अधिक बढ़ गया। इस प्रकार, देशी गुर्दे में स्राव द्वारा कुशलता से साफ किए गए विलेय का आगे का विश्लेषण यूरेमिक विषाक्त पदार्थों की पहचान के लिए एक संभावित मार्ग प्रदान कर सकता है।

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कीवर्ड

मास स्पेक्ट्रोमेट्री; रीनल फंक्शन्यूरेमिक; टॉक्सिन्स

किडनी रक्त प्लाज्मा से कई अपशिष्ट विलेय को हटाती है। जब गुर्दा कार्य करना बंद कर देता है, तो ये विलेय शरीर में जमा हो जाते हैं और यूरेमिक बीमारी का कारण बनते हैं जो मृत्यु में परिणत होती है जब तक कि गुर्दे का कार्य आंशिक रूप से डायलिसिस द्वारा प्रतिस्थापित नहीं किया जाता है।

वर्तमान में, हम उल्लेखनीय रूप से बहुत कम प्रशिक्षित हैं कि विषाक्त क्या है, और इस ज्ञान की कमी से उपचार में सुधार करने की हमारी क्षमता सीमित हो जाती है। 1,2 प्रगति कुछ हद तक धीमी रही है क्योंकि गुर्दे के विफल होने पर विलेय की संख्या बहुत बड़ी होती है। 1., 3., 4., 5., 6. इस अध्ययन ने गुर्दे द्वारा प्लाज्मा से कुशलता से हटाए गए विलेय को खोजने के लिए अलक्षित मास स्पेक्ट्रोमेट्री को नियोजित किया।

यह पता चला कि ऐसे कई अपशिष्ट विलेय हैं जिनके लिए गुर्दे की निकासी दर सामान्य रूप से गुर्दे के प्लाज्मा प्रवाह से अधिक है। इस तरह के उच्च-निकासी बंधनों के लिए प्लाज्मा प्रोटीन और सक्रिय ट्यूबलर स्राव की आवश्यकता होती है। ऐसे विलेय की सांद्रता उच्च स्तर तक बढ़ सकती है जब गुर्दे के कार्य को हेमोडायलिसिस द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है जो केवल प्रसार द्वारा विलेय को साफ करता है। प्रेस उमिंग कि विकास ने गुर्दे को विषाक्त पदार्थों को कुशलता से हटाने के लिए प्रदान किया है, उच्च गुर्दे की निकासी दर वाले विलेय की पहचान यूरेमिक विषाक्त पदार्थों की पहचान के लिए एक मार्ग प्रदान कर सकती है।

परिणाम

माप चार पुरुषों और एक महिला में सामान्य गुर्दे समारोह के साथ किया गया था, जैसा कि औसत क्रिएटिनिन क्लीयरेंस 142 ± 22 मिली / मिनट प्रति 1.73 एम 2 से परिलक्षित होता है। अलक्षित उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मूत्र और प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट दोनों में कुल 1808 विशेषताओं का पता लगाया गया। इन सुविधाओं के लिए निकासी दरों का अनुमान प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट में एकाग्रता से विभाजित मूत्र उत्सर्जन दर के रूप में लगाया गया था। क्लीयरेंस मान इस प्रकार कुल विलेय सांद्रता के बजाय प्लाज्मा में 'मुक्त' अनबाउंड विलेय सांद्रता के संदर्भ में व्यक्त किए जाते हैं।

क्रिएटिनिन क्लीयरेंस के सापेक्ष अनुमानित निकासी दरों का वितरण चित्र 1 में दर्शाया गया है। 1082 सुविधाओं के लिए, अनुमानित निकासी दर क्रिएटिनिन की निकासी से क्यू की झूठी खोज दर से अधिक थी।<0.05. Because the creatinine clearance is slightly higher than the glomerular filtration rate (GFR), these features were considered likely to represent solutes secreted by the renal tubules. There were, in contrast, only 290 features with estimated clearance rates less than the creatinine clearance with a false discovery rate of q<0.05.

चित्र 1. नीली रेखा सामान्य विषयों के मूत्र और प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट में पाई जाने वाली 1808 विशेषताओं के लिए क्रिएटिनिन निकासी के सापेक्ष अनुमानित निकासी दरों के वितरण का प्रतिनिधित्व करती है। लाल त्रिकोण उन 13 विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनके लिए अभिकर्मक मानकों के विश्लेषण द्वारा पहचान की पुष्टि की गई थी।

163 विशेषताओं के लिए, अनुमानित निकासी दर क्रिएटिनिन की निकासी से सात गुना अधिक थी। इसने सुझाव दिया कि उनकी निकासी गुर्दे के प्लाज्मा प्रवाह से अधिक है, जो क्रिएटिनिन की निकासी से लगभग चार गुना है।

