जन्मजात हृदय रोग में न्यूरोप्रोटेक्शन की वर्तमान स्थिति भाग 3

3.2. एक्टोपिक माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए का अर्ध-मात्रात्मक मूल्यांकन

Hsp60 धुंधलापन (माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स) और हिस्टोन-H2B धुंधलापन (न्यूक्लियर मार्कर) की छवियों को dsDNA धुंधलापन की छवियों से घटाया गया। फिर, lmage] सॉफ़्टवेयर (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ़ हेल्थ) के "एडजस्टथ्रेशोल्ड" फ़ंक्शन का उपयोग करके, छवियों को बाइनरीकृत किया गया।

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिकाओं में ऊर्जा कारखाने हैं, जो कोशिकाओं द्वारा आवश्यक ऊर्जा प्रदान करने के लिए एटीपी को संश्लेषित करने के लिए जिम्मेदार हैं। माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स माइटोकॉन्ड्रिया का आंतरिक तरल है, जिसमें विभिन्न प्रकार के एंजाइम और आयन होते हैं और यह माइटोकॉन्ड्रिया की विभिन्न जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए एक महत्वपूर्ण स्थल है। स्मृति मनुष्य की सबसे महत्वपूर्ण संज्ञानात्मक क्षमताओं में से एक है। हालाँकि दोनों असंबंधित लग सकते हैं, लेकिन वे निकट से संबंधित हैं।

शोध से पता चलता है कि माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स और मेमोरी के बीच एक अंतःक्रिया होती है। माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में एंजाइम और आयन सीधे न्यूरॉन्स की उत्तेजना को प्रभावित कर सकते हैं, जिससे न्यूरोनल कोशिकाओं में ऊर्जा चयापचय और आयन चैनल की स्थिति नियंत्रित होती है, जिससे मेमोरी प्रभावित होती है। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में कई तरह के सिग्नलिंग अणु होते हैं, जिन्हें न्यूरॉन्स के अक्षतंतुओं और सिनेप्स के माध्यम से डाउनस्ट्रीम न्यूरॉन्स तक पहुँचाया जा सकता है, जिससे न्यूरॉन्स की सिग्नल ट्रांसडक्शन दक्षता प्रभावित होती है, जिससे मेमोरी का निर्माण और समेकन प्रभावित होता है।

साथ ही, स्मृति गतिविधि भी माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स की स्थिति को सीधे प्रभावित करती है। स्मृति गतिविधियाँ न्यूरॉन्स की ऊर्जा खपत को बढ़ाएंगी और माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में रेडॉक्स प्रतिक्रिया को बढ़ावा देंगी, जिससे माइटोकॉन्ड्रिया के चयापचय स्तर और इंट्रासेल्युलर आयन संतुलन पर असर पड़ेगा, जिससे न्यूरॉन्स की उत्तेजना और सिग्नल ट्रांसडक्शन दक्षता पर असर पड़ेगा।

इसलिए, अच्छी याददाश्त बनाए रखने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। अच्छी जीवनशैली की आदतों को बनाए रखने से, जैसे कि नियमित आहार, मध्यम व्यायाम, पर्याप्त नींद, आदि, आप माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स के स्वास्थ्य को बनाए रखने में मदद कर सकते हैं। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स के भीतर जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं और सिग्नलिंग को बढ़ावा देने के लिए उचित दवा हस्तक्षेप के माध्यम से स्मृति समारोह को भी बढ़ाया जा सकता है।

दैनिक जीवन में, हम कई तरीकों से याददाश्त का अभ्यास कर सकते हैं, जैसे पढ़ना, अध्ययन करना, सोचना, खेलना आदि। साथ ही, हमें माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स के स्वास्थ्य को बेहतर बनाए रखने के लिए अच्छे स्वास्थ्य को बनाए रखने पर भी ध्यान देना चाहिए। मेरा मानना ​​​​है कि इन प्रयासों के माध्यम से, हमारे पास निश्चित रूप से बेहतर याददाश्त होगी और जीवन और काम में विभिन्न चुनौतियों का बेहतर तरीके से सामना करना पड़ेगा। यह देखा जा सकता है कि हमें याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टांच डेजर्टिकोला याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है, क्योंकि सिस्टांच डेजर्टिकोला न्यूरोट्रांसमीटर के संतुलन को भी नियंत्रित कर सकता है, जैसे कि एसिटाइलकोलाइन और विकास कारकों के स्तर को बढ़ाना। ये पदार्थ याददाश्त और सीखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, सिस्टांच डेजर्टिकोला रक्त प्रवाह में भी सुधार कर सकता है और ऑक्सीजन वितरण को बढ़ावा दे सकता है, जो यह सुनिश्चित कर सकता है कि मस्तिष्क को पर्याप्त पोषक तत्व और ऊर्जा प्राप्त हो, जिससे मस्तिष्क की जीवन शक्ति और धीरज में सुधार हो।