इन 163 विशेषताओं में से, 90 को डुप्लिकेट के उन्मूलन के बाद अद्वितीय रासायनिक यौगिकों का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जाता था, और सुविधाओं को क्रोमैटोग्राम्स (पूरक तालिका S2 ऑनलाइन) की मैन्युअल समीक्षा पर डिमर्स, एडिक्ट्स, आइसोटोप या कलाकृतियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जाता था। मानक डेटाबेस में बड़े पैमाने पर मूल्यों के साथ यौगिकों की मांग की गई थी, और इन 90 विशेषताओं में से 13 की रासायनिक पहचान उनके क्रोमैटोग्राफिक अवधारण समय और अग्रानुक्रम द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस / एमएस) स्पेक्ट्रा की तुलना में अभिकर्मक मानकों (तालिका 1 और पूरक) के साथ स्थापित की गई थी। तालिका S2 ऑनलाइन)। ब्याज की 90 विशेषताओं में से 40 के लिए, हालांकि, ज्ञात मानव मेटाबोलाइट्स के बीच 3 मिलियन प्रति मिलियन (पीपीएम) (अनुपूरक तालिका S2 ऑनलाइन) के द्रव्यमान के साथ कोई उम्मीदवार यौगिक नहीं पाया गया। गुर्दे की प्लाज्मा प्रवाह दर पर 7,8 निकासी मूल्य थे। संभव है क्योंकि प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट में इन विलेय की 'मुक्त' सांद्रता उनके कुल प्लाज्मा सांद्रता से कम थी, संभवतः प्लाज्मा प्रोटीन के लिए बाध्यकारी दर्शाती है।

हालांकि सभी कुशलता से साफ किए गए विलेय प्रोटीन से बंधे हुए थे, बंधन की सीमा व्यापक रूप से भिन्न थी, कुल प्लाज्मा एकाग्रता के 2 से 52 प्रतिशत तक मुक्त अंश के साथ। कुल प्लाज्मा सांद्रता के संदर्भ में गणना से बाध्य विलेय (पूरक तालिका S2 ऑनलाइन) के लिए बहुत कम निकासी मान प्राप्त हुए।

तालिका 1. देशी किडनी और हेमोडायलिसिस रोगियों में उनके संचय से विलेय कुशलता से साफ हो जाते हैं।

मान औसत ± sd क्लीयरेंस/क्लीयरेंसक्रे क्रिएटिनिन क्लीयरेंस के लिए विलेय क्लीयरेंस का औसत अनुपात है। कुल प्लाज्मा स्तर के प्रतिशत के रूप में मुक्त अंश प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट का स्तर है। हेमोडायलिसिस/सामान्य हेमोडायलिसिस रोगियों में औसत प्रीट्रीटमेंट एकाग्रता का अनुपात सामान्य विषयों में औसत एकाग्रता का अनुपात है।

a

क्यू इंगित करता है<0.05 for the elevation of the solute concentration in hemodialysis patients above the level in normal subjects.

b

इंगित करता है कि फ़्यूरोइलग्लिसिन के मुक्त अंश की गणना केवल एक विषय में की गई थी क्योंकि अन्य विषयों से प्लाज्मा के नमूनों में चोटियों की मात्रा बहुत कम थी।

आइसोटोपिक रूप से लेबल किए गए मानकों के साथ तरल क्रोमैटोग्राफी/टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी/एमएस/एमएस) का उपयोग करने वाले मापों ने बाध्य विलेय हिप्पुरेट, इंडोक्सिल सल्फेट और पी-क्रेसोल सल्फेट के लिए बहुत उच्च निकासी दरों की खोज की पुष्टि की। यूरिया और क्रिएटिनिन के साथ इन विलेय के लिए निकासी मान तालिका 2 में संक्षेपित हैं।

तुलना के लिए, फेनिलसेटाइलग्लुटामाइन के लिए क्लीयरेंस मान भी मापा गया था, जो पिछले अध्ययनों में गुर्दे की नलिकाओं द्वारा स्रावित होने के लिए दिखाया गया था, लेकिन काफी हद तक अनबाउंड। 9 जैसा कि अपेक्षित था, यूरिया की निकासी क्रिएटिनिन क्लीयरेंस से कम थी, जो ग्लोमेरुलर निस्पंदन के बाद ट्यूबलर पुनर्संयोजन को दर्शाता है। इसके विपरीत फेनिलसेटाइलग्लुटामाइन की निकासी औसतन 455±62 मिली/मिनट प्रति 1.73 एम2 या अनुमानित रीनल प्लाज्मा प्रवाह दर का लगभग तीन-चौथाई है। हिपपुरेट, इंडोक्सिल सल्फेट और पी-क्रेसोल सल्फेट के लिए क्लीयरेंस वैल्यू बहुत अधिक थी। लेबल किए गए मानकों के साथ मात्रात्मक परख द्वारा प्राप्त मूल्य अलक्षित द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किए गए चरम क्षेत्रों से अनुमानित की तुलना में थोड़ा कम थे, लेकिन अनुमानित वृक्क प्लाज्मा प्रवाह से अभी भी काफी ऊपर हैं। कुल प्लाज्मा सांद्रता के संदर्भ में व्यक्त किए गए इन विलेय के लिए निकासी मूल्य मुक्त एकाग्रता के संदर्भ में व्यक्त किए गए की तुलना में बहुत कम थे और गुर्दे के प्लाज्मा प्रवाह से अधिक नहीं थे।

तालिका 2. एलसी/एमएस/एमएस परख का उपयोग करके प्राप्त निकासी मूल्य

संक्षेपाक्षर:

एलसी / एमएस / एमएस, तरल क्रोमैटोग्राफी / अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री।

मान औसत ± sd क्लीयरेंस/क्लीयरेंसक्रे क्रिएटिनिन क्लीयरेंस के लिए विलेय क्लीयरेंस का औसत अनुपात है। कुल प्लाज्मा स्तर के प्रतिशत के रूप में मुक्त अंश प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट का स्तर है। Clearancetotal वह मान है जो प्राप्त किया जाएगा यदि निकासी की गणना प्लाज्मा-मुक्त सांद्रता के बजाय प्लाज्मा कुल एकाग्रता का उपयोग करके की गई थी।

अतिरिक्त अध्ययनों ने गुर्दे की विफलता वाले रोगियों में संचय की जांच की, जो देशी किडनी द्वारा कुशलता से साफ किए गए पाए गए। जैसा कि तालिका 1 में सारांशित किया गया है, हेमोडायलिसिस रोगियों में उच्च देशी गुर्दे की निकासी दर वाले सभी 13 रासायनिक रूप से पहचाने गए विलेय के मुक्त स्तर को बढ़ाया गया था। ध्यान दें, इनमें से दो विलेय को छोड़कर सभी के लिए, हेमोडायलिसिस रोगियों के प्रीट्रीटमेंट नमूनों में औसत मुक्त सांद्रता 20-सामान्य गुना से अधिक थी, और मुक्त विलेय सांद्रता कुल विलेय सांद्रता से अधिक हो गई। केवल उच्च मूल गुर्दे की मंजूरी वाले सटीक द्रव्यमान मूल्यों की विशेषता वाले अधिकांश विलेय भी हेमोडायलिसिस रोगियों में जमा होते पाए गए, जैसा कि पूरक तालिका S2 ऑनलाइन में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

बहस

मेटाबॉलिक अध्ययन में पाया गया है कि मूत्र में सैकड़ों विलेय होते हैं, जिनमें से अधिकांश की रासायनिक रूप से पहचान की जानी बाकी है। 10., 11., 12। संभवतः, इनमें से अधिकांश विलेय प्लाज्मा से गुर्दे द्वारा साफ किए जाते हैं, और शरीर में उनका संचय होता है। जब गुर्दे का कार्य कम हो जाता है तो यूरेमिक विलेय बीमारी में योगदान दे सकते हैं। वर्तमान में, हालाँकि, हमें इस बात की कम जानकारी है कि इनमें से कौन सा विलेय चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण है। 3, 13।

इस अध्ययन को विलेय की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया था जिसके लिए गुर्दे की निकासी दर सामान्य रूप से बहुत अधिक होती है। विलेय उत्पादन की किसी भी दर के लिए, एक उच्च निकासी शरीर में विलेय स्तर को कम रखने का काम करती है। इस प्रकार हम उच्च निकासी दर वाले उन विलेय के बीच जहरीले अपशिष्ट यौगिकों को खोजने की उम्मीद कर सकते हैं। अलक्षित द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा समयबद्ध मूत्र और प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट नमूनों के विश्लेषण से पता चला कि 90 विशेषताओं की उपस्थिति को गुर्दे के प्लाज्मा प्रवाह से अधिक गुर्दे की निकासी दर के साथ विलेय के अनुरूप होने की संभावना माना जाता है।

ध्यान दें, इन विशेषताओं में से कई के लिए समान द्रव्यमान वाले यौगिकों को मानव मेटाबोलाइट्स की मानक सूची में नहीं पाया जा सकता है। जिन यौगिकों की हम पहचान करने में सक्षम थे उनमें इंडोक्सिल सल्फेट और पी-क्रेसोल सल्फेट शामिल थे। ये यौगिक आंत के जीवाणुओं की क्रिया से निकलते हैं और वृक्क नलिकाओं द्वारा स्रावित होने के लिए जाने जाते हैं। जब गुर्दे विफल हो जाते हैं तो वे प्लाज्मा में जमा हो जाते हैं और हाल ही में यूरेमिक टॉक्सिन्स के रूप में व्यापक विचार प्राप्त हुए हैं। 14।, 15।, 16।, 17। पहचान किए गए अन्य यौगिकों में तीन डाइकारबॉक्सिलिक एसिड, छह एसाइल ग्लाइसिन और दो प्रतिस्थापित प्यूरीन मेटाबोलाइट्स शामिल हैं।

ये सभी पदार्थ पहले मानव मूत्र में पाए गए हैं और हिप्पुरेट, एडिपिक एसिड और सिनामॉयल ग्लाइसिन भी गुर्दे की विफलता वाले रोगियों के प्लाज्मा में जमा होने की सूचना दी गई है (http://www.hmdb.ca).5., 13। , 18. इंडोक्सिल सल्फेट और पी-क्रेसोल सल्फेट की तरह, हिप्पुरेट और 3-हाइड्रॉक्सी हिप्पुरेट को वृक्कीय नलिकाओं द्वारा स्रावित किया जाता है। 9,19 लेकिन जहाँ तक हम खोज सकते हैं, गुर्दे की निकासी की संभावना गुर्दे के प्लाज्मा प्रवाह से अधिक है इनमें से किसी भी विलेय के लिए विचार नहीं किया गया है।

जैसा कि यहां बताया गया है, गुर्दे ट्यूबलर स्राव के संयोजन और प्लाज्मा प्रोटीन के लिए तेजी से प्रतिवर्ती विलेय बंधन के माध्यम से गुर्दे के प्लाज्मा प्रवाह पर निकासी दर प्राप्त कर सकते हैं। विलेय के लिए जो प्लाज्मा तक ही सीमित है और प्रोटीन-बाध्य नहीं है, अधिकतम निकासी वृक्क प्लाज्मा प्रवाह दर के बराबर है। लेकिन बाध्य विलेय के लिए, सक्रिय स्राव ग्लोमेरुली को छोड़ने के बाद पेरिटुबुलर केशिकाओं से गुजरने वाले रक्त में मुक्त प्लाज्मा विलेय की सांद्रता को कम करता है जिससे कि विलेय का बंधा हुआ भाग बाध्यकारी प्रोटीन से अलग हो जाता है और स्राव के लिए उपलब्ध हो जाता है।