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हमने "विश्लेषण-कणों का विश्लेषण" फ़ंक्शन का उपयोग करके 2 से 20 माइक्रोन' (गोलाकारता 0.1-1.0) आकार वाले डीएसडीएनए पंक्टा का चयन किया। यदि आवश्यक हो, तो अंतिम गणना के लिए मूल छवियों की जांच की गई। यदि हिस्टोन H2B का संकेत छोटा था। तो घटाए गए चित्रों में डोनट जैसी संरचनाएं दिखाई दीं।

ये परमाणु मूल के साइटोसोलिक डीएसडीएनए का प्रतिनिधित्व करते हैं और इन्हें माइटोकॉन्ड्रियल मूल के साइटोसोलिक डीएसडीएनए की मात्रा से हटा दिया जाना चाहिए। आकार की सीमा को कोशिका के प्रकार या हिस्टोलॉजिकल नमूनों की उत्पत्ति के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। चित्र lE एक्टोपिक माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की गिनती का एक उदाहरण दिखाता है

1B D का उपयोग करके डॉट्स.

वैकल्पिक रूप से, Hsp60 धुंधलापन की छवियों को dsDNA धुंधलापन की छवियों से घटाया गया। फिर, "एडजस्ट-थ्रेशोल्ड" एनालाइज़-एनालाइज़ पार्टिकल्स "फ़ंक्शन का उपयोग करके dsDNA पंक्टा की संख्या की गणना की गई। इसके बाद, हिस्टोन-H2B सिग्नल के बिना dsDNA पंक्टा को प्रत्यक्ष अवलोकन द्वारा गिना गया। बाद वाली विधि तब उपयुक्त होती है जब हिस्टोन-H2B छवियाँ कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात दिखाती हैं।

कुल मिलाकर, यह विधि कोशिका द्रव्य में लीक होने वाले एक्टोपिक माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए को स्पष्ट रूप से दिखा सकती है और कोशिकाओं में ऐसे एक्टोपिक माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए का वस्तुपरक और सांख्यिकीय मूल्यांकन करने की अनुमति देती है।

4। चर्चा

हमारे अध्ययन में, हमने एक ऐसी विधि विकसित की है जो साइटोप्लाज्मिक माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की गिनती करने में सक्षम है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीकों का उपयोग करके साइटोप्लाज्मिक माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए का पता लगाने की रिपोर्ट की गई है, लेकिन अधिकांश मामलों में साइटोप्लाज्मिक माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के मूल्यांकन के लिए ये विधियाँ मात्रात्मक नहीं थीं [15,25]। एक अन्य अध्ययन में, परिसंचारी माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए ड्रॉपलेट पीसीआर का संचालन किया गया [9]।

हाल ही में, सातो एट अल. [26,27] ने लैमिन बी1 (एलएमएनबी1) एंटीबॉडी को न्यूक्लियर स्ट्रक्चर मार्कर के रूप में और साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज सबयूनिट 4 (सीओएक्स4) को माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रक्चर मार्कर के रूप में इस्तेमाल करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा साइटोप्लाज्मिक डीएनए का मूल्यांकन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रोटोकॉल प्रकाशित किया। यह प्रोटोकॉल न्यूक्लियर मूल के साइटोप्लाज्मिक डीएसडीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए बहुत उपयोगी लगता है।

हालांकि, जब हमने COX4 या अन्य माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली मार्करों का उपयोग किया, जिसमें आंतरिक और बाहरी दोनों मार्कर शामिल थे, तो माइटोकॉन्ड्रिया से कोशिकाद्रव्य को ठीक से पहचानना बहुत कठिन था।

उदाहरण के लिए, यदि हमने माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली मार्कर का उपयोग करके गोलाकार संकेतों को देखा और उसके भीतर dsDNA संकेतों को देखा, तो यह dsDNA गोलाकार माइटोकॉन्ड्रिया (सामान्य) के अंदर माइटोकॉन्ड्रियल DNA या डोनट-जैसे माइटोकॉन्ड्रिया (एक्टोपिक) के बाहर साइटोप्लाज़मिक माइटोकॉन्ड्रियल DNA का प्रतिनिधित्व कर सकता है। इस प्रकार हमने साइटोप्लाज्म में एक्टोपिक माइटोकॉन्ड्रियल DNA का मूल्यांकन करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स को लेबल करने वाले मार्कर के रूप में Hsp60 का उपयोग किया।