यदि ट्यूबलर लुमेन में स्रावी परिवहन की मात्रा पर्याप्त है, तो स्रावित विलेय की मात्रा गुर्दे के प्लाज्मा प्रवाह से अधिक होती है, जो पेरिटुबुलर केशिकाओं में प्रवेश करने वाले प्लाज्मा में मुक्त सांद्रता से गुणा होती है, और निकासी प्लाज्मा प्रवाह दर से ऊपर उठ जाएगी। शुद्ध प्रभाव प्रणालीगत संचलन में अनबाउंड विलेय सांद्रता को निम्न स्तर तक कम करना है, यदि विलेय को गुर्दे से गुजरने वाले प्लाज्मा से पूरी तरह से हटा दिया गया हो, लेकिन प्रोटीन बाध्य नहीं थे।

चूंकि यह विलेय की मुक्त, अनबाउंड सांद्रता है, जिससे पूरे शरीर के ऊतक उजागर होते हैं, प्रोटीन बंधन और ट्यूबलर स्राव का संयोजन विषाक्त अपशिष्ट यौगिकों को हटाने में एक अनुकूली लाभ प्रदान कर सकता है। संक्षेप में, प्रतिवर्ती प्रोटीन को स्राव के लिए बाध्य करने से गुर्दे के रक्त प्रवाह और आकार को बढ़ाए बिना विलेय के मुक्त स्तर को कम करने की अनुमति मिलती है।

बाध्य विलेय की मुक्त प्लाज्मा सांद्रता को बहुत कम स्तर तक कम करने की किडनी की क्षमता को मार्शल20 द्वारा मान्यता दी गई थी, जिसने वृक्क नलिकाओं द्वारा विलेय स्राव का पहला स्पष्ट प्रदर्शन प्रदान किया था। मार्शल ने किसी भी प्राकृतिक विलेय को नहीं मापा, लेकिन फिनोल रेड, एक प्रोटीन-बाध्य डाई के गुर्दे से निपटने के अवलोकन के आधार पर उनकी संभावित उच्च निकासी की परिकल्पना की।

तब से, हालांकि, प्रोटीन बाध्यकारी के संभावित लाभ को गुर्दे की दवा में काफी हद तक नजरअंदाज कर दिया गया है, और बाध्य और साथ ही अनबाउंड अपशिष्ट विलेय के लिए निकासी मूल्यों को अधिक प्रासंगिक मुक्त प्लाज्मा एकाग्रता के बजाय कुल के संदर्भ में व्यक्त किया गया है। हालाँकि, फार्माकोलॉजी साहित्य में मानक अभ्यास भिन्न रहा है। 21 फार्मास्युटिकल एजेंटों के साथ अन्य यौगिकों के साथ, एक बाध्य विलेय का केवल मुक्त भाग जैविक रूप से सक्रिय है, और फार्मास्यूटिकल्स के लिए निकासी दर नियमित रूप से उनके मुक्त प्लाज्मा के संदर्भ में व्यक्त की गई है। सांद्रता। कुल सांद्रता के संदर्भ में गणना से कम मान प्राप्त होते हैं और तालिका 2 और पूरक तालिका S2 ऑनलाइन में प्रकट प्रभावी, मुक्त विलेय स्तर को सीमित करने की शरीर की क्षमता को कम करके आंका जाता है।

गुर्दे की दवा के लिए एक स्पष्ट प्रश्न यह है कि क्या ग्लोमेरुलर निस्पंदन में कमी आने पर स्राव बना रह सकता है। ग्लोमेरुलर रोग के रोगियों में महत्वपूर्ण संख्या में 'ग्लोमेरुलर नलिकाओं' का संचालन जारी रहने की प्रारंभिक रूपात्मक टिप्पणियों पर आधारित आशा बाद के विश्लेषणों से काफी हद तक निराशाजनक थी। 22,23 इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि कार्यात्मक अध्ययनों ने बार-बार प्रदर्शित किया है कि जीएफआर के साथ स्रावी मंजूरी में गिरावट आई है। पारा-अमीनो हिप्पुरेट की निकासी के लिए साक्ष्य सबसे व्यापक है, जिसका लंबे समय तक गुर्दे के प्लाज्मा प्रवाह के माप के रूप में उपयोग किया जाता है।

औसत रूप से, पैरा-एमिनो हिप्पुरेट की निकासी जीएफआर से केवल थोड़ी कम घटती है, व्यक्तिगत रोगियों और विशिष्ट बीमारियों के बीच भिन्नता के साथ। 24,25 जीएफआर के साथ स्रावी निकासी में गिरावट को हिप्पुरेट और { जैसे अंतर्जात कार्बनिक आयनों के लिए भी प्रदर्शित किया गया है। {3}}हाइड्रॉक्सीइंडोलैसेटेट और कई फार्मास्यूटिकल्स जिनमें फ़्यूरोसेमाइड जैसे प्रोटीन-बाध्य यौगिक शामिल हैं। 26।, 27।, 28। अनुमानित जीएफआर के समानांतर कसकर बंधे हुए अंतर्जात विलेय इंडोसिल सल्फेट और पी-क्रेसोल सल्फेट की औसत स्रावी निकासी में समान कमी हाल ही में एक अमूर्त रूप में भी वर्णित किया गया है। 29 क्रोनिक किडनी रोग की प्रगति के रूप में बढ़ती प्लाज्मा सांद्रता इस प्रकार उन यौगिकों को अलग करने की सेवा नहीं करती है जो उन यौगिकों से स्रावित होते हैं जो बड़े पैमाने पर निस्पंदन द्वारा साफ किए जाते हैं। अधिक सूक्ष्म प्रश्न, जैसे कि गुर्दे की बीमारी की प्रगति के दौरान परिवहन अणुओं और परिवर्तित अभिव्यक्ति परिवहन अणुओं के लिए प्रतिस्पर्धा से स्रावित विलेय के स्तर किस हद तक प्रभावित होते हैं, का कम अध्ययन किया गया है।