जैसा कि हाल ही में एक समीक्षा [23] में वर्णित है, परमाणु मूल के कई अलग-अलग प्रकार के साइटोप्लाज्मिक डीएनए हैं, और उनमें से अधिकांश हिस्टोन मार्करों के लिए सकारात्मक हैं। ट्रिपल स्टेनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के संयोजन की सीमा के कारण, हमने हिस्टोन मार्कर के रूप में हिस्टोन H2Ba का उपयोग किया।

हालाँकि, यदि यह सीमा हल हो जाती है, तो H2AX परमाणु मूल के साइटोप्लाज्मिक dsDNA के लिए बेहतर मार्कर हो सकता है। इस अध्ययन में उपयोग की गई नियंत्रण हेला कोशिकाओं में हिस्टोन-H2B-नकारात्मक साइटोप्लाज्मिक dsDNA शायद ही कभी देखा गया था, लेकिन यदि अन्य कोशिका रेखाएँ या स्थितियाँ उपयोग की जाती हैं, तो परमाणु मूल के ऐसे dsDNA मौजूद हो सकते हैं।

हमारे हालिया पेपर में उपयोग किए गए माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए का इन-सीटू हाइब्रिडाइजेशन गुणात्मक मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है, लेकिन मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए इन-सीटू हाइब्रिडाइजेशन का उपयोग करना मुश्किल हो सकता है [8]।

इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन में नमूने को उच्च तापमान के संपर्क में लाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप नमूने के कुछ हिस्सों में विकृति या शोर हो सकता है। दूसरी ओर, इस पेपर में प्रस्तुत इम्यूनोसाइटोकेमिकल विधि कम पृष्ठभूमि शोर के साथ संकेत प्राप्त कर सकती है। हमारे हालिया पेपर में, पार्किंसंस रोग मॉडल के रूप में इस्तेमाल की गई मानव कोशिकाओं और ज़ेब्राफ़िश में, हमने दिखाया कि माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए साइटोप्लाज्म में लीक हो गया था, जो कोशिकाओं के लिए विषाक्त है। हमने यह भी देखा कि पार्किंसंस रोग से पीड़ित रोगियों के पोस्ट-मॉर्टम मस्तिष्क के ऊतकों में साइटोसोलिक माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की मात्रा बढ़ गई थी [8]।

साक्ष्य की ये पंक्तियाँ बताती हैं कि माइटोकॉन्ड्रिया से लीक हुए एक्टोपिक माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की बढ़ी हुई मात्रा तीव्र और पुरानी सूजन को प्रेरित कर सकती है, जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न बीमारियाँ हो सकती हैं, जिनमें पार्किंसंस रोग और दिल की विफलता शामिल है; इस प्रकार, साइटोसोलिक-डीएनए क्षरण का अपरेगुलेशन या इसके सेंसर का अवरोध इन बीमारियों के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य हो सकता है [8,28]।

एक्टोपिक माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए इस पत्र में प्रस्तुत विधि इस क्षेत्र में आगे के अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में कार्य करती है।

लेखक योगदान: एचएम और एमटीएच ने परिकल्पना तैयार की, अधिकांश प्रयोगों को डिजाइन किया, प्रयोग किए, डेटा का विश्लेषण किया और पांडुलिपि लिखी। एनएम ने संवर्धित कोशिकाओं से संबंधित प्रयोग किए। सभी लेखकों ने पांडुलिपि के प्रकाशित संस्करण को पढ़ा और उससे सहमत हैं।

वित्तपोषण: यह कार्य AMED (अनुदान संख्या JP21gm6110028 और JP19dm0107154 (HM)), टेकेडा साइंस फाउंडेशन (HM), JSPS KAKENHI (अनुदान संख्या JP14516799 (HM), JP 16690735 (HM), और JP 17925674 (HM)), JST (मूनशॉट R&D; अनुदान संख्या JPMJMS2024 (HM)), और TBRF (अनुदान संख्या TBRF-RF 21-135 (HM)) से सहायता प्राप्त अनुदान द्वारा समर्थित था।

डेटा उपलब्धता विवरण: इस पांडुलिपि में वर्णित डेटा और उपकरण अनुरोध पर उपलब्ध हैं।

आभार: हम शिनानो कोबायाशी को उपयोगी चर्चाओं में भाग लेने और निरंतर समर्थन प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम टोक्यो बायोकेमिकल रिसर्च फाउंडेशन (TBRF) को MH (TBRF-RF 21-135) में विदेशी शोधकर्ताओं के लिए TBRF पोस्टडॉक्टरल फ़ेलोशिप प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं।

हितों का टकराव: लेखक किसी भी प्रकार के हितों के टकराव की बात नहीं कहते हैं।

संदर्भ

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