अलक्षित मास स्पेक्ट्रोमेट्री की एक कमजोरी यह है कि यह सटीक मात्रा प्रदान नहीं करता है। मैट्रिक्स प्रभाव व्यक्तिगत नमूनों से आयन संकेतों की शक्ति को बदलते हैं, विशेष रूप से विभिन्न तरल पदार्थों के नमूनों से। तालिका 1 में निकासी मान, जो मूत्र और प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट के क्रोमैटोग्राम में सापेक्ष शिखर क्षेत्रों पर आधारित हैं, इस प्रकार केवल अनुमानित माना जाना चाहिए। चयनित विलेय की सांद्रता को मापने के लिए अधिक सटीक मात्रात्मक एलसी/एमएस/एमएस परीक्षण विकसित किए गए थे जिसके लिए हम लेबल रहित और आइसोटोपिक रूप से लेबल किए गए दोनों मानकों को प्राप्त करने में सक्षम थे।

इन मापों ने पुष्टि की कि हिप्पुरेट, पी-क्रेसोल सल्फेट और इंडोक्सिल सल्फेट के लिए निकासी अनुमानित गुर्दे के प्लाज्मा प्रवाह से बहुत अधिक थी। उनकी निकासी को फेनिलसेटाइलग्लुटामाइन के साथ विपरीत किया जा सकता है, एक विलेय जो सक्रिय रूप से स्रावित होता है लेकिन काफी हद तक अनबाउंड होता है ताकि इसकी निकासी केवल गुर्दे के प्लाज्मा प्रवाह तक पहुंच सके। इंडोक्सिल सल्फेट, पी-क्रेसोल सल्फेट, 3-हाइड्रॉक्सी हिप्पुरेट, 1,3,7-ट्राईमिथाइल यूरिक एसिड, और 1,7-डाइमिथाइल यूरिक एसिड कार्बनिक आयन ट्रांसपोर्टर द्वारा नियंत्रित किए जाने के लिए जाने जाते हैं गुर्दे के समीपस्थ नलिका में 1 और / या 3, और अन्य विलेय की संरचनाएँ जिन्हें हमने कुशलतापूर्वक एक ही तंत्र द्वारा परिवहन के लिए संभावित उम्मीदवार बनाने के लिए पहचाना। 30।, 31., 32., 33., 34। कौन से ट्रांसपोर्टर संभालते हैं, इसकी पहचान के लिए, सुसंस्कृत कोशिकाओं या जानवरों में अध्ययन की आवश्यकता होगी जिसमें ट्रांसपोर्टर गतिविधि को आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया गया है।

गुर्दे की विफलता वाले रोगियों में उच्च स्तर की खोज से पुष्टि होती है कि गुर्दे द्वारा अलग-अलग विलेय को साफ किया जाता है। जिन यौगिकों की हमने गुर्दे के प्लाज्मा प्रवाह की तुलना में देशी गुर्दे की निकासी के रूप में पहचान की है, उनमें हिप्पुरेट, पी-क्रेसोल सल्फेट, इंडोक्सिल सल्फेट, एडिपिक एसिड और सिनामोयल ग्लाइसिन की कुल प्लाज्मा सांद्रता पहले गुर्दे की विफलता वाले रोगियों में उच्च होने की सूचना दी गई है। .5., 13., 18. यह अध्ययन आगे दिखाता है कि देशी किडनी द्वारा कुशलता से साफ किए गए बाध्य विलेय का मुक्त स्तर हेमोडायलिसिस पर बनाए गए रोगियों में उच्च स्तर तक बढ़ सकता है जो निष्क्रिय प्रसार द्वारा निकासी प्रदान करता है।

जिन 13 यौगिकों की पहचान हमने उच्च देशी किडनी क्लीयरेंस के रूप में की है, उनमें से दो को छोड़कर सभी के लिए मुक्त स्तर हेमोडायलिसिस रोगियों में सामान्य से 20-गुना अधिक था। अपवाद, 1,3,7-ट्राइमिथाइल यूरिक एसिड, और 1,7-डाइमिथाइल यूरिक एसिड कैफीन मेटाबोलाइट्स हैं। 35 हमारे सभी सामान्य विषय कॉफी या चाय पीने वाले थे, जबकि हेमोडायलिसिस रोगियों में सेवन था एक व्यक्ति में एक कप चाय तक सीमित। उत्पादन में अंतर के अलावा, गैर गुर्दे की निकासी और अलग-अलग विलेय के वितरण की मात्रा उस डिग्री को प्रभावित कर सकती है जिससे डायलिसिस रोगियों में उनका स्तर ऊंचा हो जाता है।

कई सीमाओं को स्वीकार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, उच्च वृक्कीय निकासी दर वाले विलेय के अनुरूप सुविधाओं की हमारी सूची निस्संदेह अधूरी है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचानी जाने वाली विशेषताओं की संख्या तब बढ़ जाती है जब नमूनों को कई क्रोमैटोग्राफिक और आयनीकरण विधियों का उपयोग करके परख लिया जाता है। 11।, 12।, 36।, 37। दूसरा, वर्तमान दृष्टिकोण ऐसे यौगिकों की पहचान करने में विफल होगा जिन्हें कुशलता से हटा दिया गया है। प्लाज्मा से लेकिन तब या तो गुर्दे में खराब हो गए थे या मूत्र में उत्सर्जन से पहले बदल गए थे। अंत में, हमने गुर्दे में उत्पादन के बाद मूत्र में उत्सर्जित होने वाले पदार्थों के लिए गलत तरीके से उच्च निकासी मूल्यों की गणना की हो सकती है।

सारांश में, इस अध्ययन से पता चलता है कि ट्यूबलर स्राव के साथ प्रोटीन बंधन का संयोजन गुर्दे को गुर्दे के प्लाज्मा प्रवाह से अधिक दरों पर अपशिष्ट विलेय को साफ करने की अनुमति देता है। और यह बताता है कि बड़ी संख्या में प्राकृतिक विलेय के लिए ऐसी उच्च निकासी दर प्राप्त की जाती है, जिनमें से कई की रासायनिक रूप से पहचान की जानी बाकी है। गुर्दे द्वारा कुशलतापूर्वक साफ किए गए विलेय समूह के आगे के विश्लेषण से इन यूरेमिक विषाक्त पदार्थों की पहचान का मार्ग मिल सकता है।

सामग्री और तरीके

एक सामान्य गुर्दे समारोह के साथ पांच विषयों में रात भर के उपवास के बाद समयबद्ध मूत्र संग्रह के मध्य बिंदु पर रक्त के नमूने प्राप्त किए गए थे, जिनकी विशेषताओं को पूरक तालिका S1 ऑनलाइन में नोट किया गया है। अध्ययन हेलसिंकी सिद्धांतों की घोषणा द्वारा किया गया। प्लाज्मा को मेथनॉल (1: 3 वॉल्यूम: वॉल्यूम) के साथ डीप्रोटिनाइज़ किया गया था, सुखाया गया, और 90:10 वॉल्यूम में पुनर्गठित किया गया: वॉल्यूम पानी / एसीटोनिट्राइल को मूल सांद्रता से आधा करने के लिए। Ultrafiltrate Nanosep 30K ओमेगा सेपरेटर्स (Pall, Ann Arbor, MI) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, सुखाया गया, और 90:10 पानी / एसीटोनिट्राइल में मूल सांद्रता से पांच गुना तक पुनर्गठित किया गया। विलेय सांद्रता प्रदान करने के लिए मूत्र को पानी से पतला किया गया था जो कि 100 मिली / मिनट के मूत्र प्रवाह में पाया जाएगा, सूख गया, और 90:10 पानी / एसीटोनिट्राइल में पुनर्गठित होकर पतला नमूने की दोगुनी सांद्रता हो गई।

पूरक तालिका 1।

क्रोमैटोग्राफी एक ACQUITY UPLC सिस्टम (वाटर्स, मिलफोर्ड, MA) पर की गई थी। प्रत्येक नमूने में, 1 0 उल को काइनेटेक्स एक्सबी-सी 18 150 × 2.1 मिमी, 1.7 माइक्रोन कण आकार स्तंभ (फेनोमेनेक्स, टोरेंस, सीए) में लोड किया गया था, जिसे 4 {{1 {{12} पर बनाए रखा गया था। }}} डिग्री । पानी (ए) में 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड और एसिटोनिट्राइल (बी) में 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड का उपयोग करके मोबाइल चरण प्रवाह 0.4 मिली / मिनट था, 9 मिनट में 3 प्रतिशत बी से 25 प्रतिशत बी तक ढाल के साथ, 25 प्रतिशत बी से 100 प्रतिशत B से 15 मिनट, शेष 100 प्रतिशत B से 19 मिनट तक और 3 प्रतिशत B से 21 मिनट पर वापस आना। एमएस को एक एक्सएक्टिव ऑर्बिट्रप मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर, सैन जोस, सीए) पर एम/जेड 70 से 800 की रेंज में 50, 000 पर इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) का उपयोग करके आधे अधिकतम रिज़ॉल्यूशन पर पूरी चौड़ाई में एकत्र किया गया था। ) एक गर्म जांच (400 डिग्री) के साथ। MS को m/z 138-1922 मास रेंज में एक मानक LTQ (लीनियर ट्रैप क्वाड्रुपोल) ESI-पॉजिटिव आयन कैलिब्रेशन सॉल्यूशन (पियर्स, रॉकफोर्ड, IL) का उपयोग करके पॉजिटिव मोड में कैलिब्रेट किया गया था। नकारात्मक आयन अंशांकन को मानक एलटीक्यू ईएसआई-नकारात्मक आयन अंशांकन समाधान के एम/जेड 265-1980 मास रेंज से एम/जेड 97 तक नीचे बढ़ाया गया था, इसे 3.3 यूजी/एमएल पर पी-क्रेसोल सल्फेट और इंडोक्सिल सल्फेट के साथ फैलाया गया था, जो एम/जेड 96.9601 (सल्फेट टुकड़ा), एम/जेड 187.0070 (पी-क्रेसोल सल्फेट), और एम/जेड 212.0023 (इंडॉक्सिल सल्फेट) के अतिरिक्त अंशांकन आयन उत्पन्न हुए।

अंशांकन मिश्रण के संशोधन का उद्देश्य मूत्र में उत्सर्जित बहुसंख्यक विलेय की द्रव्यमान सीमा में उप 1 पीपीएम सटीकता की अनुमति देना था और इस तरह संभावित तात्विक रचनाओं की संख्या में कमी आई। साधन बहाव के प्रभावों को कम करने के लिए, प्रत्येक विषय के नमूने तीन प्रतियों में एक साथ चलाए गए, और सभी विषयों के नमूने पहले नकारात्मक और फिर सकारात्मक मोड में चलाए गए।

MZmine सॉफ्टवेयर v2.2 (ओकिनावा इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी, ओकिनावा, जापान) का उपयोग प्रत्येक LC/MS रन से प्रतिधारण समय और m/z की विशेषताओं की पहचान करने और आयन के एकीकरण के आधार पर इन सुविधाओं को एम्पलीट्यूड असाइन करने के लिए किया गया था। वर्तमान मान .38 क्योंकि हमारा लक्ष्य किडनी द्वारा साफ किए गए विलेय की पहचान करना था, विश्लेषण को 754 नकारात्मक आयन और 1054 सकारात्मक आयन सुविधाओं तक सीमित कर दिया गया था, जिसमें औसत शिखर क्षेत्र 4000 से अधिक था, कम से कम तीन के प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट में तीन प्रतियों में चलता था। पाँच विषयों में और कम से कम पाँच विषयों में से तीन के मूत्र में भी। इन 1808 सुविधाओं के लिए निकासी दरों का अनुमान मूत्र और प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट में क्रिएटिनिन की सांद्रता की तुलना करके लगाया गया था।

1808 सुविधाओं में से 1082 के लिए, अनुमानित निकासी दर क्यू की झूठी खोज दर के साथ क्रिएटिनिन निकासी से अधिक थी<0.05. This was considered evidence of tubular secretion. Chromatograms for 163 of the 1082 secreted features with clearance values more than sevenfold the creatinine clearance were examined manually. The cutoff of sevenfold was chosen to be well above the renal plasma flow, which is approximately fourfold the creatinine clearance and to include the feature identified as p-cresol sulfate for which a deuterated standard was available, allowing its high renal clearance to be confirmed by a more quantitative assay (below). Elimination of duplicates when features appeared in both positive and negative mode and of features considered to represent dimers, adducts, isotopes, or artifacts on manual review reduced the total number of features with estimated clearance rates greater than sevenfold the creatinine clearance to 90 as summarized in Supplementary Table S2 online. Compounds with m/z values corresponding to these features were identified using the Human Metabolome and Metlin Databases (http://www.hmdb.ca and http://metlin.scripps.edu/) and chemical standards were obtained as further summarized in Supplementary Table S2 online. 

रासायनिक पहचान की पुष्टि करने के लिए, नकारात्मक मोड के साथ प्रदर्शित होने वाली सुविधाओं के लिए और सकारात्मक के साथ प्रदर्शित होने वाली सुविधाओं के लिए एलटीक्यू एक्सएल आयन ट्रैप (थर्मो फिशर) के लिए एलटीक्यू ऑर्बिट्रैप वेलोस (थर्मो फिशर) के लिए एक ही एलसी विधि का उपयोग करके चयनित मूत्र के नमूने और रासायनिक मानकों को चलाया गया था। तरीका। रासायनिक पहचान प्रतिधारण समय, सिद्धांत आयन द्रव्यमान और एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम (अनुपूरक तालिका S3 ऑनलाइन) के एक मैच द्वारा स्थापित की गई थी। 13 रासायनिक रूप से पहचानी गई विशेषताओं में से, MZmine द्वारा निकाली गई चोटियों को सौंपी गई द्रव्यमान त्रुटि का औसत परिमाण 0.5±0.5 पीपीएम था, जो इस विश्वास को प्रोत्साहित करता है कि अज्ञात विशेषताओं को सही द्रव्यमान मान निर्दिष्ट किए गए थे। पूरक तालिका S2 ऑनलाइन में सूचीबद्ध।

पूरक तालिका 3।

छह हेमोडायलिसिस रोगियों और छह सामान्य विषयों से प्रीट्रीटमेंट प्लाज्मा जिनकी विशेषताओं को सप्लीमेंट्री टेबल S1 ऑनलाइन में संक्षेपित किया गया है, उनका भी उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया था जैसा कि ऊपर वर्णित है। प्लाज्मा को 90:10 वॉल्यूम: वॉल्यूम पानी / एसीटोनिट्रिल में डायलिसिस रोगियों के लिए मूल एकाग्रता और सामान्य विषयों के लिए मूल एकाग्रता में एक-चौथाई में डीप्रोटिनाइज्ड, सुखाया और पुनर्गठित किया गया था। डायलिसिस रोगियों के लिए मूल एकाग्रता के लिए 90:10 पानी / एसीटोनिट्रिल में अल्ट्राफिल्ट्रेट का पुनर्गठन किया गया था और सामान्य विषयों के लिए मूल एकाग्रता दस गुना थी। MZmine सॉफ्टवेयर के साथ प्राप्त प्लाज्मा और अल्ट्राफिल्ट्रेट के लिए पीक क्षेत्र औसत के मूल्यों को छोड़कर औसत थे<4000 in duplicate runs of each sample. Peaks corresponding to solutes previously identified as having very high renal clearance values were identified by matching retention time and mass. Peaks corresponding to the 13 chemically identified features were reintegrated manually using Xcalibur Software (Thermo Fisher).

सामान्य नमूनों में p-cresol सल्फेट, इंडोक्सिल सल्फेट, हिप्पुरेट, और फेनिलसेटाइलग्लूटामाइन की सांद्रता को p-cresol-d 8- सल्फेट (p-cresol d8 से संश्लेषित; 39 कैम्ब्रिज समस्थानिक), इंडोक्सिल-2,4,5,6,7-डी5-सल्फेट (आइसोसाइंसेज), और एन-बेंज़ॉयल-डी5-ग्लाइसिन और एन -( आंतरिक मानकों के रूप में फिनाइल-डी 5-एसिटाइल)-एल-ग्लूटामाइन (दोनों सी/डी/एन आइसोटोप्स, पोइंटे-क्लेयर, क्यूबेक, कनाडा से)। तैयारी समान थी, सिवाय इसके कि सूखे नमूनों को पानी में पुनर्गठित किया गया था, जो कि अलक्षित विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली सांद्रता से दोगुना था।

प्रत्येक नमूने में, 1 0 उल को काइनटेक्स सी 18 150 × 2.1 मिमी, 1.7 माइक्रोन कण आकार के स्तंभ को 3 0 डिग्री पर बनाए रखा गया था। पानी (A) में 10 mmol/l अमोनियम फॉर्मेट और मेथनॉल (B) में 10 mmol/l अमोनियम फॉर्मेट का उपयोग करके बफर प्रवाह को 0.35 मिली/मिनट पर सेट किया गया था। 1 मिनट के लिए 5 प्रतिशत बी, 5 प्रतिशत बी से 30 प्रतिशत बी से 6 मिनट, तेजी से 90 प्रतिशत बी से 8.5 मिनट और फिर 5 प्रतिशत बी से 13.5 मिनट तक। एमएस को नकारात्मक मोड (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए) में ईएसआई के साथ एगिलेंट 6430 ट्रिपल क्वाड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर पर प्रदर्शित किया गया था। निर्माता के सॉफ़्टवेयर (MassHunter Quant, Agilent Technologies) का उपयोग करके विलेय सांद्रता की गणना की गई। क्वांटिटेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले आयन ट्रांज़िशन m/z 187.0→107.0 p-cresol सल्फेट के लिए थे, m/z 212.0→80.0 इंडोक्सिल सल्फेट के लिए, m/z 178.1→134.2 हिप्पुरेट के लिए, और m/z 263.2→145.1 फेनिलसेटाइलग्लूटामाइन के लिए संबंधित संक्रमण के साथ बिगड़े हुए आंतरिक मानक। पी-क्रेसोल सल्फेट, इंडोक्सिल सल्फेट, हिपपुरेट, और फेनिलसेटाइलग्लुटामाइन के लिए रिकवरी 100±4, 114±6, 93±3, और 105±3 प्रतिशत प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट में जोड़े गए अभिकर्मकों के लिए, 93±7, 108±25, 107±6 थी , और 95±4 प्रतिशत अभिकर्मकों के लिए प्लाज्मा में जोड़ा गया, और 91±17, 105±12, 95±15, और 102±14 प्रतिशत अभिकर्मकों के लिए मूत्र में जोड़ा गया ताकि प्रयोगात्मक विषयों में पाए जाने वाले सांद्रता को प्राप्त किया जा सके। क्लिनिकल प्रयोगशाला में क्रिएटिनिन और यूरिया की परख की गई।

आंकड़े

एसएएस एंटरप्राइज़ गाइड 4.3 का उपयोग करते हुए विलकॉक्सन साइन-रैंक टेस्ट द्वारा मूत्र और प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट में पाई गई 1808 सुविधाओं के लिए क्लीयरेंस दरों की तुलना प्रत्येक विषय में क्रिएटिनिन क्लीयरेंस दरों के साथ की गई थी और हेमोडायलिसिस रोगियों और सामान्य विषयों के मूल्यों के बीच अनपेक्षित तुलना मान का उपयोग करके की गई थी। –व्हिटनी यू-परीक्षण SPSS V20 का उपयोग कर। फिर Q-VALUE का उपयोग करके गलत खोज दरों की गणना की गई।

आभार

हम कैलिफोर्निया पॉलिटेक्निक स्टेट यूनिवर्सिटी, सैन लुइस ओबिस्पो, सीए, यूएसए के डॉ. एंड्रेस मार्टिनेज को ड्यूटेरेटेड पी-क्रेसोल सल्फेट के संश्लेषण के लिए, स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय में विन्सेंट कोट्स फाउंडेशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगशाला के कर्मचारियों को विश्लेषण में सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं, और स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी की डॉ. जेनी शेन को आंकड़ों में मदद के लिए। टीएलएस को यूरेमिया के अध्ययन के लिए मित्सुबिशी तानबे फार्मा कॉरपोरेशन एनकेएफ फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। NIH (R21DK84439 और RO1 DK80123 से TWM और RO1 DK80123 से THH) द्वारा एक और सहायता प्रदान की गई।

पूरक सामग्री

तालिका S1। सामान्य विषयों और हेमोडायलिसिस रोगियों के लक्षण।

तालिका S2। मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विशेषताएं संभावित रूप से गुर्दे द्वारा साफ किए गए विलेय और हेमोडायलिसिस रोगियों में उनके संचय का प्रतिनिधित्व करती हैं।

तालिका S3। टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS/MS) सुविधाओं की रासायनिक रूप से पहचाने गए विलेय के रूप में किडनी द्वारा कुशलतापूर्वक साफ किया जाता है।

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

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